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再次流行基孔肯亚病毒的特征

马里恩·苏里索等。 公共科学图书馆-病理学. 2007年6月.

摘要

印度洋地区各国最近爆发了一场前所未有的基孔肯雅病毒（CHIKV）感染疫情，引发了急性疼痛综合征，伴有高烧、乏力、皮疹、多关节炎和致命的脑炎病例。基孔肯雅病的基础和CHIKV的向性尚不清楚。在这里，我们描述了近期临床CHIKV菌株的复制特征。人类上皮细胞和内皮细胞、原代成纤维细胞以及在较小程度上来源于单核细胞的巨噬细胞容易感染并允许病毒产生。相反，CHIKV在淋巴细胞和单核细胞系、原代淋巴细胞和单细胞或单核细胞衍生的树突状细胞中没有复制。CHIKV复制是一种细胞病变，与感染细胞的凋亡诱导有关。氯喹、巴非霉素A1和抗dynamin-2的短发夹RNA抑制了病毒的产生，表明病毒通过依赖pH的内吞作用进入。CHIKV对I型和II型干扰素的抗病毒活性高度敏感。这些结果为CHIKV与其哺乳动物宿主之间的相互作用提供了一般的见解。

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数字

图1
图1。HeLa细胞的CHIKV感染
（A） HeLa细胞暴露于CHIKV-115。24小时后，用抗α病毒衣壳单克隆抗体或多克隆抗CHIKV抗体对细胞进行固定和染色，并用共焦显微镜进行分析。（B） 用流式细胞术对CHIKV感染的细胞进行定量。HeLa细胞在指定的moi暴露于CHIKV-115。24小时后，细胞固定、渗透，用抗CHIKV抗体染色，并用流式细胞仪进行分析。抗衣壳蛋白单克隆抗体也获得了类似的结果。（C） 动力学分析。按照（B）所述感染HeLa细胞，并在指定的时间点进行分析。数据是三个独立实验的汇编（标准偏差[SD]）。（D） 上清液中的病毒释放.上清液中感染性病毒的水平通过限制Vero细胞的稀释度进行测量，并表示为TCID50/ml。数据是三个独立实验的汇编（带有SD）。（E） 四株CHIKV菌株感染性的比较。描述了五个独立实验的平均值±SD，100%对应于CHIKV-115在第1天和第2天pi获得的值，mois为10和1。NI，非感染细胞。
图2
图2。CHIKV是一种细胞病变病毒
（A） CHIKV感染的死亡细胞。在CHIKV感染后24小时，HeLa细胞被固定，用抗CHIKV抗体染色，并用共焦显微镜进行分析。（B） 细胞培养的可行性。HeLa细胞在指定的moi感染CHIKV。24小时后，用比色法（MTT细胞活力试验）测定细胞活力。数据为三组的平均值±标准差，代表五个独立实验；（C） CHIKV感染细胞的凋亡。在24 h pi（moi 10）时，用抗活性caspase-3和抗衣壳抗体对HeLa细胞进行双重染色，并用流式细胞仪进行分析。描述了在CHIKV阳性细胞中caspase-3阳性和阴性细胞的百分比。另一个凋亡标记也获得了类似的结果（TUNEL，未显示）。数据是三个独立实验的代表。NI，非感染细胞。
图3
图3。CHIKV的组装和释放
（A） CHIKV蛋白的Western blot分析。HeLa细胞暴露于指定的CHIKV菌株（moi 10）。使用抗衣壳mAb和抗CHIKV抗体的混合物，通过Western印迹24 h pi分析细胞裂解物和沉淀上清液。预测的病毒蛋白显示在右侧。（B） CHIKV感染HeLa细胞的电子显微照片库。在36 h pi时对细胞进行分析。CHIKV主要在HeLa细胞的质膜上萌发。未感染细胞中未检测到病毒颗粒（未显示）。条形图在上面板中表示1μm，在下面板中表示100 nm。NI，非感染细胞。
图4
图4。CHIKV的细胞取向
（A–C）所示人类细胞系或原代细胞在10 moi的条件下暴露于CHIKV。24小时后，固定细胞，用抗CHIKV抗体染色，并用流式细胞仪进行分析。显示CHIKV感染细胞的百分比。数据代表至少三个独立实验。对于原代细胞，至少分析了三个不同的供体。（A） 敏感和难熔电池类型示例。（B） 粘附细胞对CHIKV感染的敏感性。（C） 原代血源细胞对CHIKV感染的敏感性。分析所示细胞系以及非活化PBMC、活化CD4+淋巴细胞、单核细胞和单核细胞衍生DC。
图5
图5。CHIKV与靶细胞的结合
将所示人类细胞系或原代细胞在所示moi下于4°C下暴露于CHIKV 1 h。细胞固定，用抗CHIKV抗体染色，并用流式细胞仪进行分析。数据是三个独立实验的代表。NI，非感染细胞。
图6
图6。CHIKV对人类初级巨噬细胞的生产性影响
（A–C）人单核细胞来源的巨噬细胞暴露于CHIKV 4h并进行广泛清洗，并用不同方法分析CHIKV复制。数据代表了至少四个独立的实验，这些实验使用了八个不同供体的细胞。（A） CHIKV感染的巨噬细胞。细胞以10 moi感染CHIKV。在指定的时间点，用抗CHIKV抗体对细胞进行染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。描述了两种放大倍数（物镜×25和×40）。NI，非感染细胞。（B） 上清液中感染病毒的释放.如前所述，巨噬细胞在各种mois感染。在指定的时间点，通过限制Vero细胞的稀释来测量上清液中感染病毒的水平。结果表示为TCID50/ml。描述了三个代表性供体的巨噬细胞。（C） 上清液中的病毒RNA.通过实时PCR测量（B）中描述的相同实验上清液中的病毒RNA水平。
图7
图7。CHIKV进入通道
（A和B）CHIKV感染需要较低的内体pH值才能进入。HeLa细胞在感染氯喹（10μM）或巴非霉素A1（25 nM）前1 h进行预处理，并暴露于CHIKV（moi 10），或在病毒暴露后3 h用两种药物处理。（A） 氯喹和巴非霉素A1抑制CHIKV复制。24小时后，用小鼠抗CHIKV抗体对HeLa细胞进行染色，并用流式细胞仪进行分析。Ctrl，control。（B） 氯喹和巴非霉素A1对CHIKV CPE的抑制作用。细胞活力通过比色法（MTT细胞活力测试）24 h pi测定。（C） shRNAs下调Dyn-2表达。用表达GFP的慢病毒载体和针对Dyn-2或不相关蛋白的shRNA转导HeLa细胞作为对照（Ctrl）。上面板：Western blot显示Dyn-2表达下调。下图：转铁蛋白受体（Tf-R）的表面水平在缺乏Dyn-2的情况下上调。对转导的GFP+细胞进行流式细胞术分析。（D） CHIKV复制需要Dyn-2。缺乏Dyn-2的HeLa细胞对CHIKV具有抵抗力。感染的HeLa细胞（moi 10，24 h pi）用抗CHIKV抗体染色，并用流式细胞术进行分析。描述了GFP+和GFP-细胞中CHIKV+细胞的百分比。上部面板显示了三个代表性实验中的一个。下部面板显示了四个独立实验的平均值±SD。NI，非感染细胞。
图8
图8。干扰素抑制CHIKV感染
在感染前6小时用指定剂量（IU/mL）的IFN预处理HeLa细胞。干扰素α1亿，干扰素β1a个和IFNγ进行了测试。然后将细胞在两个mois（10和1）处暴露于CHIKV。（A） 抑制CHIKV复制。在24小时pi时，用抗CHIKV抗体对HeLa细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。（B） 抑制CHIKV CPE。细胞活力通过比色法（MTT细胞活力测试）24 h pi（moi of 10）测定。数据是三个独立实验的代表。
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参考文献

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