Real-Time Whole-Body Visualization of Chikungunya Virus Infection and Host Interferon Response in Zebrafish

Nuno Palha; Florence Guivel-Benhassine; Valérie Briolat; Georges Lutfalla; Marion Sourisseau; Felix Ellett; Chieh-Huei Wang; Graham J. Lieschke; Philippe Herbomel; Olivier Schwartz; Jean-Pierre Levraud

doi:10.1371/journal.ppat.1003619

《公共科学图书馆病理学》。2013年9月；9（9）：e1003619。

2013年9月5日在线发布。数字对象标识：10.1371/期刊.ppat.1003619

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PMID：24039582

斑马鱼基孔肯雅病毒感染和宿主干扰素反应的实时全身可视化

努诺·帕尔哈,^1,^2,^三佛罗伦斯·吉尔·本哈辛,^4,⁵ 瓦莱里·布利奥拉特,^1,² 乔治·卢法拉,^6,⁷ 马里恩·苏里索,^4,^5,^？一个费利克斯·埃利特,^8,^？b个王建辉,⁸ 格雷厄姆·利什克,⁸ 菲利普·赫博梅尔,^1,² 奥利维尔·施瓦茨,^4,⁵和Jean-Pierre Levraud女士^1,^2,^*

Mark T.Heise，编辑器

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关联数据

补充资料: 电影S1： 出现新的CHIKV-GFP感染细胞。CHIKV-GFP感染幼虫的时间推移成像，感染后时间（pi）显示在左上角。透射光与宽场GFP荧光的叠加；10×目标；从前到左，从背到上，侧向，有一定的背倾。新感染细胞的出现，通过GFP荧光的出现来检测，用箭头表示；只显示焦平面中的细胞。绿色箭头指向肝细胞，黄色箭头指向头部间质或鳃细胞，紫色箭头指向其他细胞。肝细胞的死亡用红色箭头表示。
（移动电话）
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电影S2： CHIKV-GFP感染细胞死亡。CHIKV-GFP感染幼虫的延时成像；感染后时间（pi）显示在左上角。透射光与宽场GFP荧光的叠加；10×目标；从左到前，从背到上。GFP死亡⁺用红色箭头显示的单元格。第一个序列（第1-4秒）：头部视图，眼部表皮细胞和头部间充质细胞死亡；第二序列（第4-8秒）：肝区，肝细胞死亡；第三序列（第8-3秒）：尾端区，鳍成纤维细胞死亡；在这个序列中，一个黑色箭头跟随一个白细胞，白细胞可能吞噬了一个正在死亡的细胞。
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电影S3： 在感染的第一天，表达Ifnφ1的白细胞增加。CHIKV-GFP感染者的时间推移成像ifnφ1:m樱桃⁺幼虫；感染后时间（pi）显示在左上角。GFP（绿色）和mCherry（红色）旋转盘共聚焦荧光图像的叠加；10×目标；从左到前，从背到上。由于该区域富含白细胞，因此选择该区域进行成像，因为该阶段的主要造血区域位于泌尿生殖道开口的尾部。请注意，幼虫的生长导致图像区域向田地的右侧和底部移动。
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文本S1： 包含图S1-S7和表S1-S2的文件，带有图例。
（PDF格式）
第1003619.s004.pdf页（430万）
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摘要

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种可能导致严重疾病的再次融合的虫媒病毒，是一个重要的公共卫生问题。在这里，我们描述了斑马鱼中一种新的CHIKV感染模型，其中病毒在全身的传播被活体破坏，直至细胞分辨率。感染细胞以一个主波出现在各个器官中，感染后的平均出现时间为～14小时。感染细胞死亡的时间取决于器官，导致CHIKV定位向大脑转移。与哺乳动物一样，CHIKV感染引发了强烈的I型干扰素（IFN）反应，这对生存至关重要。干扰素主要由中性粒细胞和肝细胞表达。细胞类型特异性消融实验进一步证明，中性粒细胞在CHIKV抑制中发挥着关键而意外的作用。总之，我们的结果表明斑马鱼代表了一种新的有价值的模型，可以动态地可视化人类病毒的复制、发病机制和宿主反应。

作者摘要

基孔肯雅病是一种由蚊子传播的病毒引起的新发疾病，是一个重要的公共卫生问题。我们建立了基孔肯雅病毒感染斑马鱼模型。第一次，病毒感染细胞的生长和死亡可以在脊椎动物的整个身体中进行活体成像。我们观察到，在接种病毒后的第一天，新感染的细胞出现了广泛的幻影。然后我们发现，感染细胞以强烈的器官依赖性速度死亡，这解释了病毒定位的渐进性转变。值得注意的是，尽管感染斑马鱼的病情明显好转，但病毒仍在大脑中持续存在。我们发现这种恢复严重依赖于宿主I型干扰素应答。令人惊讶的是，我们确定中性粒细胞是表达干扰素和控制基孔肯亚病毒的主要细胞群。

介绍

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种蚊子传播的病毒，会导致严重疾病，自2000年以来在非洲和亚洲再次出现，在几十年几乎没有出现后，导致了数百万例病例的爆发[1]疫情蔓延到以前无CHIKV的地区，如印度洋的拉留尼汪岛，可能是由于病毒对新的媒介物种的适应性突变，白纹伊蚊，老虎蚊子[2],[3],[4],[5]不同于传统的CHIKV载体，如埃及伊蚊,白纹伊蚊能产抗寒卵，是温带国家的主要入侵物种[6]而且它似乎能更好地传播病毒[7]，CHIKV现在威胁要入侵包括加勒比海、美国东南部和南欧在内的许多新领土。目前还没有针对这种疾病的商业疫苗或有效治疗方法[1].

CHIKV感染通常使人虚弱，可能持续数周至数月；其在人类的症状包括急性发热、皮疹、关节和肌肉疼痛、慢性关节痛，以及更罕见的严重并发症，死亡率约为千分之一[1],[8],[9],[10]然而，人类CHIKV感染通常是自限性的，由I型干扰素（IFN）控制，病毒血症持续约一周[8]。特异性抗体很快就会被检测到，并有助于病毒清除[11].

CHIKV向性体内和宿主先天免疫反应才刚刚开始[8],[9]在人类中，该病毒表现出广泛的细胞向性在体外感染成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞，在较低程度上感染髓样细胞（如巨噬细胞）[12],[13]据报道，CHIKV感染者患有严重的脑病，其中大多数是婴儿，一半以上是感染新生儿[14]相比之下，成人约为0.1%[15]-然而，CHIKV神经亲合性仍有争议[16],[17]CHIKV是否会在早期病毒血症阶段后在某些细胞库中持续存在，是否会导致持续数月的痛苦复发，目前仍有争议。

在一定程度上再现人类疾病的小鼠和猕猴模型已经开发出来[18],[19],[20],[21]这些模型极大地提高了我们对该疾病的理解，但它们无法可视化感染动力学以及宿主在全身水平上的抗病毒和炎症反应。

最近，斑马鱼达尼奥雷里奥已经成为宿主-病原体相互作用的新模型，这主要是因为它们的小而透明的幼虫非常适合体内成像。斑马鱼具有与哺乳动物相似的先天性和适应性免疫系统，但其自由游动的幼虫在其生命的第一个月内完全依赖先天免疫，从而可以对先天免疫反应进行专门的解剖[22]在幼虫期，细胞免疫仅由髓细胞组成，中性粒细胞和巨噬细胞是主要的效应细胞[23],[24]与哺乳动物一样，抗病毒免疫由病毒诱导的干扰素调节，斑马鱼拥有四种干扰素（干扰素φ1-4）[25],[26]，结构类似于哺乳动物I型干扰素[27]斑马鱼I型干扰素被分为两组：I（干扰素φ1和φ4）和II（干扰物φ2和φ3），它们分别通过两种不同的异二聚体受体CRFB1/CRFB5和CRFB2/CRFB5发出信号。由于干扰素φ2只在成虫中表达，而干扰素Φ4几乎没有活性，因此干扰素应答是由干扰素α1和干扰素β3在斑马鱼幼虫中介导的[26],[28].

由于CHIKV同时感染哺乳动物和昆虫，并且由于α病毒属的其他成员自然感染沙门氏菌[29],[30]，我们假设斑马鱼自由游动幼虫可能对CHIKV敏感，从而可以对感染细胞进行实时成像，并动态观察整个动物中的宿主-病毒关系。在这里，我们描述了斑马鱼幼虫的一种新的CHIKV感染模型，并分析了感染、细胞死亡和宿主反应的动力学。I型IFN对CHIKV感染斑马鱼的生存至关重要，我们发现中性粒细胞在I型IFNs的产生和CHIKV的感染控制中发挥了意想不到的作用。

结果

CHIKV感染斑马鱼幼虫

我们首先询问斑马鱼是否对CHIKV感染敏感。受精后3天龄的幼虫（dpf）静脉注射(图1A)带有～10²TCID50 CHIKV，使用2005-2006年留尼汪岛疫情的菌株（CHIKV-115）[13]或表达GFP的紧密相关菌株（CHIKV-GFP）[3].CHIKV-115和CHIKV-GFP均建立了感染并复制体内感染病毒的产生在感染后24–48小时达到高峰（>10⁵TCID50/幼虫；即>10⁸TCID50/克组织）(图1B). 使用带有E1特异性引物的qRT-PCR，我们发现类似的动力学(图1C). 这些引物同时扩增基因组和亚基因组转录物，因此主要反映后者的水平，后者在α病毒感染的细胞中更为丰富[31]尽管基因组与亚基因组转录物的比率在不同的α病毒中可能存在很大差异。可以预测的是，在病毒编码的亚基因启动子驱动下也获得了类似的动力学GFP公司成绩单(图1C). 与其他斑马鱼病毒感染模型相比，感染后3天（dpi）最明显的症状较轻[28],[32],[33],[34]最一致的是蛋黄混浊（图S1A文本S1). 其他不太常见的症状包括膀胱充气延迟、血流减慢、心跳不规则、水肿、失去平衡和触摸反应迟缓（表S1文本S1). 这些症状通常是暂时的，到5天时，90%以上的感染幼虫明显恢复，存活到至少7天（未显示）.

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图1

CHIKV在斑马鱼中复制并传播到各种器官。

（A）受精后72小时（hpf）幼虫的方案，显示注射部位在背主动脉（DA）或尾静脉（CV）、尾侧造血组织（CHT）和卵黄同步细胞（y）。（B）感染野生型CHIKV-115或CHIKF-GFP的斑马鱼幼虫的病毒滴度。数据代表了来自5个独立实验的2-5个4只幼虫池的平均值±s.e.m。（C）病毒的qRT-PCRE1级和GFP公司CHIKV-GFP感染后的转录本。来自3个独立实验的3池10只幼虫的平均值±标准偏差。（D）重叠单个代表性野生型CHIKV-GFP感染幼虫的透射和绿色荧光立体显微镜图像，感染后不同时间的活图像（hpi）。CHIKV感染表现为大脑、肝脏、头部间质、肌肉、鱼鳔和卵黄（分别为红色、绿色、黄色、蓝色、白色和洋红色箭头）。（E）用免疫组织化学（IHC）和抗衣壳抗体评估CHIKV-GFP感染后不同时间点特定器官的外显率（感染幼虫显示感染的百分比）和感染严重程度（细胞数）。数据来自两个独立实验，N个 = 每个时间点20只幼虫。

CHIKV感染在大多数组织中被清除，但在脑实质中感染持续存在

我们监测了感染CHIKV-GFP的活斑马鱼的器官和细胞。GFP模式随时间变化(图1D)以及个体之间（图S1B文本S1). 在肝脏、颌骨、鳃、血管内皮、眼睛、鳍、血细胞、肌纤维、大脑、脊髓、鱼鳔和卵黄合胞层中检测到GFP。用衣壳特异性抗体固定和免疫组织化学（IHC）后，在感染CHIKV-115的斑马鱼中观察到类似的模式（未显示）。我们量化了感染细胞在整个生物体内随时间的分布，以建立病毒传播动力学(图1E). 在大多数器官（颌骨、鳍、肝脏、血管、肌肉组织）中，感染细胞的数量以1-2 dpi达到峰值。在达到峰值后，幼虫在特定器官中感染的频率和每个器官中感染细胞的数量都急剧下降。到4dpi时，大多数器官中的CHIKV被清除。相反，大多数动物的脑实质感染在2 dpi时可见，并至少持续到5 dpi(图1D和1E)这表明斑马鱼的大脑可能是病毒库。在最近一个可检测的时间点7dpi时，脑部感染仍然很严重（图S1C文本S1); 此外，用抗GFP和抗衣壳抗体对CHIKV-GFP感染的幼虫进行双重染色，发现几乎所有衣壳阳性细胞也表达GFP，表明GFP的表达是感染的可靠指标，甚至是感染后期。

IHC标记的CHIKV感染的幼虫的共焦成像显示出不同细胞类型的感染(图2A)即鳍中的成纤维细胞(图2B)和钳口(未显示)、内皮细胞(图2C)、肌肉纤维(图2D)和肝细胞(图2E中的图S2文本S1). 红细胞也偶尔发生感染（图S2文本S1)但在巨噬细胞或中性粒细胞中没有(未显示). 在斑马鱼大脑中，神经元和胶质细胞中都检测到CHIKV(图2F中的图S2文本S1).

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图2

CHIVV的细胞向性。

（A）（B–F）中成像区域的方案。（B–F）使用CHIKV-GFP（B–E）在24 hpi或使用CHIKV-115（F）在72 hpi处理斑马鱼的共焦图像。至于所有图像，从前到左，从后到上；标尺，50µm。GFP染色（B，F）DsRed染色（E）红色，衣壳染色（B、F）或绿色（C–E）；细胞核被复染成蓝色。这个fabp10:ds红色转基因标记肝细胞，以及HuC:GFP公司，有丝分裂后神经元。箭头显示感染了鳍成纤维细胞（B）、内皮细胞（C）、肌纤维（D）、肝细胞（E）和神经元（F）。

感染细胞存活差异是病毒在大脑中持续存在的原因

为了评估CHIKV感染的动力学及其细胞病变效应，我们对CHIKV-GFP感染的幼虫进行了延时成像(图3A和3B)并汇编了GFP的出现和死亡⁺单元格(图3C-E). 88%的新感染细胞在24hpi前出现在一个主波中(图3C). 新GFP出现的中位时间⁺细胞为14±2hpi，所有细胞类型的动力学相似(图3D). GFP死亡⁺感染细胞出现膜泡和细胞碎片等凋亡特征(图3B和电影S1和S2系列). 从24 hpi开始，这种情况就很常见(图3C)，总中位死亡时间为67±4 hpi，但取决于细胞类型(图3E). 例如，肝细胞极易受到CHIKV细胞病变的影响，死亡中位数为41±5 hpi，这意味着肝细胞在GFP检测后存活了约27小时，而普通细胞群的存活期为约53小时。相比之下，几乎所有受感染的脑实质细胞都至少存活到72 hpi。这些结果表明，感染明显向大脑转移(图1E)主要是由于细胞存活差异。

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图3

感染细胞的出现和死亡动力学体内CHIKV-GFP感染的延时成像。

（A，B）显示感染细胞出现的电影画面（GFP⁺)在感染的第一天，肝脏中有一个细胞死亡。感染后的时间（以小时和分钟为单位）覆盖在图像上。（A）整个场，透射和GFP荧光叠加（绿色），比例尺100µm。肝脏用黄色描绘；箭头指向肝细胞感染并死亡。（B）同一部电影的细节，仅GFP荧光，标尺为20µm，显示了受感染肝细胞的上升和死亡。（C）静止CHIKV-GFP感染细胞的出现时间（绿色条）和死亡时间（红色条），所有器官合并；相同数据集的（D，E）子分析，显示GFP出现（D）和死亡（E）的动力学⁺每个器官的细胞数，显示为卡普兰-迈尔曲线。N个 = 每个器官中的细胞数。在（C–E）中，数据来自五个独立实验，共有24条鱼被成像，每次成像时间为6–24小时，每个时间点有4–8只动物。

CHIKV感染诱导保护性I型IFN反应

I型干扰素信号对哺乳动物CHIKV的控制至关重要[18],[20]在斑马鱼幼虫中，CHIKV触发高mRNA水平的ifnφ1(NM_207640号，分泌型亚型转录物）和ifnφ3(NM_001111083)和各种干扰素诱导基因，包括毒蛇/vig-1/rsad2(NM_001025556号) (图4A–C和未显示).Ifnφ1和毒蛇在17-24hpi时达到峰值，在至少4天内保持较高水平，与病毒负荷相关。这些水平高于之前在斑马鱼中观察到的鱼类病毒水平[28],[32],[34].Ifnφ3诱导在广度和持续时间上不太突出。为了评估干扰素反应的作用，我们用直接作用于CRFB1的反义吗啉寡核苷酸（MO）敲除了所有干扰素φ的受体(NM_001079681号)和CRFB2(NM_001077626号)亚单位[26]当干扰素受体表达受损（CRFB1+2 MO）时，疾病尤其严重（表S1文本S1)根据疾病评分衡量(定义于表S2英寸文本S1) (图4D). 在CRFB1+2变形鱼中，>90%死于感染(图4E)与感染的对照变体相比，病毒负担增加了100倍(图4F). 在干扰素信号上游，通过细胞溶质途径检测CHIKV对于MAVS（IPS-1/CARDIF/VISA）的敲除非常重要(纳米_001080584)（图S3英寸文本S1)也导致疾病严重程度和死亡率以及病毒负担增加(图4D–F)，与小鼠实验结果一致[35],[36]如预期，CRFB1和CFRB2的击倒没有影响ifnφ1生产但被阻止毒蛇表达，而在MAVS变体中ifnφ1和毒蛇水平显著降低（图S3文本S1). 总之，这些结果表明，I型干扰素途径控制斑马鱼CHIKV的复制和发病机制。

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图4

CHIKV感染可诱导保护性干扰素反应。

斑马鱼I型干扰素的（A–C）表达ifnφ1（A）以及ifnφ3（B）和IFN刺激基因毒蛇（C） CHIKV-GFP感染后。qRT-PCR，来自3个独立实验的10个幼虫的3个池的平均值±s.e.m。（D–F）吗啉介导的IFN受体亚基敲除的作用(CRFB1+2MO）和MAVS(MAVS公司MO）关于CHIKV-GFP感染。没有MO，没有注射吗啉；无V，未感染对照；对照MO，注射非特异性吗啉寡核苷酸。（D）感染后3天的疾病评分；（E）感染斑马鱼的存活；（F）病毒定量E1级随时间推移的成绩单。qRT-PCR，3池3-5个幼虫的平均值±s.e.m，72 hpi的CRFB变体除外（一池5个幼虫）。带阴影的条状图表示一部分鱼类已经死亡的群体，这意味着选择幸存者进行分析。ND，未确定。（G）的模式ifnφ1表达式，整体就地在未感染幼虫（顶部）或CHIKV-GFP感染幼虫（底部）中以24 hpi进行杂交，在7条鱼中具有代表性。箭头表示一些ifnφ1⁺白细胞，箭头指向干扰素φ1⁺肝细胞；L（左） = 肝脏。(***对 < 0.001; **对 < 0.01; *对 < 0.05; ns——不显著）。

斑马鱼ifnφ1:m樱桃转基因标记IFN产生细胞

为了确定干扰素的来源，我们首先使用反义探针进行了全山原位杂交（WISH）ifnφ1在响应的峰值。在感染CHIKV的幼虫中，ifnφ1在肝脏和散在细胞中检测到表达，其形态和分布唤起白细胞(图4G). 为了更好地可视化干扰素产生的时空动态，我们设计了一种转基因干扰素φ1报告子斑马鱼，其中ifnφ1启动子驱动mCherry红色荧光蛋白的表达。在未感染3-6 dpf转基因幼虫中，在极少数（10-30）细胞中检测到mCherry，这些细胞均具有白细胞形态，且大多位于尾部造血组织（CHT），但在感染CHIKV后，mCherri的数量⁺细胞显著增加(图5A). 从2 dpi开始，mCherry的两个主要种群⁺检测细胞：肝细胞和运动白细胞(图5A和电影S3). mCherry系列⁺白细胞散布在除CNS外的全身，主要分布在前部和CHT，并持续到至少4dpi。报告转基因的这种表达模式与内源性ifnφ1基因(图4G)，但出现较晚，明显是由于蛋白质表达和成熟所需的时间，因为在24 hpi时，尽管如此，樱桃的荧光仍然很低m樱桃色mRNA表达(图5B). 因此，与内源性转基因相比，报告基因是忠实的，但有些延迟ifnφ1但值得注意的是，病毒GFP和mCherry在同一细胞中未检测到，这表明干扰素释放主要发生在未感染或非生产性感染的细胞中。

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图5

Ifnφ1-表达细胞为白细胞和肝细胞。

（A）的分布ifnφ1-通过ifnφ1:m樱桃记者转基因。IHC，mCherry染色为红色，GFP为绿色，细胞核为蓝色。共焦成像，重建最大投影覆盖全身的复合图像。感染后不同时间点CHIKV-GFP感染鱼类的典型例子。下面是一个相当于72 hpi的未感染对照。箭头表示一些樱桃⁺白细胞，L = 肝脏。比例尺，100µm。（B）的qRT-PCRm樱桃色（标准化为ef1α)CHIKV-GFP感染后ifnφ1:m樱桃鱼。在12 hpi条件下对未感染鱼类进行折叠诱导；每个时间点10只幼虫组成的一个池的数据。（C）来自CHIKV感染的FACS分选细胞的表达谱ifnφ1:m樱桃鱼类（3 dpi）。qRT-PCR，与整个未感染鱼类相比的折叠诱导（无病毒）。代表2个独立实验的数据。

中性粒细胞是CHIKV感染后产生干扰素的主要白细胞群

我们进一步描述了产生干扰素的细胞。我们FACS分类mCherry⁺感染的细胞ifnφ1:m樱桃斑马鱼3dpi及其mRNA表达谱分析(图5C). 如预期ifnφ1在排序mCherry中最高⁺细胞。这些细胞没有明显的共表达ifnφ3在白细胞基因中，巨噬细胞标记物c-fms/csf1r(NM_131672)增加了mCherry⁺细胞，但最强的富集是髓过氧化物酶(最大功率x,NM_212779号)斑马鱼中一种特殊的中性粒细胞标记物[23],[24].肝细胞标记物工厂1a(NM_001044712号)也表达，与一些产生IFN的肝细胞一致。分类mCherry⁻细胞表达较低但显著ifnφ1水平-尤其是与幼稚幼虫相比，幼稚仔鱼表达水平极低-可能是由于上述延迟。都是mCherry⁺和mCherry⁻表达IFN-诱导转录因子irf3型(NM_001111083)和irf7(NM_200677号)后者在mCherry中富集⁺细胞。

为了证实中性粒细胞的参与，我们交叉中性粒细胞报告mpx:GFP具有ifnφ1:m樱桃斑马鱼。在未感染或感染CHIKV的双转基因斑马鱼中，超过80%的mCherry⁺白细胞表达GFP(图6A–C). 通过Nomarski活体显微镜评估，它们的形态、分布、速度和折射运动颗粒的存在也与中性粒细胞的特征一致[24] （未显示）.

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图6

Ifnφ1-表达白细胞的主要是中性粒细胞，以IFN依赖的方式增加。

（A–E）前区IHCmpx:GFP/ifnφ1:m樱桃双转基因鱼。（A–B）48 hpi时未感染（A）和CHIKV-115感染（B）幼虫的共聚焦成像，最大投影，比例尺50µm，红色mCherry染色，绿色GFP染色，蓝色细胞核（e：眼睛；L：肝脏；h：心脏）；在右侧，单色和合并图像的详细广场。（C）中性粒细胞百分比（GFP⁺)在mCherry中⁺每个字段的白细胞数。（D） mCherry数量⁺中性粒细胞（GFP⁺)每个字段。（E）其他mCherry数量⁺白细胞（GFP⁻)每个字段。对于（C–E），N个 = 3（无病毒）或N个 = 5-7（CHIKV）。（F，G）未感染或CHIKV-GFP感染的幼虫用苏丹黑B染色，以显示髓过氧化物酶颗粒。用体视显微镜对每只斑马鱼的中性粒细胞总数进行定量。（F）标准（无吗啉治疗）动物的中性粒细胞数随时间变化；（G）干扰素受体敲除鱼的中性粒细胞数量(CRFB1+2MO）与对照变体进行比较。N个 = 每组5条鱼(***对 < 0.001; **对 < 0.01; *对 < 0.05; ns——不显著）。

mCherry的数量⁺中性粒细胞显著增加48hpi，并保持在96hpi以上(图6D中的图S4A文本S1). 其他mCherry⁺白细胞（主要是mpeg1格式 ⁺巨噬细胞，未显示)在48 hpi时也有所增加，但数量较少，尤其是在CHT中，它们暂时占mCherry的一半左右⁺人口(图6E中的图S4B和S4C文本S1). 苏丹·布莱克染色法定量的中性粒细胞数在72 hpi时达到峰值（2001±312个细胞/幼虫，而未感染对照组为945±234个细胞/幼体）(图6F); 都是mCherry⁺和mCherry⁻中性粒细胞增多(图6D和未显示). 然而，中性粒细胞的分布并没有明显受到干扰：它们没有在感染灶积聚，也没有像未感染鱼类那样从中枢神经系统中消失[24]有趣的是，干扰素受体的敲除阻止了中性粒细胞的增加，这表明它依赖于干扰素反应(图6G).

斑马鱼中性粒细胞在控制CHIKV感染中起关键作用

接下来，我们讨论了中性粒细胞、巨噬细胞和肝细胞在通过细胞耗竭策略控制CHIKV感染中的作用。

首先，我们通过敲低PU.1/spi1来阻止骨髓生成(AF321099型)导致中性粒细胞和巨噬细胞数量减少[37]（图S5A和S5B in文本S1; 注意，头部图像反映了对成熟细胞的影响，而尾部图像包括造血区域以评估前体细胞的耗竭）。PU.1基因敲除显著增加了疾病严重程度（疾病评分为10.8±3.4，而对照组为2.3±1.6）和死亡率(图7A和7B)与病毒转录物增加相关(图7C). 因此，在斑马鱼中，髓细胞主要控制CHIKV。

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图7

中性粒细胞是产生干扰素φ1的关键细胞。

（A–C）髓细胞耗竭的影响(聚氨酯.1MO，3个独立实验），巨噬细胞耗竭（D-F）（甲硝唑治疗mpeg1:Gal4/UAS:NfsB-m樱桃色鱼类，2个独立实验），（G-I）中性粒细胞过度消耗(csf3r公司MO，2个独立实验），（J–L）紧急粒细胞生成障碍(编号2aMO，2个独立实验）和（M-O）肝细胞耗竭(汤米22MO，2项独立实验）。（A、D、G、J和M）3 dpi时的疾病评分。（B、E、H、K和N）受感染斑马鱼的存活率。独立实验收集的数据。病毒的（C、F、I、L和O）qRT-PCRE1级24 hpi的转录本。来自2个（C，F，L）或1个（I，O）独立实验的6池5个幼虫的平均值±s.e.m。(***对 < 0.001; **对 < 0.01; *对 < 0.05; ns——不显著）。

为了区分这两种白细胞的作用，我们首先使用转基因药物诱导细胞消融系统选择性地清除巨噬细胞[38]（图S5C和S5D in文本S1). 巨噬细胞缺失型CHIKV感染的幼虫表现出疾病严重程度的轻微增加（与对照转基因的2.3±1.5相比，疾病评分为4.8±2.6）(图7D)但几乎没有死亡(图7E)尽管病毒数量略有增加(图7F). 这表明巨噬细胞耗竭在PU.1变体的表型中起着次要作用。

然而，中性粒细胞的可比特异性耗竭尚不可用csf3r公司/gcsfr公司(NM_001113377)敲除对中性粒细胞的影响大于巨噬细胞[39]事实上，在3 dpf时，我们的csf3r公司变形体的mpeg1格式 ⁺巨噬细胞数量，而最大功率x ⁺中性粒细胞严重耗竭（图S6A和S6B文本S1); 中性粒细胞耗竭持续到6dpf（图S6C文本S1). 在受感染的动物中，csf3r公司与PU.1相比，敲除导致中性粒细胞比巨噬细胞减少更多（图S6D文本S1).Csf3r公司变体对CHIKV高度敏感，疾病评分较高(图7G)，感染后3天开始死亡(图7H)，并且病毒转录物显著增加(图7I).

此外，我们试图通过敲除中性粒细胞来阻止中性粒细胞数量的增加编号2a（斑马鱼iNOS）(NM_001104937)最近描述了一种阻止细菌感染系统中感染诱导的粒细胞生成的策略[40]中性粒细胞数量在编号2a感染前的变体(未显示)，但其增加被有效阻止（图S6E文本S1)这与疾病评分增加有关(图7J)，死亡率从4 dpi开始(图7K)以及病毒转录物的增加(图7L).

总之，这些实验提供了独立和收敛的证据，证明中性粒细胞是控制CHIKV的主要人群，这与中性粒细胞在ifnφ1-表达白细胞(图6C).

最后，使用汤米22(NM_001001724号)生产任务单[41]（图S7英寸文本S1)也导致了更高的疾病严重程度和更多的病毒产生(图7M和7O)但死亡率没有增加(图7N)表明肝细胞在控制CHIKV中的作用不如白细胞重要。

讨论

在本研究中，我们建立斑马鱼作为研究CHIKV发病机制的新模型。斑马鱼幼虫中病毒传播的整个过程与在哺乳动物中观察到的过程相近，病毒血症的早期峰值随后出现下降，目标细胞类型相似，并且病毒控制的关键依赖于宿主IFN反应。此外，强大的体内在斑马鱼身上可用的成像技术揭示了感染的新特征。

我们可以想象全身各个细胞感染的开始。几乎所有新感染的细胞都出现在注射病毒后的前24小时内的一次大波动中，不同靶器官之间的差异相对较小。因为在第一波感染细胞上升之前，我们无法检测到GFP表达强烈的细胞，我们推测它反映了被接种病毒感染的初始细胞集。我们观察到的显著的诱导间变异可能是由比接种病毒数量更多的易感细胞引起的，从而导致随机的初始感染模式。在宿主IFN反应开始后不久，新感染细胞的出现率下降，这表明当最初一波感染细胞产生新的感染性病毒时，宿主反应使大多数其他细胞对病毒不起作用。我们还观察并量化了感染细胞死亡事件，这些事件通常呈现凋亡特征。CHIKV死亡时间⁺细胞具有强烈的器官依赖性。感染细胞存活率的差异说明了向脑实质转移的明显倾向，即使在清除了身体其他部位后，感染仍在脑实质中持续存在。

斑马鱼大脑中CHIKV持续时间较长，这表明神经元可能是以前被忽视的病毒贮存库。然而，这很可能主要发生在婴儿身上，因为脑炎是新生儿基孔肯雅病的特征，而不是成年人。CHIKV潜在的蓄水池是一个猜测问题，因为许多患者在感染CHIKV后的几个月内表现出慢性关节痛，尽管病毒血症得到了缓解，但尚不清楚这是由于最初感染引发的长时间自体炎症还是由持续性病毒刺激所致[8],[9],[10]在成年猕猴中，CHIKV被认为存在于巨噬细胞中，而不是CNS中[19]在受感染的新生小鼠中，未发现CHIKV在大脑中持续存在[18],[42]此外，在该模型中，CHIVV感染软脑膜和脉络丛细胞，但不感染脑实质。然而，小鼠脑实质细胞可能会被CHIKV感染，如鼻内感染后所示[43]或在原代细胞培养物上[17].

斑马鱼模型还允许我们动态成像和FACS分类通过表达ifnφ1基因。基于基因表达谱、形态和共表达mpx:GFP转基因，两个主要群体显示表达ifnφ1:m樱桃转基因：中性粒细胞和肝细胞。有趣的是，虽然两者都是irf7和irf3型鱼中含有ISG吗[44]因此预计会在受感染鱼类的所有细胞中诱导，红外f7在分类的mCherry中表达水平较高⁺比mCherry⁻细胞。这与组成性较高的irf7由专门从事ifnφ1斑马鱼中的表达&反映哺乳动物浆细胞样树突状细胞的关键特性[45]然而，细胞类型不同。虽然肝细胞未被视为干扰素的专门来源，但在某些情况下，例如在小鼠干扰素β报告细胞系的Thogoto病毒感染期间，肝细胞被发现是主要的生成细胞在体外 [46]相比之下，中性粒细胞目前还不被认为是干扰素的重要来源[47],[48]然而，在斑马鱼幼虫中，中性粒细胞占80%ifnφ1-表达白细胞。在这方面，应该强调的是，我们的主要标志，最大功率x在哺乳动物中不完全是中性粒细胞特异性的，而在斑马鱼中则表现出严格的中性粒细胞特异性[23],[24]此外，我们的耗竭实验表明，中性粒细胞是控制斑马鱼CHIKV感染的关键人群，而巨噬细胞和肝细胞对此控制的贡献较小。巨噬细胞耗竭几乎没有什么影响，似乎不需要巨噬细胞和中性粒细胞的协同作用来控制CHIKV。然而，在斑马鱼中出现真正的中性粒细胞特异性清除方法之前，我们不能排除微量中性粒细胞显著增加的可能性csf3r公司-嗜中性粒细胞依赖性巨噬细胞亚群；耗竭后的补偿机制也是一个需要考虑的重要警告。

除了产生干扰素外，其他机制可能与观察到的髓细胞，尤其是中性粒细胞对CHIKV发病机制的保护作用有关。中性粒细胞在预防病毒感染中的作用尚未完全阐明[49]最近研究表明，中性粒细胞胞外陷阱（NETs）可保护宿主细胞免受小鼠粘液瘤病毒感染[50]并通过髓过氧化物酶和α-防御素在人体内的作用捕获HIV-1并促进其消除[51]斑马鱼中性粒细胞，与人类中性粒细胞具有许多功能特征，包括NET的产生[52]，贪婪地吞噬表面的细菌[53]在分枝杆菌病中清除死亡的感染细胞[54]但到目前为止，它们在病毒感染期间的功能尚不清楚。斑马鱼（和人类）中性粒细胞在检测CHIKV感染细胞中的作用以及介导病毒清除的机制值得进一步研究。

随着CHIKV感染，中性粒细胞数量增加，我们发现这一反应依赖于干扰素反应。这与我们的预期相反，因为已知病毒感染引起的急性干扰素诱导会导致粒细胞减少[55]甚至在鱼类中，发现在病毒感染期间粒细胞数量减少[56]有趣的是，在感染CHIKV且病毒载量高的人中有中性粒细胞的报告[57]这表明CHIKV可能以一种不寻常的方式刺激中性粒细胞。值得注意的是，这一增长取决于编号2a（斑马鱼iNOS），正如在沙门氏菌斑马鱼感染模型[40]根据实验设置，发现iNOS有利于[58],[59]或抵消[60]小鼠炎症器官中性粒细胞浸润。iNOS在哺乳动物CHIKV炎症反应中的作用值得研究。

比较感染模式和干扰素反应，病毒的持续性（由感染细胞的存活决定）与干扰素的局部产生呈负相关，这一点可能很重要。感染细胞死亡最快的器官是肝脏，这也是干扰素的主要本地来源。相反，受感染的细胞在大脑中持续的时间要长得多，而在斑马鱼的其他组织中，中性粒细胞被排除在外[24].评估细胞自主性的相对贡献-例如自噬[61]–和非细胞自主（主要是干扰素驱动）事件，这些事件是细胞对CHIKV细胞病变效应敏感性的基础体内将是我们未来的目标之一。干扰素已被证明能诱导病毒感染细胞的凋亡[62].由于血脑屏障（BBB）阻止干扰素进入该器官，受感染的脑神经元和胶质细胞可能会持续存在。斑马鱼脑内皮细胞早在3dpf时就表达BBB标记物Claudin 5和ZO-1，在此阶段，脑实质血管对辣根过氧化物酶（44 kDa）和罗丹明-dextran（10 kDa[63]因此，斑马鱼干扰素φs（～20kDa）很可能无法到达脑实质，从而阻止脑感染细胞发生凋亡。也有人认为，较少“可再生”的组织和细胞，如有丝分裂后神经元，对I型干扰素的反应与其他细胞类型不同[62].

详细描述单个病毒感染细胞动力学的成像研究体内都是最近的，而且仍然稀少[64],[65],[66]斑马鱼模型提供了独特的机会，可以实时可视化和描述全身感染细胞的上升和死亡。据我们所知，这项研究首次分析了单个病毒感染细胞在整个生物体中的命运。结合成像IFN产生细胞和进行宿主基因沉默、突变或药物筛选的能力，我们的工作将斑马鱼确立为人类致病性病毒研究的新的有价值宿主。

材料和方法

道德声明

本研究中描述的所有动物实验均在巴斯德研究所根据欧盟实验动物处理指南进行(http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm)并获得了巴黎Sanitaire和Vétérinaire方向根据许可证#B-75-1061。

渔业和畜牧业

斑马鱼胚胎的培育如前所述[67],[68]野生型AB鱼最初从ZIRC（美国俄勒冈州尤金）获得。使用了以下转基因株系：Tg（gata1a:DsRed）^{标准偏差2} [69],Tg（弹性3:EGFP）^knu3个 [70]称为HuC:GFP公司在文本中，Tg（gfap:EGFP）^2001年3月 [71],Tg（fabp10:dsRed）^gz4（gz4） [72],Tg（mpx:EGFP）^{i114号机组} [73],Tg（mpeg1:mCherry）^gl23型和Tg（mpeg1:Gal4FF）^gl25型 [74]、和Tg（无人机-E1b：Eco.NfsB mCherry）^c26号机组 [38]称为UAS:NfsB-mCherry公司在文本中。出于成像目的，胚胎通常在24 hpf以后用0.003%1-苯基-2-硫脲（PTU）培养，以防止黑色素形成。

病毒

CHIKV在BHK细胞上产生。CHIKV-115是2005年从拉留尼旺一名年轻成年人中分离出的临床菌株[2]它的整个基因组序列都是可用的(#AM258990型). 自克隆以来，这种病毒已经传播了三次。CHIKV-GFP对应于CHIKV-LR 5′GFP病毒，该病毒通过在CHIKV基因组的两个主要基因之间插入由CHIKV亚基因组启动子控制的GFP编码序列产生，使用LR主干(#224268欧元)源自OPY1菌株，2006年来自La Réunion的临床分离物；GFP的表达在80%以上的感染细胞中保留，在哺乳动物或蚊子细胞中连续传代多达8次[3]我们之前使用的CHIKV-GFP病毒经过了两到三次传播。

Ifnφ1报告基因转基因的产生

我们产生了两个独立的ifnφ1报告基因株，Tg（ifnphi1:mCherry）^{智能功率1}和Tg（ifnphi1:mCherry）^{智能功率2}具有难以区分的转基因表达(未显示)，此处两者都称为ifnφ1:m樱桃鱼。来自PAC克隆BUSMP706A0151Q01（IMAGENE）的6.5 kb SpeI-PstI片段覆盖了ifnφ1在Tol2衍生载体中，在法尼基化mCherry的ORF之前克隆启动子，以获得载体pTol2pIFNL1mC-F。该片段包括包括斑马鱼第一密码子的外显子1干扰素φ1ORF公司。此构造与收费标准2mRNA导入AB起源的1细胞期卵子[75].

CHIKV感染和疾病评分

按照说明注射和处理幼虫[68]简单地说，70–72 hpf的斑马鱼幼虫通过～10的微注射接种²TCID50 CHIKV（～1 nl感染BHK细胞的上清液，稀释至10⁸TCID50/ml）。然后将幼虫分布在24孔培养板的各个孔中，保持在28°C，并用体视显微镜定期检查。首先在意识清醒的动物身上评估感染的临床症状，然后对其进行麻醉以更好地观察。临床状态的定量评估基于精确的标准列表(看见表S2英寸文本S1)盲目评估，得出的疾病评分范围为0（无疾病迹象）至15（死亡或绝症）。

CHIKV滴定

将感染的幼虫进行snap冷冻，并在−80°C下保存，然后在～100µl培养基中均质；然后在Vero细胞上将样品滴定为TCID50/幼虫[13].

定量RT-PCR

如前所述进行RNA提取、cDNA合成和定量PCR[34]; 包括外部量化标准，以提供绝对转录数量。使用了以下两对引物（正、反义）：GFP公司:CCATCTCTCTCAAGGAC公司和CGTTGTGGCTGTGTAGTTG;ef1α:GCTGATCGTTGGAGTCAACA公司和加拿大;ifnφ1（分泌型亚型）：TGAGAACTCAAATGGACCT公司和GTCCTCCACCTTGACTTGT公司;ifnφ3:GAGGAGCAGGTTACTGGTGT公司和GTTCATGATGCATGTGCTGTA;毒蛇:GCTGAAAGAGAGAGAATGG公司和AAACACTGGAGACCTTCCAA公司;E1-CHIKV公司:AARTGYGCNGTNCAVTCNATG公司和国家统计局（这些引物分别与CHIKV基因组的10921–10943和11167–11189位点匹配#AM258990型，包括根据IUPAC公约标记的退化碱基，使其对沉默突变无动于衷）；irf3型:GAGCCAAATCGGCGATATT公司和GGCCTGACTCATCCATTT公司;红外f7:TCTGCATGCAGTTTCCCAGT公司和TGGTCCACTGAGTGTGTGA公司;最大功率x:ATGGAGGTGATCTTGA公司和AAGCTATGTGTGTGGA公司;mpeg1格式:中交CACCAGTGAAGAGG和GTGTTTGATTTTCAATGG公司;工厂1a:AGACAGCTAAACTGTGGT公司和AGCTGAGTTACTGATAG公司;m樱桃色:CCCGCCGACATCCCCGACTA公司和GGGTCACCGGTCACACCCC公司为了使cDNA数量正常化，我们使用了看家基因ef1α转录本，除非在特定情况下，使用E1-契科夫.

整体式车身体内成像

幼虫被麻醉后放置在一个琼脂涂层的密封Petri培养皿的底部，并按照描述进行成像[34].评估耗竭策略的效率，Z轴-用Leica Z16 APO a型宏观显微镜采集22µm级麻醉幼虫，并使用ImageJ软件进行量化。对于中的图S6A和S6B文本S1如前所述进行量化[76].

时间推移体内成像

对于体内延时成像，4-6只幼虫，用112µg麻醉 /ml三辛，横向定位并固定在54 mm塑料底培养皿中心的～1%低熔点琼脂糖中，然后覆盖2 ml含三辛的水。使用尼康生物站IMQ、10倍物镜（NA 0.5）和DSQi相机进行多场透射和荧光成像。成像通常在26°C下进行Z轴-至少每30分钟采集一次具有10µm台阶的堆叠。成像疗程通常持续6至24小时；始终包括未感染的对照幼虫。细胞出现和死亡数据是从涵盖0至72 hpi时间范围的多个成像会话中串联而来的。

整体免疫组化

IHC按说明执行[77]使用的主要抗体为：鼠抗甲病毒衣壳单克隆抗体（1∶200）[78]、兔多克隆至DsRed（1∶300，Clontech），也标记了mCherry蛋白，小鼠单克隆至GFP（1∶500，Invitrogen），鸡多克隆至GFP（1∶50，Abcam），小鼠单抗（FIS 2F11/2）至肠道分泌细胞表位（1∶400，Abcam）。所用的二级抗体是：Cy3标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG（1∶300，Jackson Immunoresearch），Alexa 488标记的山羊抗小鼠或抗鸡（1∶500，Invitrogen）。细胞核在室温下用Hoechst 33342以2µg/ml（Invitrogen）染色30分钟。

固定胚胎成像

固定胚胎在成像前逐渐转移到80%的甘油中。使用配备16×（NA 0.5）、63×（NA 1.30）油浸物镜和10×（NA 0.30）干物镜的徕卡SPE倒置共聚焦显微镜拍摄IHC加工鱼的共聚焦图像。使用徕卡MZ16立体显微镜从上方照明，拍摄WISH或苏丹黑B染色的幼虫图像。用徕卡Z16 APO a型显微镜拍摄IHC处理的幼虫的全身图像。图像使用LAS-AF（徕卡）、ImageJ和Adobe Photoshop软件进行处理。具有变形虫形态的细胞被评为“白细胞”。

吗啉注射液

如前所述，将吗啉反义寡核苷酸（Gene Tools）注射到1-4细胞期胚胎中[68].crfb1型剪接吗啉(CGCCAAGATCATACCTGTAAAGTAA公司)（2 ng）与crfb2型剪接吗啉(ctatgaatctctactaggtaaac公司)（2 ng），击倒所有I型干扰素受体[26].其他吗啉：微型飞行器剪接吗啉(ATTTGAATCCATTACCGATA公司)（4纳克）；汤姆22翻译吗啉[41](GAGAAAGCTCCTGGATCCAT公司)（2纳克）；聚氨酯1翻译吗啉(GATATACTGATACTCCATTGGTGGT)[37]（2 nl中20 ng）；csf3r公司翻译吗啉(GAAGCAGAGCAGAGAGAGACGCCAT公司)[74]（4纳克）；编号2a剪接吗啉(acagtttaaaagtacttagccgct)[40]（6纳克）。无靶点控制吗啉：#1(GAAAGCATGGCATCTGGATCATA公司)（2-6纳克）#2个(TACCAAAAGCTCTTATCGAGGGA公司)（20纳克）#3个(CCTCTTACCTCAGTCATATTATATA公司)（4纳克）。

胚胎分离和FACS分类

按照别处的描述进行胚胎分离[79]在裂解缓冲液中收集分选细胞，并使用RNAqueous Micro试剂盒（Ambion）提取RNA。细胞制备在BL3设施中进行；细胞分选机位于BL2设施内的塑料帐篷下，分选后用稀释的漂白剂冲洗数小时。

整体安装就地杂交

WISH的执行如前所述[80]，杂交温度为55°C。生成ifnφ1反义探针，我们RT-PCR扩增了斑马鱼503 bp的片段ifnφ1用T3修饰反义引物从CHIKV感染幼虫中提取cDNA(GAATTCATAACCCTCTCCACTAAGGATGAGATGCTCTTCGTTTT（加塔塔ACCCTCT）)和正常的感觉(TCTGCAGAGTCAAGTCTG公司). 用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化PCR产物，并转录探针在体外用T3聚合酶（Promega）。通过NucAway自旋柱（Ambion）纯化去除未结合核苷酸。

苏丹黑B染色

中性粒细胞染色如[24]，使中性粒细胞可以用解剖镜轻松计数。

巨噬细胞耗竭

甲硝唑介导的消耗按照[38].简要说明Tg（mpeg1:Gal4FF）^gl25/− [74]被跨越到Tg（UAS-E1b:NfsB-mCherry）^c264/c264 [38]以产生双阳性转基因和单阳性兄弟姐妹对照。将48至70 hpf的胚胎放置在10 mM甲硝唑0.1%二甲基亚砜溶液中，以诱导表达NfsB-mCherry的巨噬细胞的特异性耗竭。然后用胚胎水冲洗胚胎3倍。

统计分析

为了评估平均值之间的差异，使用双尾非配对吨-在适当的情况下，使用检验或方差分析（ANOVA），然后使用Bonferroni的多重比较检验。正态分布通过Kolmogorov-Smirnov检验进行分析。非高斯数据采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验进行分析。对<0.05被认为具有统计学意义（符号：***对<0.001; **对<0.01; *对<0.05). 使用Kaplan-Meier估计器绘制生存数据，并进行log-rank检验以评估组间差异。使用Prism软件进行统计分析。

支持信息

电影S1

出现新的CHIKV-GFP感染细胞。CHIKV-GFP感染幼虫的时间推移成像，感染后时间（pi）显示在左上角。透射光与宽场GFP荧光的叠加；10倍目标；从前到左，从背到上，侧向，有一定的背倾。新感染细胞的出现，通过GFP荧光的出现来检测，用箭头表示；只显示焦平面中的细胞。绿色箭头指向肝细胞，黄色箭头指向头部间质或鳃细胞，紫色箭头指向其他细胞。肝细胞的死亡用红色箭头表示。

（移动电话）

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电影S2

CHIKV-GFP感染细胞死亡。CHIKV-GFP感染幼虫的时间推移成像；感染后时间（pi）显示在左上角。透射光与宽场GFP荧光的叠加；10倍目标；从左到前，从背到上。GFP死亡⁺用红色箭头显示的单元格。第一个序列（第1-4秒）：头部视图，眼部表皮细胞和头部间充质细胞死亡；第二序列（第4-8秒）：肝区，肝细胞死亡；第三序列（第8-3秒）：尾端区，鳍成纤维细胞死亡；在这个序列中，一个黑色箭头跟随一个白细胞，白细胞可能吞噬了一个正在死亡的细胞。

（MOV）

单击此处查看其他数据文件。^{（440万，移动）}

电影S3

在感染的第一天，表达Ifnφ1的白细胞增加。CHIKV-GFP感染者的时间推移成像ifnφ1:m樱桃⁺幼虫；感染后时间（pi）显示在左上角。GFP（绿色）和mCherry（红色）旋转盘共焦荧光图像的叠加；10×目标；从左到前，从背到上。由于该区域富含白细胞，因此选择该区域进行成像，因为该阶段的主要造血区域位于泌尿生殖道开口的尾部。请注意，幼虫的生长导致图像区域向田地的右侧和底部移动。

（移动电话）

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文本S1

包含图S1-S7和表S1-S2的文件，带有图例。

（PDF格式）

单击此处查看其他数据文件。^{（430万，pdf）}

致谢

我们感谢Maxence Frétaud的技术援助，感谢Pierre Boudinot和Matthew Albert对手稿的批判性阅读，感谢Stephen Higgs提供CHIKV-GFP菌株，感谢Cathy Gonzalez和Nadine Peyrieras帮助生成ifnφ1:m樱桃转基因，Annemarie Meijer用于转运mpeg1:Gal4格式fish、Marie Nguyen和Emmanuelle Perret分别来自巴斯德研究所的流式细胞术和动态成像平台。

资金筹措表

这项工作的资金来源于国家复兴开发署（Zebraflam grant ANR-10-MIDI-009和CHIK-HOST-PATH2 grant）、法国地区（DIM-Malinf）以及巴斯德研究所和CNRS的机构拨款。NP获得了技术基金会的奖学金（SFRH/BD/60678/2009）。GJL得到了国家卫生和医学研究委员会的支持（拨款461208和637394）。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚政府的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

1Burt FJ、Rolph MS、Rulli NE、Mahalingam S、Heise MT（2012）基孔肯亚病毒：一种重新融合的病毒.柳叶刀 379: 662–671. [公共医学][谷歌学者]

2Schuffenecker I、Iteman I、Michault A、Murri S、Frangeul L等人（2006年）引起印度洋疫情的基孔肯雅病毒基因组微进化.公共科学图书馆医学三：e263。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

三。Tsetsarkin K、Higgs S、McGee CE、De Lamballerie X、Charrel RN等（2006年）基孔肯亚病毒（La Reunion分离物）的感染性克隆用于载体活性研究.媒介传播的动物传染病 6: 325–337. [公共医学][谷歌学者]

4de Lamballerie X、Leroy E、Charrel RN、Ttsetsarkin K、Higgs S等人（2008）基孔肯雅病毒通过进化趋同适应虎蚊：一个即将到来的迹象？维拉尔J 5: 33.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

5Tsetsarkin KA，Weaver SC（2011年）序列适应性突变增强基孔肯亚病毒的有效载体转换及其流行.公共科学图书馆-病理学 7：e1002412。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

6Medlock JM、Hansford KM、Schaffner F、Versteirt V、Hendrickx G等人（2012年）欧洲入侵蚊子综述：生态、公共卫生风险和控制选择.媒介传播的动物传染病 12: 435–447.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

7Vega-Rua A、Zouache K、Caro V、Diancourt L、Delaunay P等（2013）法国东南部温带白纹伊蚊传播基孔肯雅病毒和登革热病毒的高效性.公共科学图书馆一号 8：e59716。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

8Schwartz O，Albert ML（2010年）基孔肯雅病毒的生物学和发病机制.Nat Rev微生物 8: 491–500. [公共医学][谷歌学者]

9Dupuis-Maguiraga L、Noret M、Brun S、Le Grand R、Gras G等人（2012年）基孔肯雅病：虫媒病毒引起的关节痛从急性期到慢性期的感染相关标志物.PLoS Negl Trop Dis网站 6：e1446。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

10Suhrbier A、Jaffar-Bandjee MC、Gasque P（2012）关节源性α病毒——概述.Nat Rev风湿病 8: 420–429. [公共医学][谷歌学者]

11Lum FM、Teo TH、Lee WW、Kam YW、Renia L等（2013）抗体在控制基孔肯雅病毒感染中的重要作用.免疫学杂志 190: 6295–6302.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

12Ozden S、Huerre M、Riviere JP、Coffey LL、Afonso PV等（2007年）基孔肯雅病毒感染靶向的人类肌肉卫星细胞.公共科学图书馆一号 2：e527。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

13Sourissau M、Schilte C、Casartelli N、Trouillet C、Guivel-Benhassine F等（2007）再次流行基孔肯亚病毒的特征.公共科学图书馆-病理学三：e89。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

14Gerardin P、Barau G、Michault A、Bintner M、Randrianaivo H等人（2008）留尼汪岛母婴基孔肯雅病毒感染的多学科前瞻性研究.公共科学图书馆医学 5：e60。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

15Economopoulou A、Dominguez M、Helynck B、Sissoko D、Wichmann O等人（2009年）非典型基孔肯亚病毒感染：2005-2006年留尼汪岛疫情期间严重疾病的临床表现、死亡率和风险因素.流行病感染 137: 534–541. [公共医学][谷歌学者]

16Arpino C、Curatolo P、Rezza G（2009年）基孔肯雅与神经系统：我们做什么和不知道什么.Med Virol牧师 19: 121–129. [公共医学][谷歌学者]

17Das T、Jaffar-Bandjee MC、Hoarau JJ、Krejbich Trotot P、Denizot M等人（2010）基孔肯雅热：一种再次融合的虫媒病毒的中枢神经系统感染和病理.神经生物进展 91: 121–129. [公共医学][谷歌学者]

18Couderc T、Chretien F、Schilte C、Disson O、Brigitte M等（2008）基孔肯雅病小鼠模型：年轻和低效的I型干扰素信号传导是严重疾病的危险因素.公共科学图书馆-病理学 4：e29。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

19Labadie K、Larcher T、Joubert C、Mannioui A、Delache B等人（2010年）非人类灵长类的基孔肯雅病涉及巨噬细胞中病毒的长期滞留.临床研究杂志 120: 894–906.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

20Schilte C、Couderc T、Chretien F、Sourisseau M、Ganneux N等人（2010年）I型干扰素通过对非造血细胞的作用控制基孔肯亚病毒.实验医学杂志 207: 429–442.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

21Gardner J、Anraku I、Le TT、Larcher T、Major L等人。成年野生型小鼠的基孔肯雅病毒关节炎.J维罗尔 84：8021–8032。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

22Tobin DM、May RC、Wheeler RT（2012）斑马鱼：一种see-through宿主和一个荧光工具箱，用于探测宿主-猪相互作用.公共科学图书馆-病理学 8：e1002349。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

23Lieschke GJ、Oates AC、Crowhurst MO、Ward AC、Layton JE（2001）胚胎和成年斑马鱼粒细胞和巨噬细胞的形态和功能特征.血液 98: 3087–3096. [公共医学][谷歌学者]

24Le Guyader D、Redd MJ、Colucci-Guyon E、Murayama E、Kissa K等人（2008）斑马鱼中性粒细胞的起源和非常规行为.血液 111: 132–141. [公共医学][谷歌学者]

25Zou J、Tafalla C、Truckle J、Secombes CJ（2007）鱼类第二组I型干扰素的鉴定揭示了脊椎动物干扰素进化.免疫学杂志 179: 3859–3871. [公共医学][谷歌学者]

26Aggad D、Mazel M、Boudinot P、Mogensen KE、Hamming OJ等人（2009年）斑马鱼病毒诱导的两组干扰素通过具有特异性和共享链的不同受体传递信号.免疫学杂志 183: 3924–3931. [公共医学][谷歌学者]

27Hamming OJ、Lutfalla G、Levraud JP、Hartmann R（2011）斑马鱼干扰素I和II的晶体结构揭示了脊椎动物中I型干扰素结构的保守性.J维罗尔 85: 8181–8187.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

28Levraud JP、Boudinot P、Colin I、Benmansour A、Peyrieras N等（2007）斑马鱼干扰素受体的鉴定：脊椎动物干扰素系统起源的意义.免疫学杂志 178：4385–4394。[公共医学][谷歌学者]

29Weston J、Villoing S、Bremont M、Castric J、Pfeffer M等人（2002年）通过基因组序列分析、单克隆反应性和交叉感染比较两种水生α病毒，即鲑鱼胰腺病病毒和睡眠病病毒.J维罗尔 76: 6155–6163.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

30Forrester NL、Palacios G、Tesh RB、Savji N、Guzman H等人（2012年）α病毒属的基因组系统发育表明其起源于海洋.J维罗尔 86: 2729–2738.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

31Durbin R、Kane A、Stollar V（1991）Sindbis病毒的一种突变体，其斑块形态发生改变，蚊子细胞中26S:49S RNA合成比率降低.病毒学 183: 306–312. [公共医学][谷歌学者]

32Phelan PE、Pressley ME、Witten PE、Mellon MT、Blake S等人（2005）斑马鱼（Danio rerio）蛇头弹状病毒感染特征.J维罗尔 79: 1842–1852.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

33Lopez-Munoz A、Roca FJ、Sepulcre议员、Meseguer J、Mulero V（2010）斑马鱼幼虫无法对鲤鱼病毒春季病毒血症引起的水传播感染产生保护性抗病毒反应.Dev-Comp免疫学 34: 546–552. [公共医学][谷歌学者]

34Ludwig M、Palha N、Torhy C、Briolat V、Colucci Guyon E等人（2011年）病毒感染的全身分析：血管内皮是斑马鱼幼虫感染性造血坏死病毒的主要靶点.公共科学图书馆-病理学 7：e1001269。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

35Rudd PA、Wilson J、Gardner J、Larcher T、Babarit C等人（2012年）干扰素反应因子3和7对基孔肯雅病毒出血热和休克的保护作用.J维罗尔 86: 9888–9898.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

36Schilte C、Buckwalter MR、Laird ME、Diamond MS、Schwartz O等人（2012）前沿：IRF-3和IRF-7在基孔肯雅感染宿主反应期间在造血和非造血细胞中的独立作用.免疫学杂志 188: 2967–2971. [公共医学][谷歌学者]

37Brannon MK、Davis JM、Mathias JR、Hall CJ、Emerson JC等（2009）铜绿假单胞菌III型分泌系统与吞噬细胞相互作用调节斑马鱼胚胎的全身感染.细胞微生物学 11: 755–768.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

38Davison JM、Akitake CM、Goll MG、Rhee JM、Gosse N等人（2007年）斑马鱼组织特异性细胞标记和消融中Gal4-VP16转基因插入物的反激活作用.求文献一篇 304: 811–824.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

39Liongue C、Hall CJ、O'Connell BA、Crosier P、Ward AC（2009年）斑马鱼粒细胞集落刺激因子受体信号传导促进骨髓生成和髓细胞迁移.血液 113: 2535–2546. [公共医学][谷歌学者]

40Hall CJ、Flores MV、Oehlers SH、Sanderson LE、Lam EY等（2012）斑马鱼造血干细胞和祖细胞室的感染反应性扩张依赖于诱导性一氧化氮.细胞干细胞 10：198–209。[公共医学][谷歌学者]

41Curado S、Ober EA、Walsh S、Cortes-Hernandez P、Verkade H等人（2010）线粒体导入基因tomm22是肝细胞存活所必需的，并提供了肝再生模型.Dis模型机械三: 486–495.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

42Ziegler SA、Lu L、da Rosa AP、Xiao SY、Tesh RB（2008）基孔肯雅病毒感染发病机制研究的动物模型.Am J Trop医学杂志 79: 133–139. [公共医学][谷歌学者]

43王娥，沃尔科娃E，亚当斯AP，福雷斯特N，肖SY等（2008）基孔肯雅嵌合α病毒候选疫苗.疫苗 26: 5030–5039.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

44孙凤，张玉斌，刘铁克，甘磊，于福凤，等（2010）鱼类IRF3作为IFN诱导蛋白的特性揭示了脊椎动物IFN反应的进化调控.免疫学杂志 185: 7573–7582. [公共医学][谷歌学者]

45Takauji R、Iho S、Takatsuka H、Yamamoto S、Takhashi T等人（2002）CpG-DNA诱导的IFN-α生成涉及人浆细胞样树突状细胞前体中p38 MAPK依赖性STAT1磷酸化.白细胞生物学杂志 72: 1011–1019. [公共医学][谷歌学者]

46Pulverer JE、Rand U、Lienenklaus S、Kugel D、Zietara N等人（2010年）体内I型和III型干扰素应答的时间和空间分辨率.J维罗尔 84: 8626–8638.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

47Hayashi F，意指TK，Luster AD（2003）Toll样受体刺激人类中性粒细胞功能.血液 102: 2660–2669. [公共医学][谷歌学者]

48Tamassia N、Le Moigne V、Rossato M、Donini M、McCartney S等人（2008）在多聚（I:C）转染的人类中性粒细胞中激活免疫调节和抗病毒基因表达程序.免疫学杂志 181: 6563–6573. [公共医学][谷歌学者]

49Drescher B、Bai F（2013）病毒感染中的中性粒细胞，朋友还是敌人？病毒资源 171: 1–7.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

50Jenne CN、Wong CHY、Zemp FJ、McDonald B、Rahman MM等（2013）被招募到感染部位的中性粒细胞通过释放中性粒细胞外陷阱来保护免受病毒攻击.宿主与微生物 13: 169–180. [公共医学][谷歌学者]

51Saitoh T、Komano J、Saitoh-Y、Misawa T、Takahama M等人（2012年）中性粒细胞胞外陷阱介导宿主对人类免疫缺陷病毒-1的防御反应.宿主与微生物 12: 109–116. [公共医学][谷歌学者]

52Palic D、Andreasen CB、Ostojic J、Tell RM、Roth JA（2007）斑马鱼（Danio rerio）全肾试验用于测量中性粒细胞胞外陷阱释放和初级颗粒脱颗粒.免疫学方法杂志 319：87–97。[公共医学][谷歌学者]

53Colucci-Guyon E、Tinevez JY、Renshaw SA、Herbomel P（2011）体内专业吞噬细胞的策略：与巨噬细胞不同，中性粒细胞只吞噬表面相关微生物.细胞科学杂志 124: 3053–3059. [公共医学][谷歌学者]

54Yang CT、Cambier CJ、Davis JM、Hall CJ、Crosier PS等（2012）中性粒细胞通过氧化杀死从感染巨噬细胞吞噬的分枝杆菌对早期结核肉芽肿起保护作用.宿主与微生物 12: 301–312.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

55Navarini AA、Recher M、Lang KS、Georgiev P、Meury S等人（2006年）先天性抗病毒反应导致细菌重叠感染的易感性增加.美国国家科学院程序 103: 15535–15539.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

56Ronneseth A，Pettersen EF，Wergeland HI（2006）感染传染性胰腺坏死病毒（IPNV）的大西洋鲑鱼（Salmo salar L.）血液和头肾中的中性粒细胞和B细胞.鱼类贝类免疫 20: 610–620. [公共医学][谷歌学者]

57Chow A、Her Z、Ong EK、Chen JM、Dimatatac F等（2011）基孔肯雅病毒感染引起的持续性关节痛与白细胞介素-6和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子有关.感染性疾病杂志 203: 149–157.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

58Cuzzocrea S、Chatterjee PK、Mazzon E、Dugo L、De Sarro A等人（2002年）诱导性一氧化氮在缺血性损伤后炎症反应启动中的作用.休克 18: 169–176. [公共医学][谷歌学者]

59Genovese T、Cuzzocrea S、Di Paola R、Faila M、Mazzon E等人（2005年）抑制或敲除诱导型一氧化氮合酶导致对博莱霉素所致肺损伤的抵抗.回复Res 6: 58.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

60Zeidler PC、Millecchia LM、Castranova V（2004）诱导型一氧化氮合酶衍生一氧化氮在脂多糖加干扰素-γ诱导的肺部炎症中的作用.毒理学应用药理学 195: 45–54. [公共医学][谷歌学者]

61Orvedahl A、MacPherson S、Sumpter R Jr、Talloczy Z、Zou Z等人（2010年）自噬保护中枢神经系统免受Sindbis病毒感染.宿主与微生物 7: 115–127.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

62Stetson DB，Medzhitov R（2006年）宿主防御中的I型干扰素.免疫 25: 373–381. [公共医学][谷歌学者]

63Jeong JY、Kwon HB、Ahn JC、Kang D、Kwon-SH等（2008）斑马鱼血脑屏障的功能和发育分析.Brain Res公牛 75: 619–628. [公共医学][谷歌学者]

64Murooka TT、Deruaz M、Marangoni F、Vrbanac VD、Seung E等人（2012年）HIV感染的T细胞是病毒传播的迁移载体.自然 490：283-287。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

65Sewald X、Gonzalez DG、Haberman AM、Mothes W（2012）病毒学突触的体内成像.国家公社三: 1320.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

66Hickman HD、Reynoso GV、Ngudiankama BF、Rubin EJ、Magadán JG等（2013）皮肤固有免疫细胞和适应性免疫细胞的协同抗病毒活性受到解剖限制.宿主与微生物 13: 155–168.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

67Westerfield M（2000）斑马鱼图书：斑马鱼实验室使用指南(达尼奥雷里奥). 科瓦利斯：俄勒冈大学出版社。

68Levraud JP、Colucci-Guyon E、Redd MJ、Lutfalla G、Herbomel P（2008）斑马鱼天然免疫的体内分析.分子生物学方法 415: 337–363. [公共医学][谷歌学者]

69Traver D、Paw BH、Poss KD、Penberthy WT、Lin S等人（2003）斑马鱼无血突变体的多系移植及体内成像.自然免疫 4: 1238–1246. [公共医学][谷歌学者]

70Park HC、Kim CH、Bae YK、Yeo SY和Kim SH等人（2000年）HuC启动子上游元件的分析导致转基因斑马鱼荧光神经元的建立.求文献一篇 227: 279–293. [公共医学][谷歌学者]

71Bernardos RL，Raymond PA（2006年）GFAP转基因斑马鱼.基因表达谱 6: 1007–1013. [公共医学][谷歌学者]

72Dong PD、Munson CA、Norton W、Crosnier C、Pan X等人（2007）Fgf10调节肝胰腺导管系统的模式和分化.自然基因 39: 397–402. [公共医学][谷歌学者]

73Renshaw SA、Loynes CA、Trushell DM、Elworthy S、Ingham PW等人（2006年）一种转基因斑马鱼中性粒细胞炎症模型.血液 108: 3976–3978. [公共医学][谷歌学者]

74Ellett F、Pase L、Hayman JW、Andrianopulos A、Lieschke GJ（2011）mpeg1启动子转基因在斑马鱼中的直接巨噬细胞系表达.血液 117：第49页至第56页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

75Suster ML、Kikuta H、Urasaki A、Asakawa K、Kawakami K（2009）tol2转座子系统在斑马鱼中的转基因.分子生物学方法 561: 41–63. [公共医学][谷歌学者]

76Ellett F，Lieschke GJ（2012）斑马鱼胚胎荧光白细胞数量的计算量化.酶学方法 506: 425–435. [公共医学][谷歌学者]

77Svoboda KR、Linares AE、Ribera AB（2001年）活动调节斑马鱼Rohon-Beard神经元的程序性细胞死亡.开发 128: 3511–3520. [公共医学][谷歌学者]

78Greiser-Wilke I，Moening V，Kaaden OR，Figueiredo LT（1989年）大多数α病毒在其核衣壳蛋白上共享一个保守的表位区.J Gen Virol公司 70(第3部分) 743–748. [公共医学][谷歌学者]

79Covassin L、Amigo JD、Suzuki K、Teplyuk V、Straubhaar J等人（2006）斑马鱼造血和血管内皮基因表达的组织特异性微阵列分析.求文献一篇 299: 551–562.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

80Thisse C、Thisse B（2008）全山斑马鱼胚胎的高分辨率原位杂交.Nat协议三: 59–69. [公共医学][谷歌学者]

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