干扰素反应因子3和7对基孔肯雅病毒出血热和休克的保护作用

小鼠感染和监测。

用CHIKV（LR2006-OPY1）接种小鼠（6-12周龄），如前所述测定病毒滴度和足肿胀(15). 小鼠接种CHIKV（4 log₁₀50%细胞培养感染剂量₅₀]在40μl RPMI 1640中添加2%胎牛血清），通过浅皮下注射（皮下注射）到跖骨区每只后脚的顶部，朝向外侧，朝向脚踝注射。通过使用数字卡尺测量后脚跖骨区域的高度和宽度来监测关节炎（足部肿胀），并将其表示为第0天与同一只脚相比，每只脚的足部高度乘以宽度增加的百分比的组平均值。通过敏感生物测试，在病毒制剂中未检测到支原体或内毒素污染(23,28). 动物工作按照良好动物规范（澳大利亚NHMRC）进行，并得到昆士兰医学研究所（QIMR）动物伦理委员会的批准。

临床测量。

使用数字温度计（Digitech，Rydalmere，澳大利亚）和2 mm热电偶珠探头测量体温，将其轻轻压入受约束小鼠后腿的凹坑中约30 s，腿折叠在探头上。通过收集和称重小鼠被约束后~1分钟内产生的尿液，测量抓握粪便引起的排尿后的尿量。用血细胞仪和肝素化血液在磷酸盐缓冲的1%草酸铵溶液中稀释1/20测定血小板计数。使用标准红细胞压积管（澳大利亚新南威尔士州北莱德的Becton Dickinson）测量红细胞压比，并以与对照未感染小鼠的百分比差异表示。

细胞因子和趋化因子分析。

根据制造商的说明，使用BD细胞因子珠阵列生物分析仪系统（Becton，Dickinson，Franklin Lakes，NJ）分析血清细胞因子和趋化因子蛋白水平。如前所述，通过使用Semliki Forest病毒感染L-929细胞的细胞病变抑制生物测定来测量生物活性IFN-α/β(15).

组织学。

组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，双脚脱钙（15%EDTA置于0.1%磷酸盐缓冲液中10天以上），组织包埋在石蜡中，6μm厚的切片被切割并用苏木精-伊红染色。使用Aperio Scan Scope XT数字幻灯片扫描仪扫描幻灯片（Aperio，Vista，CA）。

现场杂交。

450-bp地高辛标记的CHIKV探针序列（GenBank编号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“DQ443544.2”，“term_id”：“116047549”}}DQ443544.2号文件; 将核苷酸7371～7818）与石蜡切片杂交，用碱性磷酸酶结合的抗igoxigenin抗体检测。RRV相应区域作为阴性对照。有关详细信息，请参阅补充材料中的文件S1。

实时定量RT-PCR。

基本上如前所述进行RT-PCR(15). 有关详细信息，请参阅补充材料中的文件S1。

MEF感染。

红外线3^−/−，IRF7^−/−和IRF3/7^−/−MEF被播种（2×10⁵用指示量的重组小鼠IFN-α（Hycult Biotech，Uden，the Netherlands）处理过夜，然后感染CHIKV（感染多重性[MOI]=0.1）2小时。清洗和培养细胞，24小时后检测上清液的病毒滴度。

CHIKV感染后足肿胀。

我们之前已经证明，WT小鼠在接种CHIKV后的第6天或第7天会产生可测量的足部肿胀和关节炎(15). IRF3的类似感染^−/−，IRF7^−/−和IRF3/7^−/−小鼠也会导致足部肿胀，但肿胀发生得更早（第2天到第4天），在IRF3中稍显明显^−/−小鼠，在IRF7中明显更明显^−/−小鼠，在IRF3/7中更为明显^−/−小鼠(图1E和​和FF类).

将热灭活CHIKV（60°C，30分钟）注入IRF3/7^−/−或WT小鼠未导致任何明显肿胀（数据未显示）。尽管皮下（皮下）接种CHIKV（尾巴底部）不会导致WT小鼠的足部肿胀(15)，这种感染途径确实导致IRF3/7的足部肿胀^−/−小鼠（数据未显示）。IRF3/7死亡率^−/−小鼠在皮下接种病毒时没有变化（数据未显示）。

CHIKV感染的IRF3/7中IFN-α/β缺失，IFN-γ、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF）升高^−/−老鼠。

CHIKV感染后，在WT小鼠中检测到高水平的血清IFN-α/β（通过生物测定测定）(图2A)，如前所述(15). 红外线3^−/−小鼠血清IFN-α/β水平与WT小鼠相当。然而，在IRF7中仅检测到低水平的血清IFN-α/β^−/−第2天，小鼠血清IFN-α/β低于IRF3/7的检测水平^−/−小鼠(图2A). 感染后第2天足部的实时定量RT-PCR与这些发现类似，排名如下：IFN-αmRNA水平，WT>IRF3^−/−>IRF7型^−/−>IRF3/7型^−/−老鼠；对于IFN-βmRNA水平，WT>IRF3^−/−=IRF7^−/−>IRF3/7型^−/−老鼠；对于IFN-βmRNA，仅在IRF3/7中诱导低水平^−/−小鼠(图2B).

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图2

CHIKV感染小鼠外周血中的细胞因子和趋化因子水平。（A） 重量，IRF3^−/−，IRF7^−/−和IRF3/7^−/−用CHIKV感染小鼠，在指定时间采集外周血样本，并检测指定的细胞因子或趋化因子水平。IFN-α/β生物测定的检测限为～1 IU/ml。IRF3/7中的水平^−/−小鼠在第2天和第3天的所有细胞因子和趋化因子、第1天的IFN-α/β和第4天的TNF方面与WT小鼠显著不同(P（P）<0.034，Mann-Whitney U试验）。第2天IRF7的IFN-α/β水平也显著升高^−/−小鼠比IRF3/7^−/−小鼠(P（P）<0.008，Mann-Whitney U检验）(n个＝每组4至6个）。（B） 感染后第2天足部IFN-αs和IFN-βmRNA的定量实时RT-PCR。数据归一化为RPL13A（管家基因）(15)，并减去未感染足部的值(n个=每组6至8个）。所有差异均显著(P（P）<0.03）除了IRF3中的IFN-β^−/−和IRF7^−/−老鼠。

这些观察结果表明IRF7是CHIKV感染后IFN-α/β生成的主要转录因子，其他病毒感染也有报道(9,22). IRF7中可见少量IFN-α/β^−/−小鼠似乎足以控制病毒血症(图1B)防止死亡(图1A)可能与α病毒的高度敏感性相一致(35)，包括CHIKV到IFN-α/β(55)（请参见图6).

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图6

干扰素-α治疗和IRF7诱导。（A） IRF3/7型^−/−小鼠(n个=3）用10⁴感染CHIKV前1天静脉注射IFN-αIU，并随时间监测存活率（IRF3/7^−/−+IFN-α）并与感染的IRF3/7进行比较^−/−未接受IFN-α的小鼠(n个=24）（对数秩检验，P（P）= 0.001). （B） 来自IRF3/7的MEF^−/−、IRF3^−/−，IRF7^−/−和WT小鼠在体外在CHIKV感染前隔夜使用指定浓度的IFN-α（MOI=0.1）。清洗后，将细胞培养24小时，然后对上清液进行病毒滴度分析(n个= 3). （C） RPL13A标准化CHIKV感染足IRF3和IRF7 mRNA表达的实时定量RT-PCR(n个= 6). 水平表示为相对于第0天的水平。

此外，还测定了CHIKV感染小鼠的血清炎性细胞因子和趋化因子水平。IRF3/7型^−/−与WT小鼠相比，小鼠的IFN-γ、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1，也称为CCL2）、白细胞介素-6（IL-6）（均在第2天达到峰值）和肿瘤坏死因子（TNF）（从第2天到第6天升高）水平显著升高(图2A). 感染后第2天，IRF3/7血清^−/−与WT小鼠相比，小鼠的IFN-γ含量增加了50倍以上，MCP-1、IL-6和TNF含量增加了约10倍(图2A). 在IRF3中^−/−和IRF7^−/−小鼠，这些介质的水平与WT小鼠没有显著差异(图2A). 血清IL-12和IL-10水平没有显著变化，在任何小鼠菌株中都没有检测到IL-1β（数据未显示）。IRF3/7中未检测到血清IFN-α/β^−/−因此，小鼠似乎与高水平的IFN-γ和高水平的其他炎症介质有关。

IRF3/7死亡率^−/−小鼠出现严重水肿和出血。

深入了解IRF3/7死亡率的机制^−/−小鼠，在感染后第5天对许多组织进行组织学分析。足部肿胀与严重的全身性水肿和多灶性严重出血相关，最严重的病变位于真皮和皮下组织深处(图3A到​至C）。C类). （未感染IRF3/7的皮肤和皮下组织^−/−老鼠如图所示图3D）IRF7中也有一些出血^−/−小鼠（数据未显示），但在IRF3中未发现^−/−感染后第5天（见补充材料中的S2A和B文件）或感染后第7天的小鼠（未显示数据）或WT小鼠(15). 水肿在IRF7中标记^−/−小鼠，但比IRF3/7轻^−/−小鼠（数据未显示）。IRF3也有水肿^−/−感染后第5天（见补充材料中的S2A文件）和感染后第7天的小鼠（数据未显示）和WT小鼠(15).

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图3

IRF3/7的组织学^−/−CHIKV感染后的小鼠。（A） 感染CHIKV后5天的足部皮下组织显示严重的全身水肿（星号）和严重的多灶性出血（箭头所示）。（B） A组底部扩大，显示水肿（星号）和出血（箭头）。（C） 第5天的血管炎，特征是血管壁纤维蛋白样坏死（n）和壁内变性白细胞（箭头所示）。存在一些中性粒细胞（白色箭头）和单核细胞（黑色箭头）；补充资料中的文件S5显示了放大的图像。（D） 未感染IRF3/7的足部皮下组织^−/−鼠标。（E） IRF3/7感染后5天局部皮肤坏死^−/−CHIKV小鼠。角质形成细胞明显发生气球状变性，胞质苍白，细胞核断裂（箭头所示）。（F） 未感染IRF3/7的皮肤^−/−老鼠。（G） 渗出性关节炎在IRF3/7的关节中表现明显^−/−小鼠感染CHIKV后5天。滑膜间隙（SS）中存在炎症细胞和纤维蛋白（箭头所示）。显示关节软骨（C）。（H） 来自未感染IRF3/7的关节软骨^−/−鼠标。标签如图G所示。（I）未感染IRF3/7的骨骼肌^−/−鼠标。（J） IRF3/7骨骼肌^−/−小鼠感染后第5天。（K） IRF7骨骼肌^−/−小鼠感染后第5天。（五十） IRF3骨骼肌^−/−感染后第5天的小鼠。

IRF3/7型^−/−小鼠出现多灶性明显血管炎，特征是血管壁纤维蛋白样坏死，中性粒细胞核碎裂，表明壁内白细胞增多（血管壁内退化的白细胞），血管周围纤维蛋白渗出和红细胞外渗(图3C). 在感染后第5天（见补充材料中的文件S2C）和感染后第7天，WT小鼠的这种损伤是轻微的或不存在(15). CHIKV感染的IRF3/7的死亡率^−/−小鼠(图1A)因此似乎与严重水肿、出血和坏死性血管炎有关。

IRF3/7表皮可见散在的明显皮肤坏死灶，并形成大疱^−/−小鼠(图3E)这种病变在IRF7中很少见或很轻微^−/−IRF3中未观察到的小鼠^−/−小鼠（数据未显示）或WT小鼠（参见补充材料中的文件S2E）。（未感染IRF3/7的表皮^−/−小鼠如所示图3F渗出性关节炎明显，IRF3/7关节滑膜中存在炎症细胞和纤维蛋白^−/−小鼠(图3G). IRF3中未观察到此类病变^−/−感染后第5天的小鼠（数据未显示）或WT小鼠（参见补充材料中的S2D文件），但在感染后第7天的WT小鼠中存在(15). 未感染IRF3/7的关节组织^−/−小鼠如所示图3HIRF3/7中的肝、脾、肌肉、淋巴结、肾、肺、肠和脑^−/−感染后第5天对小鼠进行检查。除了一些肺实变、轻微的白细胞血管周围袖带和轻微的脑毛细血管周围水肿、轻度水肿（见下文）和肌肉组织轻度局灶性出血外，未发现其他明显损伤（数据未显示）。

CHIKV感染的IRF3/7细胞浸润少，肌内膜水肿多^−/−老鼠。

IRF3/7肿胀的足部仅可见少量细胞浸润^−/−小鼠(图3A到​至C）。C类). 这在IRF3/7的骨骼肌中很明显^−/−小鼠（比较未感染小鼠的肌肉[图3I]感染了病毒[图3J]小鼠），并与IRF7中的大量浸润形成对比^−/−(图3K)、IRF3^−/−(图3L)和WT小鼠在感染后第5天（见补充材料中的文件S2F和G）和感染后第7天(15). 肌肉纤维坏死在后三只小鼠中也很明显(图3K和​和L）L（左）)（见补充材料中的S2F文件）(15)可能是由于巨噬细胞的浸润(32).

CHIKV感染的IRF3/7的肌肉组织^−/−小鼠偶尔出现心肌细胞碎片(图3J箭头所示）和实质性肌内膜水肿（肌细胞间液体增加）（比较图3I和​和J），J型)，在IRF7中较轻^−/−小鼠(图3K)在IRF3肌肉中不明显^−/−小鼠(图3L)或WT小鼠（参见补充材料中的文件S2F和G）(15).

病毒复制的组织定位就地杂交。

尽管单核细胞/巨噬细胞感染，但成年WT动物中CHIKV感染的细胞尚未被广泛描述(21,27)，肌肉卫星细胞(40)和成纤维细胞(53)已在灵长类动物中观察到。现场感染后第3天WT足的杂交表明，在以下组织的细胞质中可以检测到CHIKV RNA；（i） 血管内壁细胞的形态和位置与内皮细胞一致(图4A)，（ii）骨骼肌细胞(图4B)真皮中罕见的细胞，其形态与成纤维细胞和巨噬细胞一致(图4C)，（iv）滑膜细胞(图4D)和（v）骨膜细胞(图4E). 在IRF3/7中^−/−感染后第3天，小鼠血管和肌纤维内的细胞也被染色(图4F和​和G）。G公司). 真皮中也发现阳性细胞（大多数为成纤维细胞和单核细胞形态），但在IRF3/7中数量更多^−/−小鼠(图4H). 真皮中的一些附件皮脂腺也染色阳性(图4H，插图）。IRF3/7关节软骨中也可见大量阳性染色细胞（位置和形态与软骨细胞一致）^−/−小鼠(图4I)，但这种染色在WT小鼠中不明显（数据未显示）。IRF3/7滑膜中未检测到阳性细胞^−/−小鼠（数据未显示）。

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图4

CHIKV RNA的检测就地杂交。CHIKV RNA检测方法为就地CHIKV感染的WT小鼠组织中的杂交（i）感染后3天（A到E），（ii）IRF3/7^−/−小鼠感染后3天（F至I），（iii）WT小鼠感染后5.5天（J至N），以及（iv）IRF3/7^−/−小鼠感染后5.5天（O至S）。显示血管壁（A、F、J和O）（RBC、红细胞）、骨骼肌（B、G、K和P）、皮肤（C、H、N和S）、滑膜（D）、骨膜（E）、关节软骨（I）、真皮（L和Q）、血管内细胞（M）和结缔组织（R）的染色。补充材料中的文件S6显示了选定单元格的放大图像以及更详细的描述。

在第5.5天的WT小鼠中，血管壁细胞继续呈阳性染色(图4J). 然而，肌肉中的染色不再明显(图4K). 真皮中仍有成纤维细胞和单核细胞形态的阳性染色细胞(图4L)后者偶尔出现在血管中(图4M). 结缔组织中偶尔也有巨噬细胞和成纤维细胞形态的细胞（数据未显示）。表皮未见染色(图4N). 在IRF3/7中^−/−小鼠，血管内壁细胞(图4O)，肌肉细胞(图4P)，具有成纤维细胞形态的真皮细胞(图4Q)和结缔组织中具有单核细胞形态的细胞(图4R)继续被污染。表皮IRF3/7染色阳性^−/−几个地区的老鼠(图4S)提示角质形成细胞感染。在WT小鼠中未观察到这种染色（数据未显示）。

使用（i）来自未感染小鼠的组织，（ii）编码罗斯河病毒（RRV）相同区域的反义探针，或（iii）CHIKV有义探针（数据未显示）未获得染色。在α病毒感染中，用感测探针检测到的负链RNA比阳性RNA寿命短，含量少。

IRF3/7感染细胞的模式和类型^−/−因此，小鼠似乎与WT小鼠感染的小鼠不同。在IRF3/7中^−/−小鼠、关节软骨细胞和更多皮肤成纤维细胞在第3天出现感染，第5.5天出现持续的骨骼肌感染和表皮感染。尽管在IRF3/7中很容易检测到出血^−/−（但在WT）小鼠中，IRF3/7的血管衬里细胞感染似乎没有更广泛^−/−与WT小鼠相比（比较图4A具有图4F和图4J具有图4O; 数据也未显示）。

CHIKV感染IRF3/7的临床症状^−/−小鼠符合失血性休克。

IRF3/7感染后第2天^−/−在小鼠中，观察到一种伴随病毒血症高峰的显著发热（在CHIKV患者中也可以看到这种伴随现象[57])第3天和第4天体温急剧下降(图5A). 体温过低是低血容量性休克的标志，从发热到体温过低的突然变化也是即将发生登革热休克综合征（DSS）的预测因素(44). 感染CHIKV的WT小鼠没有出现可检测到的发热，感染后第4天或第5天的体温也没有显著下降，尽管在第3天明显出现轻微下降(图5A).

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图5

临床观察。（A） 用放在后腿凹坑中的热电偶测量体温(n个=每组4至16人）。IRF3/7型^−/−小鼠在第2天出现明显发烧(P（P）=0.004（第0天与第2天）。IRF3/7的温度也较高^−/−第2天小鼠比WT小鼠(P（P）= 0.01). IRF3/7的温度显著降低^−/−第4天和第5天，小鼠比WT小鼠(P（P）<0.001）。（B） 擦伤引起的尿量。第4天和第5天差异显著(n个=每组8至10）。（C） 血小板计数。IRF7中血小板计数显著降低^−/−在感染后第3、4和5天，与WT小鼠相比(P（P）= 0.001,P（P）<0.001，以及P（P）分别<0.001；t吨测试；n个=每组8至10）。（D） WT和IRF3/7的红细胞压积增加百分比^−/−感染后第5天小鼠与对照未感染小鼠的比较(P（P）< 0.001;n个=每组10或11）。所有统计数据均通过Mann-Whitney U检验获得。这些数据是从两到四个独立的实验中获得的。

IRF3/7的尿量^−/−与WT小鼠相比，感染后4至5天的小鼠显著减少（少尿）(图5B). 这也是低血容量性休克的一个特征(67)并在DSS中观察到(61).

在IRF3/7中观察到明显的血小板减少^−/−感染后4至5天的小鼠，血小板计数平均下降～70%，降至<300×10³/微升(图5C). 人类血小板计数的正常范围为150×10³至400×10³/μl，远低于～1000×10³/μl见于C57BL/6小鼠(图5C). 在人类中，70%的下降将导致血小板计数为45×10³至120×10³/μl。血小板计数<100×10的血小板减少症³/μl是目前诊断登革热出血热/登革热休克综合征（DHF/DSS）的标准之一(56).

IRF3/7中红细胞压积的测量^−/−感染后第5天，小鼠平均增加15.8%（范围为7至24%）(图5D)而受感染的WT小鼠与未受感染的对照组相比没有明显变化(图5D). 红细胞压积升高表明血液浓缩和血浆泄漏。血细胞压积增加>20%是DHF/DSS的诊断标准(61).

CHIKV感染IRF3/7患者死亡前的临床特征^−/−小鼠的组织学检查（显示普遍水肿）强烈表明，这些动物的死亡是由于低血容量性休克所致。

干扰素-α/β受体缺陷（IFNAR^−/−)老鼠。

IFNAR的CHIKV感染^−/−小鼠的实验结果与IRF3/7相似^−/−小鼠（见补充材料中的文件S3），表明IFN-α/β（而不是其他IRF3/7依赖性）反应的丧失使动物易患失血性休克。

IRF3/7型^−/−接种疫苗可以保护小鼠。

用灭活CHIKV全保护IRF3/7接种^−/−小鼠对抗病毒血症和疾病，表明IRF3/7的死亡率^−/−CHIKV感染后的小鼠并非由于抗体反应缺陷所致（参见补充材料中的文件S4）。

IRF3/7的预防性IFN-α治疗^−/−小鼠未能防止死亡。

10时的干扰素-α³如果在CHIKV攻击前给予IU（静脉注射），则可显著降低成年WT小鼠的病毒血症并预防疾病(15). 注射（静脉）10倍以上的剂量（10⁴IU）转化为IRF3/7^−/−感染前的小鼠只能将死亡率延迟24至48小时；虽然这很重要，但所有的老鼠最终都死了(图6A). 足部肿胀也延迟了约24小时，但未得到预防（数据未显示）。

过继转移WT脾细胞或WT脾CD11b⁺细胞进入IRF3/7^−/−小鼠出现延迟，但无法防止死亡（数据未显示），这与造血细胞不能产生足够的IFN-α/β来保护小鼠免受CHIKV感染的观察结果一致(51).

IFN-α治疗不能有效抑制IRF3/7中CHIKV的复制^−/−MEF公司。

预防性IFN-α治疗对IRF3/7中CHIKV介导的死亡率的预防作用^−/−小鼠(图6A)也许令人惊讶。因此，我们研究了IFN-α减少IRF3/7中CHIKV复制的能力^−/−细胞在体外，通过处理来自IRF3/7的MEF^−/−干扰素-α浓度范围的小鼠。然后用CHIKV感染细胞，并测量病毒产生量。在IFN-α浓度≥10 IU/ml的情况下，WT-MEFs产生的CHIKV滴度显著降低(图6B) (t吨测试，P（P）< 0.006). 相反，IRF3/7对CHIKV滴度没有显著影响^−/−MEF直到使用1000 IU/ml IFN-α(图6B) (t吨测试，P（P）= 0.028). IRF7型^−/−MEF表现出中间表型，需要使用100 IU/ml IFN-α进行治疗，然后CHIKV滴度显著降低(图6B)（Mann-Whitney U试验，P（P）= 0.037). IRF3中的CHIKV滴度^−/−MEF与WT MEF无显著差异。IRF3/7型^−/−因此，MEF需要用100倍以上的IRF7进行处理^−/−在CHIKV滴度显著降低之前，MEF含有10倍以上的IFN-α。

CHIKV感染后WT小鼠IRF7 mRNA上调>100倍。

IRF7（而不是IRF3）的上调对于IFN-αs的正反馈和诱导是重要的，IFN-αs在MEFs中病毒感染后产生强大的IFN-α/β反应(33,48,49). IRF7对CHIKV感染后最佳IFN-α/β生成的可能重要性也由IRF7中血清IFN-α／β生成的低水平提示^−/−CHIKV感染小鼠(图2A). 对CHIKV感染WT小鼠足的定量RT-PCR分析表明，感染CHIKV后IRF7 mRNA（而非IRF3 mRNA）上调了100倍以上(图6C). （IFN-α治疗也上调了MEFs中IRF7 mRNA的表达[数据未显示]。）非造血细胞中IRF7mRNA的上调(51)因此，CHIKV感染后可能会促进IFN-α/β的生成，并对疾病的恶化起到保护作用。这些数据还表明，预防性IFN-α治疗WT小鼠CHIKV的一项重要活动是上调IRF7，而不是诱导抗病毒状态。

我们感谢Clay Winterford（Histotechnology Facility）和动物馆工作人员（QIMR）的大力支持，以及M.S.Diamond提供的敲除小鼠。

这项工作由澳大利亚国家医疗服务委员会资助。设备由昆士兰热带健康联盟资助，并由澳大利亚皇家空军协会Ed Westaway捐赠。A.S.和A.A.K.是NHMRC的研究员，P.A.R.是加拿大卫生研究院的博士后研究员。

资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。