基孔肯雅病小鼠模型：年轻和I型干扰素信号无效是严重疾病的危险因素

干扰素-α/βR^+/−和干扰素-α/βR^−/−动物分别提供轻度和重度CHIKV感染的体内模型

新生小鼠而非成年小鼠可以感染CHIKV，这排除了小鼠体内存在难以控制的物种屏障。它还质疑老鼠成年后不允许的本质。以CHIKV和其他α病毒触发I型IFN合成的成熟能力及其对I型IFN-反应的敏感性为指导[20–24]，我们测试了成人干扰素-α/βR基因敲除（IFN-α/β^−/−)小鼠朝向CHIKV。

与WT成年小鼠相比，所有感染IFN-α/βR的小鼠^−/−成年小鼠出现了一种严重的疾病，其特征是四肢肌肉无力（即肌肉张力丧失）和嗜睡，并在D3pi死亡(图2A） ●●●●。而接种10⁶CHIKV-21的PFU，致死剂量50（LD₅₀)在成人IFN-α/βR中为3 PFU^−/−成年小鼠，平均存活3±0.2天。感染IFN-α/βR时也获得了类似的结果^−/−来自La Réunion的另外两个分离物（CHIKV-27和−115）和来自刚果的一个非洲分离物（CHAIKV-117）的成年小鼠（未公布数据）。总之，这些结果表明，WT成年小鼠对CHIKV的耐药性的基础与I型干扰素信号有关，因此干扰素是控制CHIKV感染的关键因素。

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图2

从干扰素α/β途径的完整性看小鼠CHIKV感染

（A） 接种10只小鼠的存活率⁶通过ID路由的CHIKV PFU(n个=每类6）。（B） 干扰素-α/βR中的病毒滴度^−/−，干扰素-α/βR^+/−和WT成年小鼠通过ID途径感染20，10⁶、和10⁶PFU。在指定的时间点，处死小鼠，用TCID50定量血清和组织中的感染病毒数量。每个数据点代表至少四只小鼠的算术平均值±SD。虚线表示检测阈值。

接下来我们研究了WT和IFN-α/βR组织中CHIKV的复制^−/−成年小鼠通过ID途径接种。作为IFNAR-α/βR^−/−成年小鼠对CHIKV感染高度敏感，我们给它们接种了大约10个LD₅₀，即20个PFU，而我们给WT小鼠接种了10个⁶PFU，并测定不同时间点小鼠组织中病毒载量pi。未从H3、H16的WT小鼠组织中分离出CHIKV,H32、D3pi或D6pi(图2B和未发布的数据）。在干扰素-α/βR中^−/−在H16π小鼠中，仅在肝脏中检测到感染病毒。在D3π时，它在肌肉、关节、皮肤和大脑中被大量检测到，血清、肝脏和脾脏中也存在高病毒滴度(图2B） ●●●●。刚果分离物CHIKV-117也获得了类似的结果（未公布的数据）。

为了寻找一种反映主要在人类成年人中观察到的轻度疾病的非致命性CHIKV感染模型，我们评估了IFN-α/βR的疾病发病机制^+/−成年小鼠。在干扰素-α/βR中^+/−经FACS分析（未公布的数据）评估，成年小鼠表达IFN-α/βR的水平与野生动物相似，感染10只后未观察到死亡或嗜睡⁶CHIK-21的PFU(图2A） ●●●●。然而，与在WT成年小鼠中观察到的情况相反，早在H16时，感染病毒就从肝脏中回收，其滴度与IFN-α/βR的滴度相似^−/−受感染的小鼠(图2B） ●●●●。令人惊讶的是，在D3pi，感染病毒仅限于肌肉和关节(图2B） 之后，病毒被清除，并通过D6pi（未公布的数据）达到无法检测的水平。这些数据表明，I型干扰素受体基因的剂量效应控制成年小鼠对CHIKV的耐受性水平，其中干扰素-α/βR^+/−和干扰素-α/βR^−/−成年小鼠分别出现轻度和重度感染。正如在人类临床病例中观察到的那样，轻度疾病对应于主要针对骨骼肌和关节的外周感染，而重度疾病也与病毒传播到其他器官，包括中枢神经系统有关。

小鼠CHIKV细胞趋化性

接下来，我们研究了CHIKV在H16π肝脏和周围感染组织中的细胞向性，即肝脏、骨骼肌、关节和皮肤在D3π。感染成人IFN-α/βR的肝脏^−/−小鼠在H16π时，在窦状毛细血管内皮细胞中检测到CHIKV抗原的弱标记(图S1A–S1（第一阶段）C） 以及一些F4/80标记的成熟巨噬细胞(图S1D–S1（第一阶段）F） 而在D3pi，与肝脏和血清病毒载量的急剧增加相一致，CHIKV免疫标记更为强烈和弥漫，并在窦状毛细血管内和周围共存(图S1G–S1（第一阶段）一） ●●●●。通过对相同感染肝脏切片的透射电镜分析，获得了确证性结果。这些图像显示大量CHIKV颗粒在窦状毛细血管内皮细胞表面萌芽(图S2A） ●●●●。还发现少量病毒颗粒与库普弗细胞表面（箭头）或出芽有关(图S2B） ●●●●。为了进一步研究病毒在这种细胞类型中的复制，我们分离了原代肝巨噬细胞并在体外感染它们。虽然只观察到低水平的病毒复制，但我们确实得出结论，肝巨噬细胞能够被CHIKV感染(图S1J） ●●●●。相反，脑源性小胶质细胞对感染不敏感，表明巨噬细胞不是感染的一般靶点(图S1J） ●●●●。在脾脏中，仅在红髓中观察到病毒抗原的免疫标记，尤其是在F4/80阳性细胞中（未发表数据）。

感染成人IFN-α/βR的骨骼肌^−/−小鼠和低强度IFN-α/βR^+/−小鼠，CHIKV免疫标记主要在结缔组织中观察到，尤其是在外部区域，即肌表膜（也称为肌筋膜），在肌周和肌内膜中观察到的程度较低(图3A–三C） ●●●●。与这些观察结果一致，肌膜外的病毒载量高于肌膜周/肌内膜（未公布的数据）。肌肉中的主要靶细胞是成纤维细胞，如细胞形态及其与抗波形蛋白和抗CHIKV抗体的联合免疫标记所示(图S3)免疫标记细胞周围没有基底层(图3A–三C） ●●●●。在肌表膜和肌周也观察到少量免疫标记的F4/80阳性巨噬细胞，它们主要分布在与成纤维细胞紧密接触的中等大小动脉和静脉周围（未公布数据）。与最近对人体材料进行的研究一致[25]，罕见的卫星细胞也被免疫标记（箭头位于图3B） 很容易识别为位于肌纤维基底层下方的小单核细胞。在骨骼肌中，肌纤维没有用抗CHIKV抗体进行免疫标记。

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图3

小鼠CHIKV细胞和组织嗜性

干扰素-α/βR^−/−接种20 PFU和IFN-α/βR的小鼠ID^+/−ID接种10⁶在D3pi处死PFU路径。在IFN-α/βR组织冰冻切片上进行多重免疫染色^−/−小鼠（A到G）和IFN-α/βR^+/−小鼠（I）和IFN-α/βR关节的透射电镜^−/−小鼠（H）。Hoechst染色的细胞核呈蓝色，CHIKV呈红色（A至G和I）。基底层（IV型胶原）（A至D）和间充质细胞（波形蛋白）（I′）呈绿色。在所有这些图片中，条形图为10μm。肌肉成纤维细胞，特别是不被基底膜包围的细胞，在骨骼肌（a）的肌表膜（箭头）和肌内膜（箭头）中显示出强烈的CHIKV免疫染色。在骨骼肌（B和C）的肌内膜中，成纤维细胞（箭头）和极少数卫星细胞（箭头所示）容易识别为位于肌纤维基底层下方的单个单核细胞，并被标记为CHIKV抗原。在真皮深层（D和E）和关节囊（F和G）中也对成纤维细胞进行了CHIV免疫染色。（H） 接触的病毒颗粒（H和H′中的箭头）以及结缔组织细胞细胞质内的病毒颗粒的透射电子显微镜视图，由于周围没有基底层和相邻的I型胶原纤维，因此被确定为成纤维细胞。IFN-α/βR骨骼肌CHIKV阳性感染细胞^+/−小鼠（I），被鉴定为成纤维细胞，因为它们不被基底膜包围，并且表达波形蛋白（I′）。

在干扰素-α/βR中^−/−D3pi成年小鼠滑膜壁下关节结缔组织的成纤维细胞也受到感染(图3F–三H） 但深关节和骨组织（即软骨细胞、骨细胞和成骨细胞）均未感染。皮肤深层的成纤维细胞中也观察到病毒抗原(图3D、，​D、 3E）。三E） ●●●●。在干扰素-α/βR中^+/−在D3pi成年小鼠关节结缔组织的成纤维细胞中也检测到病毒抗原(图3一） 和皮肤（未公布的数据），但其水平低于IFN-α/βR^−/−老鼠。

新生儿感染的外周组织（包括肌肉、关节和皮肤）中的病毒细胞向性与成年小鼠相似，对成纤维细胞具有明显的向性(图4A–4C） ●●●●。显著差异是存在严重坏死性肌炎，与严重肌纤维坏死和炎症一致，表现为淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞的浸润(图4D、，​D、 4E）。4E） ●●●●。重要的是，我们对原代小鼠和人类肌肉成纤维细胞的体外实验证实了这种细胞类型对CHIKV的高度许可性（未公布的数据）。

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图4

小鼠新生儿CHIKV细胞和组织嗜性

90岁的干扰素-α/βR^+/+小鼠感染了10只⁶通过ID路由的CHIKV PFU。免疫标记波形蛋白（B）和CHIKV（C）的感染肌肉结缔组织重叠图像（A）。骨骼肌纵切面苏木精-伊红染色（D）显示严重坏死性肌炎，肌纤维大量浸润和坏死。肌肉（E）和大脑（F）切片上CHIKV抗原（红色）和细胞核（蓝色）的免疫染色。注意，肌内膜显示出强烈的CHIKV免疫标记，以及软脑膜细胞。棒材为10μm。

为了研究血白细胞是否是体内CHIKV的靶细胞，感染IFN-α/βR的外周血单核细胞^−/−感染过程中获得的小鼠（D1至D3pi）用抗CHIKV和全尿造血细胞标记物（CD45.2抗体）进行双重染色，并用流式细胞仪进行分析。在受感染小鼠的血液中未检测到受感染的白细胞，这表明血液白细胞并不代表体内CHIKV的重要细胞靶点（未发表的数据），这在体外也有报道[26].

总之，这些数据表明，在成人IFN-α/βR感染的外周组织中^+/−和干扰素-α/βR^−/−小鼠和WT新生儿的成纤维细胞是CHIVV的主要靶细胞。

CHIKV向中枢神经系统的传播

接下来我们研究了CNS的组织病理学和CHIKV感染。IFN-α/βR的唯一组织病理学发现^−/−中枢神经系统水平的小鼠脉络丛上皮细胞和相邻的室管膜细胞出现严重的空泡化(图5A） ●●●●。脉络丛、室管膜壁和软脑膜细胞，包括Virchow-Robin间隙中的外部细胞，均被CHIKV强烈染色，而脑实质未显示明显的标记(图6). 我们在小胶质细胞和星形胶质细胞中没有观察到CHIKV免疫标记，包括那些形成胶质限制器（未发布的数据）。形成血-脑-脊髓液（CSF）屏障的脉络丛受到感染(图6D） ●●●●。相反，构成血脑屏障（BBB）的微血管内皮细胞没有(图6A、 箭头）。感染IFN-α/βR的脑膜病毒滴度^−/−是全脑的5倍(图5B） ●●●●。在感染WT小鼠新生儿的CNS中，也在软脑膜水平检测到CHIKV感染(图4F） 但在这里，脑实质没有检测到感染。

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图5

CHIVV靶向脉络丛和脑膜组织，但不影响IFN-α/βR中BBB的通透性^−/−老鼠

小鼠通过ID途径感染20个CHIKV PFU，并在D3pi处死。（A） 脑苏木精和伊红染色显示脉络丛上皮细胞严重空泡化（B）。用TCID50对分离脑膜和全脑中存在的感染病毒数量进行定量。每个数据点代表至少三只小鼠的算术平均值±SD(*第页< 0.05). （C） 静脉注射VI型HRP后感染和模拟感染小鼠的代表性脑切片显示血脑屏障的完整性，因为没有任何残留在血管中的染色物泄漏。作为阳性对照，显示了嗜神经酵母诱导的HRP泄漏（箭头）新生隐球菌，已知其会破坏血脑屏障的完整性。

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图6

小鼠中枢神经系统的CHIKV细胞和组织嗜性

干扰素-α/βR^−/−通过ID途径接种20 PFU的小鼠在D3pi处死，并在脑冷冻切片上进行免疫染色。细胞核呈蓝色，CHIKV呈红色。基底膜（IV型胶原）呈紫色（A）或绿色（B），星形胶质细胞和胶质细胞界限蛋白（GFAP）呈绿色（A和C）。脑膜细胞（箭头）对CHIKV显示出强烈的免疫标记，而脑微血管（箭头）和胶质细胞则没有（a）。Virchow-Robin间隙显示CHIKV（B）、室管膜细胞（C）和脉络丛（D）的免疫染色。棒材为10μm。

为了确定CHIKV感染是否改变了血脑屏障的通透性，我们静脉注射了辣根过氧化物酶（HRP），当血脑屏障完好无损时，HRP不会扩散到脑实质，但在血脑屏障破裂时会泄漏到脑实质[27]. 感染IFN-α/βR的脑内HRP^−/−在模拟感染小鼠的大脑中观察到，成年小鼠局限于脑微血管管腔内(图5C） ●●●●。因此，尽管脑膜和Virchow-Robin间隙受到强烈感染，但感染后大脑微血管的屏障功能得以保留。

这些体内发现在体外BBB系统中得到证实[28,29]. 原发性脉络丛上皮细胞极易通过顶端途径感染(图7A） 在较小程度上通过基本路线(图7B） 提示CHIKV通过脉络丛进入脑脊液，也可能通过其顶面继发感染脉络丛上皮细胞，从而放大脑脊液中的病毒滴度。与之形成鲜明对比的是，原代脑微血管内皮细胞对CHIKV感染具有完全抵抗力(图7C） ●●●●。总之，这些发现表明，CHIVV通过脉络丛进入中枢神经系统，对脑膜表现出明显的向性，而它不会感染脑微血管和实质，也不会在脑实质层面引起组织改变。

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图7

构成BBB的细胞的体外敏感性

用MOI为10的CHIKV感染原代细胞，然后通过免疫荧光检测病毒抗原。脉络丛上皮细胞的顶端（A）和基底（B）感染持续18小时。注意，与顶端感染相比，基底感染后的免疫荧光细胞数量较少。脑微血管内皮细胞感染48小时，但未检测到病毒抗原（C）。

CHIKV母婴感染

鉴于在La Réunion疫情期间观察到CHIKV可以从感染病毒的母亲垂直传播给新生儿，我们调查了孕妇IFN-α/βR中CHIKV的母婴传播^−/−妊娠期第16–18天通过ID途径感染CHIKV-21的小鼠。在D2 pi时，处死动物，测定母体血清、胎盘和胎儿中的病毒滴度(图8A） ●●●●。正如预期的那样，母体血清中的病毒载量升高。相比之下，胎盘病毒滴度至少低2个数量级，胎儿未受感染(图8A） ●●●●。此外，在这些胎盘中未观察到CHIKV免疫标记（未发表数据）。通过观察人类合胞滋养层细胞系BeWo对感染不敏感，体外证实胎盘屏障对CHIKV无耐受性(图8B） ●●●●。

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图8

妊娠期干扰素-α/βR的CHIKV感染^−/−小鼠和人同步滋养层细胞对CHIKV的耐药性

（A） 孕鼠在妊娠16至18天期间通过ID途径感染20个CHIKV PFU。两天后，在血清和肝脏、胎盘和胎儿（四个母亲，每个母亲三到六个胎儿）中测定了病毒滴度。虚线表示检测阈值。（B） 将人合胞滋养层细胞系BeWo和作为阳性对照的人包皮成纤维细胞HFF以10的MOI感染CHIKV，并在指定的时间点用TCID50滴定培养基中的病毒载量。每个数据点代表至少四个独立实验的算术平均值±SD。

细胞。

如前所述，获得、纯化和培养原发性脉络丛和脑微血管内皮细胞[28,29]. Bewo细胞系来自ATCC。细胞以10倍感染率（MOI）感染CHIKV。

人体组织。

人体组织样本取自拉留尼旺CHIKV感染者临床护理过程中采集的活检标本。

动物。

从查尔斯·里弗实验室（法国）获得了出血热OF1小鼠、近交C57BL/6和129s/v小鼠。干扰素-α/βR^−/−F.Tangy经M.Aguet许可给予129s/v小鼠[45]. 根据巴斯德研究所畜牧业指南饲养小鼠，并将其保存在3级隔离器中。通过ID在小鼠腹侧胸部接种50μl用PBS稀释的病毒悬浮液（用于成年小鼠）和30μl用于新生儿。模拟感染小鼠仅接受PBS。用异氟烷（Forene，Abbott Laboratories Ltd，United Kingdom）麻醉小鼠。通过心脏穿刺采集血液，然后在采集器官之前，在4°C下通过心内途径向每只小鼠灌注40 ml PBS。组织均化，通过组织细胞病变感染剂量50（TCID50）在Vero细胞上测定每个组织样品的病毒滴度，组织和血清中的病毒效价分别表示为TCID50/g或TCID50/ml。在整个实验过程中都遵循良好的实验动物护理原则。妊娠女性干扰素-α/βR^−/−孕16-18天的小鼠通过ID途径感染20个CHIKV PFU。在D2 pi，采集母体血清、胎盘和胎儿，并测定每个样本中的病毒滴度。对六只小鼠组成的组进行死亡率研究，并在每个时间点对四只小鼠的组织进行病毒滴度研究。

组织学和免疫荧光。

小鼠器官在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻以进行冷冻切片，或在对甲醛中固定以进行石蜡包埋。石蜡包埋组织进行组织学染色（苏木精和伊红）。对于免疫荧光，冰冻切片在冰镇甲醇中固定10分钟，然后在4°C下与一级抗体孵育12小时，然后与二级抗体孵化1小时。幻灯片用Hoechst（Vector Lab）进行了复染。使用了以下抗体：多克隆兔抗胶原蛋白IV（Chemicon，Temecula CA，1:200）、多克隆鸡抗波形蛋白（Abcam，Cambridge，UK，1:200胶质限制器)获得了单克隆大鼠抗巨噬细胞抗原F4/80（Abcam，1:100）、多克隆兔抗PECAM1/CD31（Abcam，1:400）、人血清抗CHIKV，并由国家虫媒病毒研究中心鉴定为抗CHIKV IgM和IgG阳性。通过检测用相同浓度的对照同型或免疫球蛋白替换一级抗体的切片，以及对同一动物株的非感染组织进行免疫染色，系统地确认了标记物的特异性。使用配备ApoTome系统的蔡司AxioPlan 2显微镜检查载玻片，以获得0.7μm厚的光学切片。图片和Z堆栈是使用AxioVision 4.5软件获得的。必要时，使用image J软件处理图像(http://rsb.info.nih.gov/ij/).

电子显微镜。

使用JEOL JEM 1010电子显微镜在80 kV加速电压下观察到超薄切片。

染色免疫组织化学。

对人体组织进行染色免疫组化。在抗原揭开后（97°C，20分钟），对CHIKV单克隆抗体（由bioMérieux和法国IMTSSA提供）进行过夜培养，并用聚合物检测试剂盒（SuperPicTure™Zymed，http://www.invitrogen.com网站/)和DAB色原（媒介实验室，网址：http://www.vectorlabs.com/).

BBB泄漏评估。

如前所述，使用静脉注射VI型HRP（Sigma）（30 mg/ml溶于2%的伊文思蓝0.9%盐水中，以提供100 mg/kg）研究BBB渗透性[27,46]. 对CHIKV感染小鼠和模拟感染小鼠的五个大脑进行了研究。

我们感谢Marie-Christine Prévost提供的电子显微镜，Yasmine Baba-Amer、Claudine Rousseau和Marie-Pascale Frenkiel提供的技术援助，Michel Huerre在组织样本处理过程中提供的帮助，Marc Grandadam提供的病毒分离物，Olivier Schwartz提供的试剂和有益的讨论，和谢尔盖·莫斯托维的批判性阅读。我们还感谢基孔肯亚-巴斯德财团成员帕斯卡尔·科斯特（Pascale Cossart）和费利克斯·雷伊（Félix Rey）的支持。