细胞衰老促进化疗的不利影响和癌症复发

炎症、骨髓恢复和心脏功能

急性和慢性炎症反应是许多抗癌化疗取得有益效果的主要障碍(21). 事实上，化疗诱导的细胞因子和趋化因子的高局部和全身水平与药物的短期、中期和长期副作用有关。

由于多索和紫杉醇产生的衰老细胞激活了SASP，其中包括炎症因子，因此我们研究了这些细胞对多索治疗的p16-3MR小鼠的影响。衰老p16^INK4a公司-更昔洛韦（GCV）可选择性清除p16-3MR小鼠的阳性细胞；3MR的tTK部分磷酸化GCV，将其转化为有毒的DNA代谢物，与线粒体DNA结合，通过凋亡杀死细胞(15). 我们用Doxo治疗p16-3MR小鼠，5天后再进行GCV治疗。GCV显著降低生物发光和第16页^INK4a公司在Doxo治疗的动物中(图2A-B和图S4A). GCV还减少了具有DNA损伤病灶的细胞数量(图2C和S4B系列). 正如预期的那样，多克索增加了与多克索治疗的p16-3MR小鼠肺部炎症相关的SASP因子基因的表达(图2B)，其中许多（但不是全部）在GCV治疗7天后下降(图2B). 因此，去除衰老细胞足以减少组织中许多多索诱导的炎性细胞因子和趋化因子。不受GCV影响的分泌因子可能是由p21表达的⁺/第16页^INK4a−或可能独立于衰老。我们还检测到多索治疗后血清中细胞因子IL-6和趋化因子Cxcl-1的水平显著升高，GCV可降低这些水平(图2D–E). 正如预期的那样，与经载体处理的细胞相比，经Doxo处理的MEF也分泌较高水平的IL-6和Cxcl-1(图S4C–D).

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图2

衰老相关炎症、骨髓抑制和心脏功能障碍

对照组或Doxo-（10 mg/kg）治疗的p16-3MR雄性小鼠给予溶媒（PBS）或25 mg/kg更昔洛韦（GCV），持续5天（每天腹腔注射）。（A） 给小鼠注射注射了注射用库伦他嗪，并使用氙气成像系统监测其发光情况。（B） 肺部分离RNA的定量实时PCR（qRT-PCR）分析。编码所示蛋白质的mRNA水平相对于微管蛋白（对照）mRNA进行量化。虚线表示对照小鼠的表达水平，每种蛋白质设置为1。N=5。A.U.=任意单位。（C） 肺部用石蜡固定，并进行γH2AX染色。蓝色DAPI染色细胞核；绿色，γH2AX免疫染色。用ELISA法测定血清（D–E）IL-6（D）和Cxcl-1（E）水平。N=4。（F–H）最后一次注射PBS或GCV后3天从小鼠骨髓细胞（BMC）中获取的粒细胞、单核细胞（F）、集落形成单位-粒细胞、红细胞、单体细胞、巨核细胞（G）和2周鹅卵石区域形成细胞（H）的集落形成单元数量，分别通过集落形成细胞和鹅卵石面积形成细胞分析测定。N=3。Doxo治疗4周后，对小鼠进行（I–K）二维经胸超声心动图检查。图表显示了缩短分数（I）、射血分数（J）和心跳（K）的测量结果。N=10。bpm=每分钟心跳次数。数据为平均值±SEM*p<0.05**p<0.01***p<0.001。

急性和慢性炎症反应通常是由于化疗后免疫系统受损所致。实际上，骨髓抑制是这些疗法耐受性和有效性的主要限制因素。为了确定Doxo治疗小鼠的炎症指标是否部分归因于骨髓抑制，我们测定了雌性小鼠治疗后骨髓细胞（BMC）的数量和分布。Doxo治疗2周后，BMC总数略有下降，但没有显著下降，GCV消除衰老细胞后，BMCs总数有所恢复(图S5A). 我们检测到Sca1的百分比没有差异⁺c试剂盒⁺（LSK）细胞，造血干细胞（HSC；CD150⁺CD48型⁻LSK细胞）和造血祖细胞（HPC；，谱系⁻Sca1类⁻c试剂盒⁺细胞），表明我们使用的Doxo方案不会影响BM-HSC和HPC的数量或比率(图S5B–D). 此外，我们观察到血细胞计数没有显著差异，这表明我们使用的Doxo方案仅诱导轻度和短暂的骨髓抑制（未显示）。

我们还通过克隆形成分析测定了HPC功能。引人注目的是，多索治疗显著减少了集落形成单位（CFU）-GEMM（粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞）和CFU-GM（粒细胞，单核细胞）细胞的数量，但在GCV消除衰老细胞后，这些细胞的数量得到了挽救(图2F–G). 这一发现得到了为期2周的鹅卵石区域形成细胞（CAFC）检测的证实，该检测用于测量HPC的功能。从Doxo处理过的动物分离的BMC中，2周CAFC的数量显著减少，但从消除了衰老细胞的动物中没有(图2H).

对患者使用Doxo剂量的一个主要限制是心脏毒性，这主要是由于左心室壁增厚所致(22). 重要的是，我们模型中使用的Doxo剂量足以诱导心脏细胞衰老，这是通过诱导第16页^INK4a公司和p21蛋白表达式(图S6A–C). 有趣的是，大多数心脏衰老细胞是CD31⁺内皮细胞和成纤维细胞样细胞，但不包括心肌细胞(图S6D–E和未显示）。为了评估用Doxo治疗的小鼠在消除或不消除衰老细胞的情况下的心脏功能，我们使用了超声心动图。正如预期的那样，Doxo导致缩短分数（收缩）和射血分数（血容量泵送能力）下降(图2I–J). 引人注目的是，GCV治疗几乎完全阻止了这些下降(图2I–J). 这些治疗对心率没有影响(图2K). 这些发现表明，衰老细胞有助于化疗引起的心脏功能障碍。值得注意的是，在Doxo治疗4周后，心脏功能障碍明显可检测到，但不能提前检测到(图S6F–G)表明化疗后衰老细胞的持续存在对心脏毒性很重要。

因此，在多索治疗后消除衰老细胞后，有可能减轻循环炎性因子的负担，促进HPC的功能恢复，防止心脏功能障碍，从而限制药物毒性。

癌症扩散和复发

化疗的另一个重要副作用是癌症复发。为了研究消除衰老细胞对癌症复发和扩散的影响，我们使用表达病毒致癌基因Polyoma middle T抗原的乳腺癌细胞系MMTV-PyMT。当植入乳腺脂肪垫时，MMTV-PyMT细胞生长就地然后扩散到远端组织，优先是肺和肝(23). 我们使用了表达萤火虫萤光素酶（FLUC）的MMTV-PyMT细胞，使我们能够通过生物发光监测活体动物中的细胞，该底物与用于检测p16-3MR小鼠衰老细胞的底物不同。由于这些肿瘤细胞不表达p16-3MR转基因，我们可以区分化疗对肿瘤细胞的影响和化疗诱导正常细胞衰老的影响。

我们将表达FLUC的MMTV-PyMT细胞注射到p16-MR小鼠的乳腺脂肪垫中。一旦发现肿瘤，我们用载体、Doxo+PBS或Doxo+GCV治疗小鼠。正如预期的那样，Doxo延缓或暂时阻止了肿瘤的生长，小鼠存活率的增加表明了这一点(图3A和S7A系列). 经过1-2周的休眠期后，原发性肿瘤恢复生长，Doxo+PBS组和Doxo+GCV组的动力学相似(图S7A). 然而，Doxo+GCV组的小鼠存活率增加，这与原发肿瘤的大小无关(图3A和S7A系列). 引人注目的是，虽然大多数（约80%）接受Doxo+PBS治疗的小鼠发生了肺和肝转移，FLUC可以检测到，但在Doxo+GCV组中发生转移的小鼠更少（20%）(图3B–C). 原发肿瘤的再生和原发肿瘤部位的溃疡使我们无法确定这些动物的完整生存曲线。尽管如此，数据显示，化疗后去除衰老细胞可以预防或延缓癌症复发并扩散到远端组织。

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图3

衰老促进肿瘤转移和复发

（A–C）fLUC-MMTV-PyMT电池（10⁵)将其注射到p16-3MR雌性小鼠的乳腺脂肪垫中，并用PBS或Doxo（10 mg/kg）进行治疗。7–10天后，给动物注射PBS或25 mg/kg GCV，持续5天（每天腹腔注射）。（A） 对小鼠进行生存跟踪。N=5。（B） 癌细胞注射后7、14和21天，给多索处理的小鼠注射D-荧光素，并使用氙气成像系统测量发光。荧光鉴定fLUC-MMTV-PyMT细胞。第21天，根据fLUC-MMTV-PyMT细胞（C）的发光来评估转移小鼠的数量。（D–G）fLUC-MMTV-PyMT电池（10⁵)注射到p16-3MR小鼠的乳腺脂肪垫中。10天后，手术切除原发性肿瘤，用Doxo（10 mg/kg）治疗小鼠，3天后，用PBS或25 mg/kg GCV治疗5天（每天腹腔注射）。（D） 给小鼠服用D-荧光素，并使用Xenogen成像系统在指定的时间点测量和定量原发性肿瘤的发光。荧光鉴定fLUC-MMTV-PyMT细胞。N＝8。（E） Doxo治疗4周后，根据肺部发光信号评估转移情况，如D.N=8所述。（F–G）肺被切除，并使用Xenogen成像系统测量发光以量化转移数量。对于Doxo+PBS，N=6；对于Doxo+GCV，N=3。数据为平均值±SEM*p<0.05**p<0.01***p<0.001。

乳腺癌患者最常见的治疗方法是手术，然后是辅助化疗或靶向治疗。为了在小鼠中模拟这种方案，我们手术切除了一次可触及的MMTV-PyMT肿瘤(图S7B)然后用Doxo+PBS或Doxo+GCV治疗动物。在多索治疗的短潜伏期后，所有小鼠的原发性肿瘤复发(图3D). 然而，原发肿瘤再生长的动力学取决于小鼠切除后接受的治疗类型(图3D和S7C系列). 牺牲时，Doxo+PBS组的肿瘤平均直径为16 mm，而Doxo+GCV组的肿瘤的平均直径仅为10 mm，这反映在肿瘤生物发光信号的显著差异上(图3D，未显示）。与我们在先前实验中的发现一致，与Doxo+PBS组相比，Doxo+GCV组的转移小鼠数量显著减少(图3E). 此外，Doxo+GCV组发生转移的小鼠表现出明显较少的转移灶(图3F和3G).

虽然Doxo治疗可能会导致植入的肿瘤细胞衰老，但值得注意的是，GCV治疗只会去除衰老的正常宿主细胞。因此，这些数据表明化疗可以通过诱导非肿瘤细胞衰老来促进肿瘤生长和转移。

进一步证明去除衰老细胞，而不是GCV治疗就其本身而言，可以延缓癌症进展，我们测试了ABT-263，一种对衰老细胞具有选择性毒性的抗凋亡抑制剂的作用(24). 正如预期的那样，ABT-263从p16-3MR小鼠中消除了Doxo诱导的衰老细胞(图S8A). 此外，注射MMTV-PyMT细胞的小鼠在手术切除肿瘤并联合Doxo和ABT-263治疗后，肿瘤复发和转移延迟，与GCV的作用类似(图S8B–C).

老鼠

p16-3MR小鼠(15)由AALAC认证的巴克衰老研究所（美国加利福尼亚州诺瓦托）动物设施保存。所有程序均由机构动物护理和使用委员会批准。p16-3MR小鼠在室内繁殖。对于体内发光和组织提取，雄性和雌性小鼠均使用。在所有其他实验中，均使用雌性小鼠。对于Doxo治疗，10–16周龄p16-MR小鼠经腹腔（i.p.）注射一次PBS中2、10或25 mg/kg盐酸阿霉素（Sigma-Aldrich），5天后用溶媒或GCV治疗。GCV通过每天腹腔注射的方式在PBS中连续5天以25 mg/kg的剂量给药。对照小鼠注射等量的PBS。对于紫杉醇治疗，10–16周龄p16-MR小鼠腹腔注射3次10 mg/kg的紫杉醇（Sigma-Aldrich）在PBS/5%二甲基亚砜中，5天后用载体或GCV治疗。GCV通过每天腹腔注射的方式在PBS中连续5天以25 mg/kg的剂量给药。对照小鼠注射等量的PBS。对于替莫唑胺治疗，10–16周龄p16-MR小鼠腹腔注射3次50 mg/kg（Sigma-Aldrich）的PBS/5%二甲基亚砜/0.1%吐温。对于顺铂治疗，10–16周龄p16-MR小鼠腹腔注射3次2.3 mg/kg（Enzo Life Sciences，Farmingdale NY，USA）PBS/1%二甲基亚砜。

MMTV-PyMT-fLUC单元（10⁵)被注射到腹股沟乳房脂肪垫中。手术切除是在全身麻醉（异氟烷）下进行的，伤口用金属针缝合。术前和术后48小时皮下注射镇痛药（丁丙诺啡）。

实时PCR

总RNA是使用PureLink Micro-to-Midi总RNA纯化系统（美国纽约州格兰德岛生命科技公司）制备的。使用试剂盒（Applied Biosystems，Carlsbad CA，USA）将RNA反向转录成cDNA。qRT-PCR反应按所述进行(15)使用通用探针库系统（Roche，South San Francisco CA，USA）。人类和小鼠p16、LmnB1、IL-1a、IL-6、Mmp-3、Mmp-9、Cxcl-1的引物/探针组如之前报道的那样(15，32). 此外，使用了以下集合：Cxcl-10正向5′-gctgccgtcatttctgc-3′，反向5′-tccactggcctcatc-3′，探针#3；Ccl-20正向5′-aactggtgaaaaggctgt-3′，反向5′-gtccatccaaaaa-3′，探头#73；Ccl-7正向5′-ttctgtgcctgctgctcata-3′，反向5′-TTgacatagcatg-3′，探头89。

生物发光

对于体内Renilla荧光素酶发光，小鼠腹腔注射15 ug Xenolight RediJect Coelentarazine h（Calipers/Perkin Elmer，Waltham MA，USA）。25分钟后，用异氟醚对小鼠进行麻醉，并用Xenogen IVIS-200光学成像系统（Caliper Life Sciences，Hopkinton MA，USA；5分钟中期装箱）测量发光。对于体内萤火虫荧光素酶发光，小鼠腹腔注射150 mg/kg氙灯D-荧光素（卡尺/珀金埃尔默）。5分钟后，用异氟醚麻醉小鼠，并用Xenogen IVIS-200光学成像系统（Caliper Life Sciences；3分钟培养基装箱）测量发光。

免疫印迹分析

细胞用温热的PBS洗涤、溶解，并使用4–12%的Bis-Tris凝胶进行SDS–PAGE；分离的蛋白质被转移到硝化纤维素膜上(18). 将膜封闭，并在室温下培养2小时（LaminB1:Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z CA，USA；HMGB1:Abcam，Cambridge MA，USA）或在4°C下过夜（p21:Calbiochem，San Diego CA，USA；actin:Sigma-Aldrich）与初级抗体。在室温下清洗膜并与辣根过氧化物酶（1:5000；细胞信号）-结合二级抗体孵育45分钟，然后再次清洗。通过增强化学发光检测信号。

酶联免疫吸附试验（ELISA）

检测IL-6和CXCL-1的ELISA试剂盒来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国），并根据制造商的协议使用。通过用无血清DMEM洗涤细胞并在无血清DMEM中培养24小时来制备条件培养基。对于Doxo处理的细胞，在处理10天后收集培养基。ELISA结果按细胞数标准化。通过离心分离小鼠血清。

免疫荧光

玻璃盖玻片上的细胞或OCT包埋的肺在PBS中清洗，用4%多聚甲醛固定，用50 mM甘氨酸淬火，用0.3%Triton X-100在PBS内渗透，用3%山羊血清饱和（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司），并与53bp1和γH2AX一级抗体在室温下孵育1小时（Novus Biologicals，Littleton CO，USA），然后与Alexa荧光标记的二级抗体（Life Technologies）孵育45分钟，并使用Prolong Fade with Dapi（Life Technologies）安装。

新陈代谢和活动

在将p16-3MR小鼠转移到隔离室之前，将其单独饲养3天，并使用Promethion系统（美国内华达州北拉斯维加斯的Sable Systems）连续监测4天。或者，在适应单一外壳3天后，将小鼠转移到富含转轮的笼子（Columbus Instruments，Columbus OH，USA）中，并测量3个晚上。食物摄入量是通过每24小时称量一次食物的重量来测量的。就握力而言，训练单个小鼠进行3次试验，然后在随后的3次试验中测量抓握时间并取平均值。

骨髓细胞采集

用一氧化碳对小鼠实施安乐死后，立即从其股骨和胫骨中取出₂使用21号针头和注射器将BMC从骨骼中冲洗到含有2%FCS的HBSS中。在裂解红细胞后，测定从每只小鼠的两条后腿收获的BMCs的总数。

流式细胞术分析造血细胞群的频率

用生物素偶联的抗CD3e、抗CD45R/B220、抗Gr-1、抗CD11b和抗Ter-119抗体以及抗CD16/32抗体预先孵育BMC，以阻断Fcγ受体。然后用链霉亲和素FITC和抗Sca1-PE-Cy7、c-Kit-APC-Cy7、CD150-APC和CD48-Pacific蓝对其进行染色。HPC的频率（Lin⁻Sca1类⁻c-套件⁺细胞）、LSK细胞（Lin⁻Sca1类⁺c-套件⁺细胞）和HSC（CD150⁺CD48型⁻LSK细胞）用Aria II细胞分选仪进行分析。每个样品约为5x10⁵–1x10个⁶使用BD FACSDiva 6.0（BD Biosciences）和FlowJo（FlowJo，Ashland，OR）软件采集BMC并分析数据。

集落形成细胞（CFC）和鹅卵石区域形成细胞（CAFC）分析

通过在MethoCult中培养BM-MNCs（单核细胞）进行CFC分析^™GF M3434甲基纤维素培养基（干细胞^™加拿大温哥华科技公司）。根据制造商的方案，在第7天对CFU粒-巨噬细胞（GM）集落进行评分，在孵育的第12天对CFU-粒细胞、-红细胞、-单核细胞和-巨核细胞（GEMM）集落评分。如前所述进行鹅卵石区域形成细胞（CAFC）分析(24).

超声心动图

如前所述进行二维经胸超声心动图(29). 简言之，在成像期间，用1.5%异氟烷和100%氧气混合对小鼠进行轻度麻醉。使用LZ 550系列、55MHz MicroScan换能器探头和Vevo 2100成像系统（VisualSonics；加拿大安大略省多伦多）在4周实验期前后进行超声心动图检查(33). 左心室缩短分数和射血分数由胸骨旁短轴视图的M模式测定。从至少3个连续的高分辨率心动周期中对所有参数进行平均以进行分析。

患者

这项名为LCCC 1027的研究是在北卡罗来纳大学医院接受乳腺癌治疗的成年患者中进行的，并得到了北卡罗来纳大学机构审查委员会的批准，并在clinicaltrials.gov上注册({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01305954”，“term_id”：“ncT0130595”}}NCT01305954号). 这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。18岁以上被诊断为I–IV期乳腺癌的患者，计划在新诊断或复发疾病的新辅助剂、辅助剂或转移环境下开始新的化疗疗程，他们同意参与该研究。对于这份手稿，只分析了新佐剂和佐剂设置。排除有克隆性骨髓疾病病史（如急性或慢性白血病）、同时进行实验治疗或之前或当前接受HDAC抑制剂治疗的患者。患者接受标准的化疗方案，包括使用生长因子。从病历中提取病史和治疗信息。患者也同意在开始治疗前接受静脉切开术进行分子分析。分子分析由不了解患者数据的研究人员进行，收集临床信息的研究人员不了解实验室结果，直到数据收集完成。

p16表达的评估

将10 ml血液抽入薰衣草（EDTA）试管，用于分离CD3⁺T淋巴细胞。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）分离总RNA，并使用ImProm-II逆转录酶试剂盒（Promega）制备cDNA。的表达式第16页^INK4a公司通过TaqMan定量逆转录聚合酶链反应测定第16页^INK4a公司并标准化为YWHAZ公司家政基因。

我们感谢Simone Brandenburg帮助滴定细胞培养中的阿霉素。我们感谢Herman Sillje分享CD31抗体。

这项工作得到了美国意大利癌症基金会（MD）和美国国立卫生研究院（AG009909、AG017242、AG041122和CA122023）（JC、DZ）的资助。JC和DZ是Unity Biotechnology的创始人。MD、JC和DZ拥有Unity Biotechnology的股权。NM是HealtSpan Diagnostics的员工。NES是HealthSpan Diagnostics的创始人之一，拥有财务利益。