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比较研究
.2011年1月27日；117（4）：e49-56。
doi:10.1182/bloud-2010-10-314120。 Epub 2010年11月17日。

mpeg1启动子转基因在斑马鱼中的直接巨噬细胞系表达

费利克斯·埃利特 1, 卢克·帕斯, 约翰·海曼, 亚历克斯·安德里亚诺普洛斯, 格雷厄姆·利什克
附属公司
比较研究

mpeg1启动子转基因在斑马鱼中的直接巨噬细胞系表达

费利克斯·埃利特等。 血液. .

摘要

巨噬细胞和中性粒细胞在先天免疫反应、吞噬入侵微生物和将抗菌化合物输送到损伤部位等过程中发挥着重要作用。斑马鱼感染/炎症模型中细胞固有免疫反应的功能分析已由带有荧光标记中性粒细胞的转基因系辅助进行。然而，由于目前还没有巨噬细胞报告系，因此不可能在体内直接研究巨噬细胞行为和中性粒细胞/巨噬细胞相互作用。为了消除这一障碍，我们确定了一种巨噬细胞特异性标记（mpeg1）及其启动子用于mpeg1驱动的转基因。mpeg1驱动的转基因在不表达中性粒细胞标记转基因的巨噬细胞系细胞中表达。利用这些线，比较了复合转基因中中性粒细胞和巨噬细胞在创伤后的不同动力学行为。巨噬细胞/中性粒细胞的相互作用，如衰老中性粒细胞的吞噬作用，很容易实时观察到。这些斑马鱼转基因为炎症、感染和白细胞生物学领域提供了一种新的资源。

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数字

图1
图1
1.86千字节mpeg1格式启动子片段驱动巨噬细胞瞬时转基因表达（A）注射tol2侧翼Tg的胚胎中的瞬时嵌合转基因表达(mpeg1格式：mCherry）（i）和Tg(mpeg1格式：EGFP）（ii）DNA构建到Tg(里兹：EGFP）和Tg(里兹：dsRed）转基因背景。实验在Tg上进行(里兹：EGFP）和Tg(里兹：dsRed）胚胎提供与中性粒细胞表达的比较和不重叠。（B） 注射tol2-侧翼Tg的F0成人的转基因表达(mpeg1格式：mCherry）（i，iii）和Tg(mpeg1格式：EGFP）（ii）DNA结构。（iii）Tg(mpeg1格式：mCherry）被引入Tg(最大功率x：EGFP）背景，提供与中性粒细胞表达的比较和不重叠。（C） 传递tol2-侧翼Tg导致的瞬时转基因表达(mpeg1格式：Gal4-VP16）构建到Tg（UAS:Kaede）胚胎中会导致分散细胞（i）中Kaede的表达，这些细胞会随着损伤（尾部横断）（ii-v）而迁移。时间：受伤后小时数（hpi）。（D） 交付tol2-侧翼Tg(mpeg1格式：Gal4-VP16）到Tg（UAS:Kaede/里兹：dsRed）胚胎可以比较巨噬细胞（绿色，箭头）和中性粒细胞（红色）在受伤（尾部横切）时的迁移。时间：受伤后小时数（hpi）。
图2
图2
稳定的巨噬细胞本体、形态和行为mpeg1格式转基因斑马鱼。（A） Tg中分散巨噬细胞中未转换的Kaede表达（绿色）(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS:Kaede）28至144 hpf的F1胚胎。28、50和120 hpf的图像是由同一胚胎在两个焦平面上拍摄的照片合成的。（B） 转基因表达缺失发生在幼年F1和F2-Tg中(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS:Kaede）成虫（i，iv），表现为尾鳍中没有分散的荧光巨噬细胞；与Tg尾鳍中的巨噬细胞比较(mpeg1格式：mCherry）和Tg(mpeg1格式：EGFP）图1B中的F0动物。然而，F1成虫异交的直接后代（i）在分散的巨噬细胞中仍显示出强烈的胚胎转基因表达（ii，iii）。（I，iv）箭头表示自荧光虹彩。条形代表1 mm。（C）Tg中经光转换的Kaede（红色）标记细胞的树枝状形态（箭头）(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS:Kaede）F1胚胎。条形表示20μm。（D） 在F1 Tg中，光转换的Kaede和EGFP的荧光表达没有重叠(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS:Kaede/最大功率x：EGFP）复合转基因胚胎，证明mpeg1格式启动子驱动完全分离的髓细胞群体中的表达最大功率x启动子（绿色代表中性粒细胞，红色代表巨噬细胞）。Bar表示50μm。（E） 巨噬细胞胞饮作用导致中性红染色在未转化Tg的液泡中积聚(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS：F1胚胎大脑（箭头）中的Kaede阳性细胞（绿色）。Bar表示50μm。（F） 热杀吞噬作用马尔尼菲青霉菌巨噬细胞（红色代表光转化的Kaede）和中性粒细胞（绿色代表EGFP）产生的孢子（钙荧光标记的蓝色箭头）。注意巨噬细胞吞噬下层真菌孢子（底部填充箭头），中性粒细胞随胞内孢子迁移（开放箭头）。补充视频1中的静像。Bar表示50μm。时间：感染后分钟。
图3
图3
创伤后巨噬细胞和中性粒细胞行为的比较描述性和定量分析（A）Tg中尾部横切后11.5小时延时显微镜（补充视频2）提取的帧(mpeg1格式：Gal4-VP16/无人机系统：Kaede/最大功率x：EGFP）F1胚胎（红色代表巨噬细胞；绿色代表中性粒细胞）。条形表示100μm。（B-C）前6个中性粒细胞（B）和6个巨噬细胞（C）到达伤口的细胞迁移路径，尾部横切后18小时，从另一个受伤Tg的视频中提取(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS:Kaede/最大功率x：EGFP）F1转基因胚胎。（D-H）与B组和C组相同的6个中性粒细胞（D）和巨噬细胞（E）到伤口边缘的距离图显示了迁移和居住行为的总体差异。所有巨噬细胞都直接迁移到伤口，并在剩余的时间里保持在伤口边缘附近，而大约30%的中性粒细胞在受伤后3到6小时恢复漫游行为。每个面板的插图i和ii显示了在（i）和（ii）伤口到达之前和之后收集的x/y运动矢量。两种细胞类型在到达前都表现出较强的方向性，但巨噬细胞的到达前速度较慢（F），其较高的曲流指数（直接路径长度/实际路径长度）（G）反映出更强的方向性。向内持久性指数，即到达后在伤口边缘停留的剩余时间百分比（H），表明巨噬细胞到达后倾向于在伤口边缘长时间停留，而中性粒细胞表现出更大的行为扩散。描述性统计：（B-E）每种类型相同6个细胞的数据。（F-H）数据点是受伤后18小时内拍摄的4个胚胎的单个细胞。（F，G）条形代表平均值加上或减去SD。显著性检验：（F，G）t吨测试，双尾。（H） Mann-Whitney检验，双尾。
图4
图4
巨噬细胞与中性粒细胞在体内的相互作用（A）Tg中巨噬细胞（红色代表光转换的Kaede）和中性粒细胞（绿色代表EGFP）之间的相互作用(mpeg1格式：Gal4-VP16/UAS:Kaede/最大功率x：EGFP）复合转基因F1胚胎。两例凋亡中性粒细胞被伤口边缘的巨噬细胞吞噬。第一次发生在340分钟时，巨噬细胞1（M⁄-1）位于框架顶部，第二次发生在348分钟时，M⁄-2。76分钟后，M-1中的绿色中性粒细胞荧光消失，45分钟后M⁄-2中出现绿色中性粒分子荧光消失。补充视频3中的静像。Bar表示10μm。（B） 证明细胞质中性粒细胞荧光的丧失依赖于巨噬细胞的吞噬作用。568至571分钟时，部分中性粒细胞吞噬。572.5至634分钟时，吞噬片段中的荧光在大约6小时后消失（虚线圆圈表示EGFP荧光消失的区域）。为这一过程提供内部控制，未吞噬细胞的静止荧光中性粒细胞碎片在第一吞噬阶段保持稳定，直到727.5分钟被同一巨噬细胞吞噬，736.5分钟失去EGFP荧光。补充视频4中的静像。Bar表示10μm。在这两个面板中，白色箭头和黄色箭头分别表示中性粒细胞尸体的非吞噬和吞噬状态。（C-D）从活中性粒细胞（绿色表示EGFP）到巨噬细胞（红色表示光转化的Kaede）的细胞质转移的两个例子。（C） 伤口边缘附近的中性粒细胞/巨噬细胞相互作用导致活中性粒细胞的细胞质碎片转移到巨噬细胞内。（顶部面板）合并的图像。（下图）仅EGFP通道。虚线表示巨噬细胞（蓝色）和中性粒细胞/碎片的位置。静像摘自补充视频5。Bar表示20μm。（D） 胚胎躯干中的中性粒细胞/巨噬细胞相互作用。合并的荧光和亮场图像清楚地显示了相互作用，导致中性粒细胞向巨噬细胞的细胞质转移。补充视频6中的静像。Bar表示20μm。在这两个例子中，白色箭头和黄色箭头分别表示转移中性粒细胞胞质碎片的非吞噬和吞噬状态。中性粒细胞在整个过程中的存活能力通过其随后移出视野（第四和第五副面板中的白色箭头方向）来证明。
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