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EMBO J。2010年2月3日；29(3): 606–618.
2009年12月10日在线发布。 数字对象标识：10.1038/emboj.2009.369
预防性维修识别码：项目经理2830692
PMID：20010695

BCL-2在内质网对抗Beclin 1依赖性自噬需要NAF-1

娜塔莎·C·张，1 Mai Nguyen女士，1 热尔曼，1,*和Gordon C海岸1,一
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补充资料

摘要

除线粒体外，BCL-2位于内质网（ER），是几个不同复合体的组成部分。在这里，我们确定了内质网处的BCL-2相互作用蛋白，即营养剥夺自噬因子-1（NAF-1），这是一种位性整合膜蛋白，其缺陷表达是神经退行性疾病Wolfram综合征2（WFS2）病因的基础。NAF-1在其细胞溶质区域内含有一个双铁双硫配位结构域，这对于与BCL-2的相互作用是必要的，但并不足够。NAF-1被ER限制的BH3-only蛋白BIK从BCL-2中取代，并有助于调节BIK启动的自噬，但不参与BIK依赖的半胱天冬酶激活。与BCL-2类似，NAF-1与肌醇1,4,5-三磷酸受体相关，是BCL-2介导的内质网钙抑制所必需的2+商店。在作为自噬生理刺激的营养剥夺期间，已知BCL-2通过抑制自噬效应器和肿瘤抑制因子Beclin 1发挥作用。在内质网BCL-2的这一途径中需要NAF-1，以在功能上拮抗Beclin 1依赖的自噬。因此，NAF-1是一种BCL-2相关的辅因子，以BCL-2为靶点，对抗内质网自噬途径。

关键词：自噬，BCL-2，Beclin 1，BIK，内质网

介绍

BCL-2蛋白家族负责调节和执行线粒体凋亡途径。此外，还发现该家族的所有三个亚组，即促存活成员、促凋亡效应剂BAX和BAK以及仅促凋亡BH3活化剂/敏化剂，均与内质网（ER）相关，内质网调节和调节线粒体依赖性和非依赖性凋亡反应(希思·恩格尔等, 2008). 最近，一些促生存成员和仅含BH3的成员也参与了大自噬的调节(莱文等, 2008)这是一种质量控制和细胞生存机制，可应对营养和代谢应激条件。在这一途径中，自噬前小泡通过吞噬细胞器和细胞质复合体成熟，将这些内容物封装在双膜小泡中，随后与溶酶体融合。自噬体内容物的降解使大分子前体再生，否则，如果其代谢生物合成受到抑制，则无法生成(尤里米苏和克林斯基，2005年).

最近的研究表明，自噬前小泡是在内质网相关的位置产生的，即ω小泡，它代表一种特殊的富含磷脂酰肌醇3-磷酸（PI（3）P）的内质网膜平台，用于组装吞噬体起始复合体(斧头等, 2008). 该平台似乎是通过向内质网招募含囊泡的Vps34而创建的，Vps34是一种III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），与Beclin 1和其他辅助蛋白结合生成功能性PI3K复合物(木原等, 2001)从而导致PI（3）P在此ER相关位点富集(斧头等, 2008). 然而，该现场PI3K综合体组件的确切地形尚待确定。Beclin 1是一种单倍体肿瘤抑制因子，是自噬的重要效应器，其拮抗作用可通过位于内质网的BCL-2实现(梁等, 1999；帕廷格等, 2005). Beclin 1含有一个BH3结构域，该结构域有助于其与BCL-2的相互作用，但与通常与凋亡调节相关的仅BH3蛋白中存在的BH3结构区相比，这种相互作用的亲和力很弱(冯等, 2007；伊达尔-奥伯施泰因等, 2007). 此外，含BH3的Beclin 1似乎在内质网或线粒体上都不会拮抗BCL-2的抗凋亡功能(奇埃科姆斯卡等, 2009). 因此，经典的仅含BH3的蛋白质，如BAD，已被证明可以取代BCL-2中的Beclin 1(迈乌里等, 2007)由此提出，凋亡途径中仅BH3蛋白释放BCL-2拮抗剂的信号级联也延伸至自噬(莱文等, 2008). 此外，通过死亡相关蛋白激酶（DAPk）途径对Beclin 1 BH3区域进行磷酸化(扎尔克瓦尔等, 2009)或BCL-2在c-Jun N末端蛋白激酶（JNK）途径中的表达(伟等, 2008)与Beclin 1/BCL-2或BCL-XL相互作用的中断有关。除了BCL-2在ER中与Beclin 1相互作用外，BCL-2还可以与BAX相互作用(白色等, 2005)，带有BAP31复合体(布雷肯里奇等, 2002)和钙传导肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）受体(陈等, 2004)在这个位置。鉴于内质网处的这些多重BCL-2相关通路以及BCL-2和Beclin 1之间相对较弱的结合，可能存在机制来确保内质网BCL-2在该细胞器处充分分配到自噬通路。新兴遗传(林等, 2008)和生化证据(克里奥洛等, 2007；维森西奥等, 2009)例如，通过为调节BCL-2和Beclin 1相互作用和/或调节自噬以响应BCL-2调节的内质网钙储存提供潜在的支架，已确定IP3受体复合物在Beclin 1-介导的自噬中很重要2+.

在这里，我们在ER中发现了BCL-2的一个新的蛋白结合伙伴，即营养剥夺自噬因子-1（NAF-1）。NAF-1和BCL-2之间的相互作用独立于BH3结构域，而取决于NAF-1的两个铁-双硫（2Fe-2S）协调CDGSH结构域。虽然BCL-2不需要NAF-1与仅BH3-的BIK相互作用，但NAF-1有助于BCL-2与Beclin 1的相互作用，并且需要BCL-2在功能上拮抗Beclin 1-介导的细胞自噬，以应对培养中H1299上皮细胞的营养剥夺。值得注意的是，NAF-1与BCL-2和Beclin-1相似，是IP3受体复合物的一个成分，BCL-2抑制ER-Ca所必需的2+商店。因此，ER限制性NAF-1是一种BCL-2相关的辅助因子，有助于靶向BCL-2对ER处Beclin-1依赖性自噬途径的拮抗作用。

结果

NAF-1在ER处与BCL-2相互作用，并被BIK取代

来源于人类肿瘤细胞系H1299并通过非变性2D凝胶电泳解析的ER蛋白的免疫印迹确定，ER处的BCL-2作为单体和较大复合物的一部分迁移（数据未显示）。部分BCL-2群体与其结合伙伴IP3受体共同迁移(陈等, 2004；橡树等, 2005)以及其他不含IP3受体的复合物。为了研究BCL-2复合物的组成，从稳定表达ER靶向HA-BCL-2b5的H1299细胞中分离出富含ER的光膜（LM），其中BCL-2跨膜（TM）片段被ER选择性细胞色素b5的跨膜片段取代(朱等, 1996；日尔曼等, 2005). 用同功能Cys特异性试剂双-氨基己烷（BMH）进行化学交联。通过SDS-PAGE和抗BCL-2抗体免疫印迹分析交联复合物，证实内质网处的BCL-2存在于大小不等的复合物中(图1A). 作为特异性过滤器，我们重点关注那些BCL-2可以被BIK从复合物中取代的复合物，BIK是一种BH3-唯一的蛋白质，主要定位于内质网并与BCL-2强烈结合(博伊德等, 1995；马泰等, 2002). 使用腺病毒表达系统（Ad-BIK或Ad-BIKb5）输送BIK。我们重点关注其中一种BCL-2移位复合物（用中的粗体箭头表示图1A)并确定了交联BCL-2结合伙伴(补充图1)，我们将其命名为NAF-1。

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在ER中鉴定新型BCL-2相互作用伙伴NAF-1(A类)仅BH3-BIK在内质网置换BCL-2复合物的一个子集。从H1299 HA-BCL-2b5细胞纯化的LM模拟感染或感染Ad-BIKb5后与BMH交联，并通过免疫印迹观察。星号(*)表示BCL-2交联产品，由BIK取代。粗体箭头表示包含交联NAF-1/BCL-2的区域。(B类)NAF-1的氨基酸序列。质谱鉴定的肽序列用双下划线表示。TM域由粗体单下划线表示。细胞溶质域中的半胱氨酸残基用星号表示(*). CDGSH域以灰色突出显示，预测的2Fe-2S配位Cys-3-His-1 aa以粗体标记。向下箭头（∨）表示Flag表位插入的位置。双线箭头(⇓) 指示突变（E37Q）时导致WFS2的Glu残基。使用人类蛋白质参考数据库（HPRD）中的磷酸基序查找器发现的预测磷酸化位点在方框中以粗体显示；β-肾上腺素能受体激酶底物基序（aa 25–29）、PKA和PKC激酶底物模序（aa32–34和67–69）以及酪蛋白激酶II底物模式（aa 34–37）。(C类)推导了NAF-1的膜拓扑结构。灰色矩形表示CDGSH域。(D类)从H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞中纯化的内源性NAF-1在内质网与BCL-2交联。LM经BMH交联，并用抗NAF-1抗体进行免疫沉淀。用抗BCL-2免疫印迹法分析沉淀。(E类)NAF-1由BCL-2替换为BH3-only BIK。H1299 HA-BCL-2b5细胞被模拟感染或被Ad-BIK感染。纯化的LM按(D类).

NAF-1序列(图1B; 135 aa；15 278道尔顿）被广泛表达，最初是在对大规模人类cDNA测序确定的新蛋白质的亚细胞定位的分析中发现的(辛普森等, 2000). 对NAF-1氨基酸序列的BLAST搜索显示，NAF-1在进化上是保守的，在从秀丽隐杆线虫对人类(补充图2). 值得注意的是，NAF-1序列似乎不包含规范的BH3结构域。因此，BIK取代NAF-1与BCL-2的相互作用不太可能是BCL-2 BH3结合槽的简单竞争性结合的结果。疏水性分析预测存在单个TM片段（aa 41–60）；可能与BMH交联的所有四个Cys残基都是该片段的C末端和KKEV中的C末端，这对应于完整ER蛋白KKxx（其中x是任何氨基酸；杰克逊等, 1990). 由于BCL-2中可用于交联的唯一Cys残基位于BCL-2细胞溶质域，这意味着NAF-1预计在内质网膜中定向，如图1C与预测的KKEV C末端的细胞溶质配置一致。

有趣的是，最近的另一份报告证实NAF-1是参与Wolfram综合征2（WFS2）神经退行性疾病的关键蛋白。在编码NAF-1的基因中鉴定出单个错义突变，工作流2导致信使RNA的异常剪接和提前终止密码子的引入，从而截断75%的蛋白质(金额等, 2007). 未报道野生型或突变型NAF-1蛋白的功能。此外，NAF-1最近也被鉴定为一个三成员蛋白质家族的一部分，该家族包含一个独特的CDGSH铁/硫结合域(图1B和C). 与其他两个定位于线粒体的家族成员不同，NAF-1的独特之处在于它定位于内质网(威利等2007年a; 另请参见下文）。线粒体上的丝裂原网是这个家族的创始成员，它与2Fe-2S簇结合，由CDGSH结构域内的三个Cys和一个His残基协调(威利等2007年b). 然而，这个结构域和这个蛋白质家族的功能都还没有确定。最近对工作流2然而，小鼠中的基因导致了衰老和死亡的早期发生(陈等, 2009).

最初观察到NAF-1作为BCL-2b5的相互作用伙伴是化学交联的结果。我们通过交联BCL-2产物与抗NAF-1抗体的沉淀以及与抗BCL-2抗体的印迹证实了这种相互作用(图1D). 我们还确认，只有BH3-的BIK取代了BCL-2b5中的NAF-1。对来自模拟感染或感染Ad-BIK的H1299 HA-BCL-2b5细胞的纯化LM进行交联，然后用抗NAF-1抗体进行免疫沉淀。BIK表达时，NAF-1/BCL-2二聚体沉淀明显减少(图1E). 因此，尽管NAF-1可能通过BH3非依赖性机制与BCL-2相互作用，但它仍然可以被仅含BH3的蛋白质从BCL-2中取代。这可能是由BH3-唯一结合伙伴引起的BCL-2构象变化的结果(德卢戈斯等, 2006). 或者，这可能是因为BIK破坏了一个更大的复合物，该复合物有助于NAF-1/BCL-2的相互作用。

使用SK-Mel5细胞，内源性NAF-1通过联合免疫沉淀与内源性野生型BCL-2相互作用(图2A). BCL-XL也获得了类似的结果(补充图3). 如预期（并与威利等2007年a)免疫荧光分析表明内源性NAF-1主要分布于H1299细胞的内质网(图2B). 我们还证实，兔网织红细胞裂解物中NAF1-Flag的主要翻译产物有效靶向并插入狗胰腺微粒体在体外(王等, 2008)其中它对NaCO萃取产生了抗性三，pH 11.5（膜整合诊断），但不进入纯化的心脏线粒体(麦克布赖德等, 1992；补充图4). 相反，HA-BAK定位并插入内质网微粒体和线粒体。发现NAF-1主要位于内质网(威利等2007年a; 本研究）与陈等(2009)他认为主要是线粒体的位置。这是基于过度表达GFP融合蛋白的异位分析和不包括ER标记的细胞分离。

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NAF1/BCL-2相互作用。(A类)内源性NAF-1和BCL-2的协同免疫沉淀。收集SK-Mel5细胞的裂解物，用抗NAF-1抗体进行免疫沉淀。用抗BCL-2和抗NAF-1对沉淀进行免疫印迹。(B类)H1299细胞固定并用抗NAF-1和抗Calnexin或抗细胞色素双重染色c（c）抗体。比例尺代表10μm。(C类)NAF-1-Flag和HA-BCL-2b5的共免疫沉淀。收集感染Ad-NAF-1-Flag的H1299 HA-BCL-2b5细胞的裂解物，并按(A类). (D类)NAF-1的CDGSH铁结合域突变干扰NAF-1与BCL-2的结合。H1299 HA-BCL-2b5细胞感染了Ad-rtTA、Ad-NAF-1-Flag或Ad-NAF-1-mut-Flag（C99S C101S C110S H114Q）。裂解液按(A类). 使用Scion Image软件进行密度分析，以量化NAF-1-Flag和NAF-1-mut-Flag的表达和共沉淀水平。图表描述了共沉淀蛋白与表达水平的比率。(E类)一个功能性CDGSH铁结合结构域是必需的，但不足以实现NAF-1和BCL-2的细胞溶质结构域之间的相互作用。HA-BCL-2ΔTM为在体外将翻译成兔网织红细胞裂解物的等分样品添加到每个GST下拉反应中。使用的GST融合蛋白为GST单独、GST-NAF1-C、GST-NAF1-C-mut（C99S C101S C110S H114Q）和GST-MitoNEET-C。使用抗HA和抗GST检测蛋白。

创建了一种腺病毒载体，该腺病毒载体表达全长NAF-1，在KKEV ER滞留信号上游含有Flag-tag(图1B)，我们通过联合免疫沉淀证实NAF-1-Flag与BCL-2b5相互作用(图2C). 由于NAF-1的一个特征位点是39个氨基酸长的CDGSH结构域，我们突变了相应的关键三个Cys和His残基，这些残基被证明对结合丝裂原网中的2Fe-2S簇很重要(图1B；威利等2007年b). 三个Cys残基被转化为Ser，His残基被转换为Gln（C99S C101S C110S H114Q），该修饰蛋白被命名为NAF-1-mut。从用表达NAF1-Flag、NAF1-mut-Flag或rtTA蛋白的腺病毒感染的H1299 HA-BCL-2b5细胞（对照）中收集裂解物，并用抗BCL-2抗体进行免疫沉淀。与野生型NAF-1相比，NAF-1-mut与BCL-2共沉淀显著减少，而BCL-2的沉淀量相似(图2D). 因此，CDGSH结构域有助于NAF-1和BCL-2之间的相互作用。

创建了GST融合蛋白，其包含NAF-1（GST-NAF1-C）、Cys-3-His-1 NAF-1突变体（GST-NAF1-C-mut）或丝裂原网（GST-mitoNEET-C）的细胞溶质域。值得注意的是，经谷胱甘肽珠纯化后，GST-NAF1-C和GST-MitoNEET-C蛋白呈铁锈色，这表明它们具有结合铁的能力，如之前所述(威利等2007年a). 相反，GST-NAF1-C-mut没有铁锈色。GST和GST融合蛋白与谷胱甘肽珠结合并与在体外网织红细胞裂解物中翻译的HA-BCL-2ΔTM（缺乏TM结构域的细胞溶质BCL-2）。GST-NAF1-C下调BCL-2ΔTM，证实这两种蛋白通过各自的细胞质域相互作用(图2E). 根据联合免疫沉淀数据，GST-NAF1-C-mut没有降低BCL-2ΔTM，重申了CDGSH结构域对这种相互作用的重要性。有趣的是，含有功能性CDGSH结构域的细胞溶质丝裂原网并没有降低BCL-2ΔTM，这意味着虽然功能性CDGSH结构域是必要的，但它可能不足以促进NAF-1和BCL-2之间的相互作用。因此，除功能性CDGSH结构域外，NAF-1蛋白序列中的其他元素可能有助于NAF-1与BCL-2的相互作用。

NAF-1参与调节BIK启动的自噬，但不参与BIK启动caspase的激活

使用编码针对NAF-1 mRNA的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒敲低H1299 neo和H1299 BCL-2b5细胞中NAF-1的表达(图3A). NAF-1的敲除对Ad-BIK诱导胱天蛋白酶-3活化的能力没有影响，这是通过从原胱天蛋白酶-3切割的催化亚基的免疫印迹确定的(图3A通道5和6）或通过检测DEVDase活性(图3B)敲除也不会影响BCL-2对抗这些结果的能力(图3A第7和第8车道；B） ●●●●。泛caspase抑制剂zVAD-fmk强烈抑制BIK诱导caspase-3(图3A和B)，这延长了许多小时（数据未显示）。然而，zVAD-fmk抑制凋亡的细胞中BIK的长时间表达已被证明导致具有自噬特征的caspase非依赖性细胞死亡(拉希米等, 2008). 因此，通过免疫印迹分析细胞裂解物(维尔德洛等, 2008)用于将细胞质形式的微管相关蛋白1轻链3（LC3 I形式）转化为LC3 II，广泛用于检测自噬体积累(水岛和吉森，2007年；图3C). 在缺乏半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活（zVAD-fmk治疗）的情况下，BIK表达超过30和48小时会导致LC3 I的逐渐丧失(图3C，比较车道1、5和9）。NAF-1 shRNA敲除的最显著后果发生在BCL-2b5的存在下，其中BIK在48小时时诱导LC3 II与LC3 I的比率显著增加(图3C，通道12）与控制（CTRL）shRNA进行比较(图3C，第11车道）。这些结果与BCL-2和NAF-1之间的物理联系相一致，表明这些蛋白之间在自噬调节中存在潜在的功能关系。然而，对BIK的自噬反应相当缓慢（30-48小时vs 8小时诱导凋亡）；此外，它需要与zVAD-fmk联合应用才能显现，而且迄今为止尚未涉及自噬的生理途径。因此，我们探讨了BCL-2和NAF-1在营养剥夺快速生理反应过程中自噬的功能关系。虽然营养剥夺不会诱导BIK（数据未显示），但BIK的结果清楚地表明NAF-1/BCL-2复合物可能是BH3-唯一蛋白质的靶点。

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NAF-1不影响BIK启动的凋亡，但在缺乏caspase激活的情况下影响BIK诱导的自噬。(A类)在不存在或存在50μM zVAD-fmk的情况下，用对照（CTRL）或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞被模拟感染或用Ad-BIK感染。细胞裂解物通过免疫印迹分析。(B类)使用荧光底物DEVD-AMC测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。结果代表三个独立实验的平均±标准差。(C类)延长BIK表达和半胱天冬酶抑制可诱导自噬，而NAF-1的敲除可增强自噬。用CTRL或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞在zVAD-fmk存在下感染Ad-BIK达指定时间。细胞裂解物通过免疫印迹分析。通过密度分析将LC3 II水平归一化为肌动蛋白水平。图中显示了每条车道的标准化LC3 II水平。

NAF-1对BCL-2介导的Beclin 1依赖性自噬拮抗作用的贡献

自噬过程本质上是动态的，LC3 II在自噬体与溶酶体融合后降解。因此，为了使用比较LC3 II水平作为自噬反应的测量指标，使用空泡型（H+）-ATP酶抑制剂bafilomycin A1（Baf A1）来阻止自噬体与溶酶体的融合(水岛和吉森，2007年). 用CTRL或NAF-1 shRNA处理过的H1299细胞在厄尔平衡盐溶液（EBSS）中，在DMSO（载体）或Baf A1的存在下饥饿4小时，并进行免疫印迹检测。在抑制剂存在的情况下，与对照shRNA相比，NAF-1 shRNA处理的饥饿细胞中LC3 II的积累增加(图4A，顶部面板，通道5和6）。这表明NAF-1有助于抑制饥饿诱导的自噬。为了排除在缺乏NAF-1的情况下营养剥夺诱导凋亡途径的可能性，我们检测了处理procaspase-3的细胞，并在CTRL和NAF-1 shRNA处理的细胞中仅检测到全长procaspase-3(图4A). 同样，这意味着NAF-1在自噬中的功能与凋亡相反。

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NAF-1敲除导致饥饿诱导的Beclin 1依赖性自噬的发生率和强度增加。(A类)NAF-1敲除对饥饿诱导的自噬的影响。感染CTRL或NAF-1 shRNA的H1299细胞在含有DMSO（载体）或Baf A1（100 nM）的EBSS中饥饿4小时。细胞裂解物通过免疫印迹分析。(B类)转染LUC或NAF-1 siRNA、未经处理和饥饿的H1299 GFP-LC3细胞中GFP-LC2染色的代表性图像。比例尺代表10μm。(C类)自噬的定量表示为表达GFP-LC3的细胞显示点状GFP-LC3.的百分比。每个样本至少计数100个细胞；结果代表三个独立实验的平均±标准差。细胞裂解物通过免疫印迹分析。

荧光GFP-LC3被广泛用于测量自噬，因为它在正常条件下显示出均匀的细胞质分布，并在自噬诱导条件下将自噬体荧光标记为细胞质内的点状结构(水岛等, 2004). 为了避免在短暂过度表达GFP-LC3的细胞中常见的蛋白质聚集问题，我们生成了稳定表达GFP-LC 3的H1299细胞系，并证实这些细胞具有自噬能力。用NAF-1 siRNA或对照（LUC）siRNA转染H1299 GFP-LC3细胞，并将其保存在正常培养基中（未经处理）或在EBSS中饥饿4小时(图4B和C). 转染LUC siRNA的未处理细胞显示出弥漫性GFP-LC3染色，而饥饿细胞显示出点状GFP-LC2，类似于典型的自噬诱导。NAF-1敲除对营养充足细胞的自噬没有影响。然而，有趣的是，与饥饿LUC对照组相比，NAF-1表达降低的饥饿细胞（NAF-1 siRNA）表现出差异，表现为两种饥饿表型(图4B). 共有25%缺乏NAF-1的细胞在饥饿后表现出类似于饥饿对照细胞的形态。然而，大多数缺乏NAF-1的饥饿细胞（75%）表现出一种表型，包括较大的荧光GFP-LC3斑点，以及细胞外围膜泡或丝状体中GFP-LC2的分布。值得注意的是，类似的GFP-LC3阳性自噬小泡的膜起泡和积聚已被报道为与DAPk家族成员介导的细胞死亡相关的表型(英巴尔等, 2002).

在H1299 GFP-LC3细胞中研究了NAF-1敲除介导的Beclin 1自噬依赖性，该细胞转染了针对LUC、Beclin I、NAF-1或Beclin-1和NAF-1两者的siRNA。每个样本的自噬水平被量化为表现点状GFP-LC3的GFP-LC3-表达细胞的百分比。正如预期的那样，饥饿4小时后GFP-LC3聚集的诱导依赖于Beclin 1(图4C; Beclin 1 siRNA）。饥饿细胞中NAF-1敲低后增强的自噬也被Beclin 1表达的敲低所抵消(图4C; Beclin 1+NAF-1 siRNA），表明NAF-1在Beclin 1介导的自噬途径中在Beclin-1的内部和上游起作用。相反，NAF-1的异位过度表达对NAF-1内源性水平在该途径中的自噬活性没有额外的抑制作用（数据未显示）。然而，由于NAF-1是一种BCL-2相互作用蛋白，NAF-1所赋予的自噬抑制可能与BCL-2偶联。

据报道，驻留在内质网的BCL-2与必需的自噬蛋白Beclin 1结合，并抑制Beclin 1-依赖性饥饿诱导自噬(帕廷格等, 2005). 如所示图5A联合免疫沉淀法判断，NAF-1敲除显著降低转染Flag-Beclin 1的H1299 HA-BCL-2b5细胞中BCL-2b5和Beclin 1之间的相互作用。此外，获得了NAF-1对BCL-2介导的Beclin 1介导的自噬的功能拮抗作用的明确证据。生成稳定表达GFP-LC3和neo或BCL-2b5的H1299细胞系，并用LUC siRNA或NAF-1 siRNA转染，随后饥饿或不饥饿。类似于在图4B和C在neo或BCL-2b5细胞没有细胞饥饿的情况下，NAF-1的敲除对GFP-LC3的分布没有影响（数据未显示）。与neo细胞相比，经对照LUC siRNA处理的BCL-2b5细胞在饥饿后出现点状GFP-LC3的细胞数量显著减少(图5B). 然而，根据GFP-LC3点的积累判断，NAF-1的敲除阻止BCL-2b5对抗饥饿诱导的自噬(图5B)表明BCL-2抑制自噬需要NAF-1。电子显微镜证实了这些结果(图5C-E)根据自噬体空泡的定量判断。H1299新LUC siRNA细胞在没有饥饿的情况下几乎没有自噬体结构(图5Ca)而饥饿的对手(图5Cb)显示了自噬诱导的典型自噬体结构。BCL-2b5抑制了这些自噬体的诱导(图5Cd). 大多数饥饿的H1299新细胞缺乏NAF-1(图5Cc)与缺乏LUC siRNA的细胞相比，每个细胞表现出更多的自噬体(图5Cb和E)从而描绘出增强的自噬反应。重要的是，在缺乏NAF-1的饥饿H1299 BCL-2b5细胞中观察到自噬体升高(图5Ce和E)，自噬体升高的细胞数量也是如此(图5D)，再次表明BCL-2b5抑制饥饿诱导的自噬需要NAF-1。自噬的发生率是通过测量含有自噬空泡的细胞数量占细胞总数的百分比来确定的(图5D)通过计算每个样本每个细胞的自噬体数量(图5E)，这与荧光GFP-LC3获得的数据密切相关(图4C和​和5B5亿).

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BCL-2抑制Beclin 1依赖性自噬需要NAF-1。(A类)NAF-1有助于BCL-2和Beclin 1之间的相互作用。用Flag-Beclin 1和LUC或NAF-1 siRNA转染H1299 HA-BCL-2b5细胞。裂解细胞并用抗BCL-2抗体进行免疫沉淀。使用抗Beclin 1和抗BCL-2免疫印迹法对沉淀进行分析。所有通道都来自相同的凝胶和相同的暴露。细白线表示车道已被移除的位置。(B类)NAF-1缺失可阻止BCL-2b5对抗饥饿诱导的自噬。用LUC或NAF-1 siRNA转染H1299 GFP-LC3和BCL-2b5/GFP-LC3细胞，并饥饿4 h图4C. (C类)用LUC或NAF-1 siRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞的代表性电子显微照片，有或没有随后的饥饿。比例尺代表10μm。细胞裂解物通过免疫印迹分析。所有通道都来自相同的凝胶和相同的暴露。细白线表示车道已被移除的位置。电子显微镜观察自噬水平(C类)量化并表示为含有自噬空泡的细胞百分比(D类)或每个细胞的自噬体数量(E类). 每个样本至少计数100个细胞；结果表示平均值±标准误差。

值得注意的是，我们对对照组和NAF-1敲除细胞的电子显微照片分析进行了广泛的回顾，无论营养缺乏与否，我们都没有观察到NAF-1基因敲除对线粒体形态（包括片段化）或与内质网的接近性有任何明显影响。虽然这并不排除对线粒体或ER线粒体功能的影响，但如果存在这种影响，则不会在时间范围（4小时）和此处使用的实验系统中表现出明显的形态学变化。

最后，由于BCL-2b5有效地阻断了对营养剥夺的自噬反应，这取决于其结合伙伴NAF-1，我们证实了饥饿后这两种蛋白质之间的物理联系仍然存在。如所示补充图5在SK-Mel5细胞中观察到内源性BCL-2和内源性NAF-1在营养饥饿和不饥饿4h的情况下的等效免疫共沉淀。

NAF-1与IP3受体的生理和功能关联

BCL-2在ER的一个重要靶点是IP3受体(陈等, 2004；橡树等, 2005)，ER中用于ER-Ca流出的主通道2+与BCL-2与NAF-1的相互作用类似，BCL-2和IP3受体的相互作用不涉及BCL-2 BH3结合沟(荣等, 2009). 此外，这两种基因(林等, 2008)和生物化学(克里奥洛等, 2007；维森西奥等, 2009)证据表明IP3受体参与了自噬的调节。上皮细胞内质网BCL-2升高的一个显著后果是内质网管腔内流动钙储存水平降低2+(Pinton和Rizzuto，2006年). ER钙2+可以通过阻断负责钙的SERCA ATP酶，通过IP3受体快速清除2+吸收到细胞器中。因此，用SERCA ATP酶抑制剂thapsigargin（TG）处理细胞会导致胞浆Ca立即升高2+其大小取决于ER Ca2+水平。如所示图6Aa、b和b，NAF-1敲除对稳态水平或可释放钙无影响2+来自H1299细胞中的ER。然而，其他方面抑制的ER-Ca2+表达BCL-2b5的H1299细胞中的水平恢复到接近正常（对照）(图6Ac、d和B). 此外，与BCL-2b5类似，内源性NAF-1与内源性IP3受体1型在物理上相关，这是通过联合免疫沉淀法判断的(图6C). 因此，NAF-1在物理和功能上与BCL-2在ER（IP3受体）的重要靶点的调节有关。

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NAF-1击倒逆转BCL-2降低ER-Ca2+商店。(A类)用CTRL或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞装载Fura-2AM和ER-Ca2+储存量被测量为细胞质钙的差异2+添加TG前后的浓度（2μM）。显示了在340/380 nm激发波长比和510 nm波长发射下测得的Fura-2AM荧光的代表性痕迹。箭头表示添加TG的时间，δ值表示TG敏感ER-Ca2+商店。(B类)ER Ca差异2+存储显示为三个独立实验的平均±标准误差，如(A类). (C类)共免疫沉淀内源性NAF-1和内源性IP3受体Ⅰ型。收集H1299 HA-BCL-2b5细胞的裂解液，用抗IP3R1抗体进行免疫沉淀。通过免疫印迹分析产生的沉淀物。

讨论

本研究报告了NAF-1的身份，NAF-1是一种位于内质网的小分子（15kDa）早期未经特征化的单跨膜整体蛋白，并表明NAF-1在该膜上是BCL-2的结合伙伴。使用不同的方法，结果进一步表明，在H1299上皮细胞中，BCL-2似乎需要NAF-1来抑制Beclin 1介导的自噬，以应对营养剥夺。Beclin 1已被鉴定为仅含BH3的蛋白质(伊达尔-奥伯施泰因等, 2007)，证实了BCL-2通过直接结合和抑制Beclin 1对抗Beclin 1-介导的自噬的模型(帕廷格等, 2005；迈乌里等, 2007). 鉴于Beclin 1是一种非膜蛋白，具有弱BH3结构域(冯等, 2007；伊达尔-奥伯施泰因等, 2007)然而，位于内质网的BCL-2可以抑制Beclin 1，这一事实需要进一步阐明。例如，最近的研究表明，负责产生富含PI（3）P的膜室的III类PI3K群体的一部分可能在与内质网相关的位点组装，该膜室可以使自噬前小泡的形成成核(斧头等, 2008). 有趣的是，当通过细胞色素b5膜锚定物锚定到内质网膜上时，与PI（3）P（双FYVE域包含蛋白1）相关的该位点的非膜整合成分也可以传递到该位点，这表明该位点可以通过内质网双层内的横向扩散进入。含有Vps34、Beclin 1和在内质网产生PI（3）P富集区室的辅助蛋白的PI3K复合物的组装可能涉及将含有Vps34的囊泡递送到内质网附近，其中Vps34可能与Beclin 1相互作用(斧头等, 2008). 有趣的是，NAF-1的敲除导致LC3在饥饿细胞中的异常分布，包括细胞外围的泡状或丝状结构(图4B). 由于LC3在自噬过程中靶向富含PI（3）P的膜位点，这可能表明NAF-1的缺失会影响PI（3。

一种可能性是，与ER相关的Beclin 1/Vps34 PI3K复合物组装位点也是BCL-2/NAF-1膜整合复合物在ER处可以访问的位点，将ER BCL-2靶向Beclin 1，以抑制Beclin 1/1Vps34 PI 3K复合体的功能。在这种情况下，BCL-2的表达通过BCL-2b5靶向内质网，我们利用NAF-1 siRNA显示了内源性NAF-1对BCL-2b2/Beclin 1相互作用的明确贡献(图5A). 相反，BCL-2与BIK的相互作用不需要NAF-1，BIK能够抑制BCL-2和NAF-1之间的相互作用(图1E). 因此，为什么NAF-1将BCL-2靶向BIK自噬途径而非凋亡途径，最简单的解释是，BCL-2需要NAF-1来相互作用和拮抗Beclin 1相互作用，但BIK不需要NAF-2来与BCL-2相互作用并拮抗其抗凋亡功能。

目前的模型表明，BCL-2与Beclin 1构成性相互作用，并阻止Beclin l启动自噬。另一方面，营养剥夺等自噬刺激可导致BCL-2磷酸化状态的改变(伟等, 2008)或Beclin 1(扎尔克瓦尔等, 2009)以抑制这种相互作用。或者，Beclin 1/BCL-2相互作用可能被竞争的BH3-only蛋白破坏，以响应自噬刺激(迈乌里等, 2007). 在这里使用的表达BCL-2b5的细胞中，根据免疫荧光判断，Beclin 1主要分布在整个细胞中（数据未显示），这与ER处的BCL-2/NAF-1复合物针对Beclin一亚群的想法一致。如果NAF-1促进BCL-2/Beclin 1相互作用，NAF-1不包含BH3域（否则NAF-1将与Beclin 2竞争与BCL-2的相互作用）。早先已经观察到BCL-2和某些结合伙伴之间的BH3-非依赖性相互作用，特别是BCL-2与内质网IP3受体之间的相互作用(荣等, 2009). 对于NAF-1，我们确定细胞溶质区域内的CDGSH结构域是必需的，但不足以实现NAF-1/BCL-2相互作用。尽管NAF-1不包含规范的BH3结构域，但我们还发现ER限制的BH3蛋白BIK能够从BCL-2中取代NAF-1。然而，新出现的证据表明，BCL-2在有效BH3配体的结合上发生了显著的构象变化(德卢戈斯等, 2006；Shore和Nguyen，2008年). 尽管BIK不是一种已知的自噬生理刺激物，也不是对营养剥夺的反应，但其他更相关的BH3-only蛋白质，如BAD(迈乌里等, 2007)可能干扰Beclin BH3-和NAF-1依赖（以及潜在的其他）与BCL-2的相互作用，分解复合物并使Beclin 1从BCL-2抑制中解脱出来。

如上所述，Beclin 1激活的置换模型假设Beclin 2由BCL-2蛋白组成约束，并在BCL-2抑制剂释放后激活。在这个模型中，BCL-2升高可能会抑制自噬，因为自噬刺激无法克服Beclin 1的BCL-2高库。在这里，我们表明NAF-1缺失会干扰BCL-2与Beclin 1相互作用的能力，并强烈抑制BCL-2抑制Beclin 1-介导的自噬以应对营养剥夺的能力。然而，值得注意的是，与模型相反，在没有细胞饥饿应激的情况下（即在对照细胞中）NAF-1的耗竭不会导致自噬的自发诱导。这类似于BCL-2在调节BAX和BAK对凋亡刺激的反应中的功能（参见Shore和Nguyen，2008年). 敲除或抑制促生存BCL-2蛋白只会导致“启动”细胞中的细胞死亡（即，在细胞中存在足够水平的仅激活BH3蛋白或其他机制，一旦消除了促生存成员的抑制作用，就会激活BAX或BAK）。在缺乏这种激活BAX和BAK的启动机制的情况下，抑制促存活剂不会导致细胞死亡。显然，我们表明，NAF-1的敲除本身并不会激活10%血清中维持的细胞系中的自噬，但会减少潜在的BCL-2/Beclin 1相互作用。相反，与对照细胞相比，NAF-1缺乏加上营养剥夺导致自噬增强。这可能意味着自噬诱导可能需要额外的Beclin 1启动。例如，JNK的激活可能导致BCL-2的磷酸化和BCL-2/Beclin 1相互作用的中断(伟等, 2008)或DAPk，导致Beclin 1 BH3结构域磷酸化(扎尔克瓦尔等, 2009)BCL-XL/Beclin 1相互作用或许多其他应激途径的破坏，导致BCL-2/Beclin 1相互作用的抑制和激活Beclin 1-介导的自噬的平行“启动”通路的激活，类似于BAX和BAK的调节。与此模型相一致的是，与充满营养的细胞培养（本研究）相比，在小鼠中发现，靶向性删除工作流2基因(氟化钠-1/cisd2号机组/厄里斯)导致早期衰老和死亡，并有自噬细胞死亡的证据(陈等, 2009). 然而，值得注意的是，这项研究也报道了胚胎成纤维细胞含有工作流2基因缺失在完全培养基中生长正常。一种解释是，活动物体内的累积压力加上NAF-1表达的丧失最终导致自噬增强。

网柄菌的遗传证据表明IP3受体参与自噬(林等, 2008)最近的一份报告提出，该受体可能构成一个平台，允许BCL-2抑制Beclin 1(维森西奥等, 2009). 此外，BCL-2通过ER-Ca介导自噬调节2+已报告调制(布雷迪等, 2007；霍耶·汉森等, 2007; 但请看克里奥洛等, 2007). 鉴于BCL-2与IP3受体的相互作用和ER-Ca的调节直接参与2+商店(希思·恩格尔等, 2008；平通等, 2008)，我们研究了NAF-1的影响。与BCL-2b5类似，内源性NAF-1与IP3受体1型存在物理关联。此外，内质网BCL-2升高可导致内质网钙水平降低2+储存在上皮细胞中(Distelhorst and Shore，2004年；Pinton和Rizzuto，2006年)，但BCL-2b5的这一特性在shRNA击倒NAF-1后丢失。虽然需要进一步研究以确定NAF-1/BCL-2复合物与IP3受体的关联是否以及如何调节自噬，但这些发现将NAF-1与内质网BCL-2调节的主要位点联系起来。此外，据报道，老年小鼠体内存在线粒体损伤工作流2基因缺失(陈等, 2009)，这一事实可以用潜在的钙失调来解释2+通过IP3受体从内质网传递到线粒体。

最后，在工作流2基因导致NAF-1的理论产物被严重截断(图1B)，正是这种截短的基因产物代表了WFS2（一种神经退行性疾病）的潜在病因(金额等, 2007). 由于WFS2突变移除了NAF-1胞质域内的关键BCL-2结合位点，未来研究的一个关键问题是NAF-1调控缺陷的后果，以及可能的自噬对该综合征和其他退行性综合征的影响。此外，重要的是要确定小鼠中的基因缺失是否会重演工作流2突变。至少暂时而言，在H1299细胞中，NAF-1的WFS2突变体在HA标记下的异位表达，其内源性NAF-1被NAF-1 shRNA强烈击倒（不针对WFS2突变），对饥饿诱导的LC3转化没有影响(补充图6). 然而，令人感兴趣的是WFS2蛋白的命运和转基因的表型工作流2-表达WFS2蛋白的空白小鼠。

材料和方法

抗体

本研究中使用了以下抗体：小鼠抗肌动蛋白（ICN）、兔抗Beclin 1（Santa Cruz）、仓鼠抗BCL-2（BD Biosciencesc（c）（BD Biosciences）、小鼠抗FLAG M2（Santa Cruz）、小鼠抗GST（Santa Cruz）、小鼠抗HA（BAbCO）、兔抗IP3R1（亲和生物试剂）、兔抗LC3B（细胞信号传导）和兔抗MCL-1（Stressgen）。针对NAF-1的细胞溶质结构域提高兔pAbs。Jan Parys提供了兔抗IP3R1 Rbt03抗体(帕里斯等, 1995).

细胞培养与腺病毒

如前所述培养SK-Mel5、H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞(日尔曼等, 2005；阮（Nguyen）等, 2007). 为了产生稳定表达GFP-LC3的H1299细胞系，用pEGFP-C1载体（Lipofectamine Plus，Invitrogen）转染细胞，该载体编码大鼠LC3 cDNA（Heidi McBride馈赠）。筛选G418-耐药菌落表达GFP-LC3。生成表达NAF-1-Flag和NAF-1-mut-Flag的腺病毒载体，并按所述进行感染(马泰等, 2002). 对于Ad-BIK感染，按指示时间感染细胞，并如前所述进行caspase-3活性测定(日尔曼等, 2005).

使用shRNA和siRNA敲除NAF-1

为了用慢病毒shRNA击倒NAF-1，将靶序列克隆到pSIH1-H1-Puro shRNA表达Lentivector（System Biosciences）中。NAF-1的靶序列为GGATAGCTTGATTATCTT。非靶向CTRL shRNA，GATCAATAGCAGACTAACACATCAA，由黄胜兵提供(黄和Sinicrope，2008). 根据制造商的协议，使用pPACKH1 Lentivector包装试剂盒（System Biosciences）进行伪病毒生产和慢病毒感染。在慢病毒感染和嘌呤霉素筛选48小时后，按所述处理细胞。NAF-1、Beclin 1和Luciferase的siRNA智能池从Dharmacon购买。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将100 nM siRNA转染细胞，在转染后24 h分裂细胞，并在48 h用siRNA重新转染，在72 h按所述处理或收集细胞。

NAF-1的纯化

来自H1299 BCL-2b5细胞的LM(日尔曼等, 2002)与1 mM BMH交联（Pierce）。对交联LM进行8.5%的制备性SDS–PAGE(Ng公司等, 1997). 合并含有NAF-1/BCL-2的组分，并添加10×RIPA缓冲液（0.5 M Tris pH 7.2，0.45 M NaCl，10%脱氧胆酸钠，10%Triton X-100）以修改免疫沉淀溶液。沉淀物通过SDS-PAGE溶解并用胶体蓝（Invitrogen）染色。切除相应的谱带，并在哈佛微化学设施的Finnigan LCQ DECA XP Plus四极离子阱质谱仪上通过微毛细管反相HPLC纳米电喷雾串联质谱（μLC/MS/MS）进行分析。

NAF-1的克隆

使用H1299 mRNA和源自人类NAF-1序列的PCR引物（GeneBank Accession）通过RT-PCR克隆NAF-1 cDNANM_001008388). 所用引物分别为5′-CCGGATCGAGGAGTGGAGCGTGGCCCGCGT-3′和5′-CGCAATTGTCACCAGTAATATT-3′，含有BamHI和EcoRI位点。PCR用于在KKKEV ER定位信号上游插入Flag-tag。为了生成NAF-1的细胞溶质结构域，将引物5′-CCGGATCTCCCCGAAAGAAAACACAGAAG-3′与全长NAF-1反向引物结合，克隆到pGEX 2T中。C99S C101S C110S H114Q NAF-1突变体是通过PCR定点突变产生的。

免疫荧光

将H1299细胞接种到玻璃盖玻片上，制备样品并如前所述进行可视化(日尔曼等, 2005).

免疫沉淀

从全细胞提取物或交联LM中进行免疫沉淀，然后使用所示抗体进行免疫印迹分析。如前所述，使用抗NAF-1或抗BCL-2抗体进行免疫沉淀(布雷肯里奇等, 2002). 按照说明进行IP3R1免疫沉淀(陈等, 2004)使用抗IP3R1 Rbt03抗体。

GST下拉

使用GST基因融合系统（GE Healthcare）纯化GST融合蛋白并将其偶联到谷胱甘肽珠。使用TNT翻译HA-BCL-2ΔTM®T7系统（Promega）。将裂解产物在HIM缓冲液中稀释，并与GST融合蛋白珠孵育过夜。清洗珠子，用SDS样品缓冲液洗脱，并用western blot进行分析。

自噬分析

细胞要么在EBSS（饥饿培养基）中饥饿4小时，要么在含有10%FCS（正常培养基）的αMEM中维持。如有指示，细胞在100 nM的Baf A1（Sigma）或DMSO载体存在下饥饿。对于LC3转化的免疫印迹分析，细胞被裂解，用15%的SDS–PAGE溶解，并按照说明转移到CAPS转移缓冲液中(维尔德洛等, 2008). 为了分析GFP-LC3，通过光学显微镜观察细胞的GFP-LC2染色，并通过定量GFP-LC3-表达细胞显示点状GFP-LC3.的百分比来测量自噬。对于三份样品，每个样品至少有100个细胞。为了进行电子显微镜分析，细胞生长在玻璃盖玻片上，按照前面所述进行固定、制备和检查(日尔曼等, 2005). 通过定量含有自噬空泡的计数细胞的百分比和定量每个样本每个细胞的自噬体的平均数量来测量自噬。每个样本至少计数100个细胞。

ER钙2+测量

ER钙2+如前所述，测量用CTRL或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞的储存量(日尔曼等, 2005).

补充材料

补充图1

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补充图2

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补充图3

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补充图4

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补充图5

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补充图6

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补充信息

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审查过程文件

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致谢

我们感谢Heidi McBride、Jan Parys和Shengbing Huang提供的试剂和建议。我们非常感谢Peter Rippstein、Yongjie Wei、Bill Lane、Jean-Paul Decuypere、Nhi Nguyen和Mary Sutherland的讨论和出色的技术帮助。NC Chang是加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金博士奖的获得者。这项工作得到了加拿大卫生研究院和加拿大癌症协会的资助。

脚注

提交人声明他们没有利益冲突。

工具书类

  • Amr S、Heisey C、Zhang M、Xia XJ、Shows KH、Ajlouni K、Pandya A、Satin LS、El Shanti H、Shiang R（2007）新型锌指蛋白ERIS中的纯合突变导致Wolfram综合征2.美国人类遗传学杂志 81: 673–683[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Axe EL、Walker SA、Manifava M、Chandra P、Roderick HL、Habermann A、Griffiths G、Ktistakis NT（2008）富含磷脂酰肌醇3-磷酸并动态连接到内质网的膜室形成自噬体.J细胞生物学 182: 685–701[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Boyd JM、Gallo GJ、Elangovan B、Houghton AB、Malstrom S、Avery BJ、Ebb RG、Subramanian T、Chittenden T、Lutz RJ、Chinnadurai G（1995）Bik是一种新型的死亡诱导蛋白，与Bcl-2家族蛋白具有独特的序列基序，并与病毒和细胞生存促进蛋白相互作用.癌基因 11: 1921–1928 [公共医学][谷歌学者]
  • Brady NR、Hamacher-Brady A、Yuan H、Gottlieb RA（2007）hl-1心肌细胞对营养剥夺的自噬反应受Bcl-2和肌/内质网钙储存的调节.FEBS J公司 274: 3184–3197 [公共医学][谷歌学者]
  • Breckenridge DG、Nguyen M、Kuppig S、Reth M、Shore GC（2002）蛋白酶-8亚型，即蛋白酶-8L，在内质网处招募到BAP31复合体.《美国科学院院刊》 99: 4331–4336[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen R、Valencia I、Zhong F、McColl KS、Roderick HL、Bootman MD、Berridge MJ、Conway SJ、Holmes AB、Mignery GA、Velez P、Distelhorst CW（2004）Bcl-2在功能上与肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用，调节内质网对1,4,5-3磷酸肌醇的钙释放.J细胞生物学 166: 193–203[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chen YF、Kao CH、Chen YT、Wang CH、Wu CY、Tsai CY、Liu FC、Yang CW、Wei YH、Hsu MT、Tsai-SF、Tsaii TF（2009）Cisd2缺乏导致小鼠过早衰老并导致线粒体介导的缺陷.基因开发 23: 1183–1194[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ciechmska IA、Goemans GC、Skepper JN、Tolkovsky AM（2009）Bcl-2与Beclin-1复合保持充分的抗凋亡功能.癌基因 28：2128–2141[公共医学][谷歌学者]
  • Criollo A、Maiuri MC、Tasdemir E、Vitale I、Fiebig AA、Andrews D、Molgo J、Diaz J、Lavandero S、Harper F、Pierron G、di Stefano D、Rizzuto R、Szabadkai G、Kroemer G（2007）肌醇三磷酸受体对自噬的调节.细胞死亡差异 14: 1029–1039 [公共医学][谷歌学者]
  • Distelhorst CW，海岸GC（2004）Bcl-2与钙：表面下的争议.癌基因 23：2875–2880[公共医学][谷歌学者]
  • Dlugosz PJ、Billen LP、Annis MG、Zhu W、Zhang Z、Lin J、Leber B、Andrews DW（2006）Bcl-2改变构象以抑制Bax齐聚.欧洲工商管理硕士J 25: 2287–2296[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 冯伟，黄S，吴H，张M（2007）Bcl-xL与Beclin-1 BH3结构域复合物的结构揭示了Bcl-xL靶识别多功能性的分子基础.分子生物学杂志 372: 223–235 [公共医学][谷歌学者]
  • Germain M、Mathai JP、McBride HM、Shore GC（2005）内质网BIK在细胞凋亡过程中启动DRP1调节的线粒体嵴重塑.欧洲工商管理硕士J 24：1546–1556[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Germain M、Mathai JP、Shore GC（2002）BH-3-唯一的BIK在内质网起作用，刺激线粒体释放细胞色素c.生物化学杂志 277: 18053–18060 [公共医学][谷歌学者]
  • Heath-Engel HM、Chang NC、Shore GC（2008）凋亡和自噬中的内质网：BCL-2蛋白家族的作用.癌基因 27: 6419–6433 [公共医学][谷歌学者]
  • Hoyer-Hansen M、Bastholm L、Szyniarowski P、Campanella M、Szabadkai G、Farkas T、Bianchi K、Fehrenbacher N、Elling F、Rizzuto R、Mathiasen IS、Jaatela M（2007）钙、钙调素依赖性激酶激酶-beta和Bcl-2对大细胞自噬的控制.分子电池 25: 193–205 [公共医学][谷歌学者]
  • 黄S，Sinicrope FA（2008）BH3模拟物ABT-737通过不寻求Bim和Bak增强TRAIL介导的人胰腺癌细胞凋亡信号.癌症研究 68: 2944–2951[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Inbal B、Bialik S、Sabanay I、Shani G、Kimchi A（2002）DAP激酶和DRP-1介导细胞程序性死亡过程中膜泡和自噬小泡的形成.J细胞生物学 157: 455–468[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Jackson MR、Nilsson T、Peterson PA（1990年）内质网中跨膜蛋白保留的共识基序的鉴定.欧洲工商管理硕士J 9: 3153–3162[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Kihara A、Kabeya Y、Ohsumi Y、Yoshimori T（2001）Beclin-磷脂酰肌醇3-激酶复合物在反式高尔基网络中的功能.EMBO代表 2: 330–335[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lam D、Kosta A、Luciani MF、Golstein P（2008）肌醇1,4,5-三磷酸受体是自噬细胞死亡的信号分子.分子生物学细胞 19：691–700[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Levine B、Sinha S、Kroemer G（2008）Bcl-2家族成员：细胞凋亡和自噬的双重调节因子.自噬 4: 600–606[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Liang XH、Jackson S、Seaman M、Brown K、Kempkes B、Hibshoosh H、Levine B（1999）beclin 1诱导自噬和抑制肿瘤发生.自然 402: 672–676 [公共医学][谷歌学者]
  • Maiuri MC、Le Toumelin G、Criollo A、Rain JC、Gautier F、Juin P、Tasdemir E、Pierron G、Troulinaki K、Tavernakis N、Hickman JA、Geneste O、Kroemer G（2007）Beclin-1中Bcl-X（L）和类BH3结构域之间的功能和物理相互作用.欧洲工商管理硕士J 26: 2527–2539[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mathai JP、Germain M、Marcellus RC、Shore GC（2002）E1A和p53对凋亡信号的诱导和BIK/NBK内质网定位.癌基因 21：2534–2544[公共医学][谷歌学者]
  • McBride HM、Millar DG、Li JM、Shore GC（1992）线粒体外膜的信号锚定序列选择.J细胞生物学 119: 1451–1457[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 水岛N、山本A、松井M、吉森T、大树Y（2004）体内利用表达荧光自噬体标记的转基因小鼠分析营养素饥饿后的自噬反应.分子生物学细胞 15: 1101–1111[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 水岛N，吉森T（2007）如何解释LC3免疫印迹.自噬 三: 542–545 [公共医学][谷歌学者]
  • Ng FW、Nguyen M、Kwan T、Branton PE、Nicholson DW、Cromlish JA、Shore GC（1997）p28 Bap31，一种内质网中的Bcl-2/Bcl-XL-和procaspase-8相关蛋白.J细胞生物学 139：327–338[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Nguyen M、Marcellus RC、Roulston A、Watson M、Serfass L、Murthy Madiraju SR、Goulet D、Viallet J、Belec L、Billot X、Acoca S、Purisima E、Wiegmans A、Cluse L、Johnstone RW、Beauparlant P、Shore GC（2007）小分子obatoclax（GX15-070）拮抗MCL-1并克服MCL-1介导的凋亡抵抗.《美国科学院院刊》 104: 19512–19517[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Oakes SA、Scorrano L、Opferman JT、Bassik MC、Nishino M、Pozzan T、Korsmeyer SJ（2005）促凋亡BAX和BAK调节1型肌醇三磷酸受体和内质网钙渗漏.《美国科学院院刊》 102: 105–110[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Oberstein A、Jeffrey PD、Shi Y（2007）Bcl-XL-Beclin 1肽复合物的晶体结构：Beclin 1是一种新的BH3-only蛋白质.生物化学杂志 282: 13123–13132 [公共医学][谷歌学者]
  • Parys JB、de Smedt H、Missiaen L、Bootman MD、Sienart I、Casteels R（1995）大鼠嗜碱性白血病细胞作为Ⅱ型家族受体肌醇1,4,5-三磷酸受体IV的模型系统：功能比较和免疫学检测.细胞钙 17: 239–249 [公共医学][谷歌学者]
  • Pattingre S、Tassa A、Qu X、Garuti R、Liang XH、Mizushima N、Packer M、Schneider MD、Levine B（2005）Bcl-2抗凋亡蛋白抑制Beclin 1依赖性自噬.单元格 122: 927–939 [公共医学][谷歌学者]
  • Pinton P、Giorgi C、Siviero R、Zecchini E、Rizzuto R（2008）钙与细胞凋亡：ER-mitochondria Ca2+转运在细胞凋亡控制中的作用.癌基因 27: 6407–6418[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pinton P，Rizzuto R（2006年）内质网中的Bcl-2和Ca2+稳态.细胞死亡差异 13: 1409–1418 [公共医学][谷歌学者]
  • Rashmi R、Pillai SG、Vijayalingam S、Ryerse J、Chinnadurai G（2008）BH3-only蛋白BIK在Bcl-2阴性细胞中诱导具有自噬特征的caspase-independent细胞死亡.癌基因 27: 1366–1375[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Rong YP、Barr P、Yee VC、Distelhorst CW（2009）基于其BH4结构域与肌醇1,4,5-三磷酸受体的相互作用靶向Bcl-2.Biochim生物物理学报 1793: 971–978[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shore GC，Nguyen M（2008）Bcl-2蛋白与细胞凋亡：选择你的伴侣.单元格 135: 1004–1006 [公共医学][谷歌学者]
  • Simpson JC、Wellenreuther R、Poustka A、Pepperkok R、Wiemann S（2000）大规模cDNA测序鉴定新蛋白的系统亚细胞定位.EMBO代表 1: 287–292[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Swerdlow S、McColl K、Rong Y、Lam M、Gupta A、Distelhorst CW（2008年）在糖皮质激素处理的淋巴细胞中，Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用被自噬所取代.自噬 4: 612–620[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Vicencio JM、Ortiz C、Criollo A、Jones AW、Kepp O、Galluzzi L、Joza N、Vitale I、Morselli E、Taller M、Castedo M、Maiuri MC、Molgo J、Szabadkai G、Lavandero S、Kroemer G（2009）肌醇1,4,5-三磷酸受体通过与Beclin 1的相互作用调节自噬.细胞死亡差异 16: 1006–1017 [公共医学][谷歌学者]
  • Wang B、Heath Engel H、Zhang D、Nguyen N、Thomas DY、Hanrahan JW、Shore GC（2008）BAP31与Sec61转座子相互作用，并通过derlin-1复合物促进CFTRDeltaF508的逆转录易位.单元格 133: 1080–1092 [公共医学][谷歌学者]
  • Wei Y、Pattinger S、Sinha S、Bassik M、Levine B（2008）JNK1介导的Bcl-2磷酸化调节饥饿诱导的自噬.分子电池 30: 678–688[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • White C、Li C、Yang J、Petrenko NB、Madesh M、Thompson CB、Foskett JK（2005）Bcl-X（L）对InsP3R调控的内质网凋亡通路.Nat细胞生物学 7: 1021–1028[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wiley SE、Murphy AN、Ross SA、van der Geer P、Dixon JE（2007a）MitoNEET是一种含铁的线粒体外膜蛋白，调节氧化能力.《美国科学院院刊》 104: 5318–5323[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Wiley SE、Paddock ML、Abresch EC、Gross L、van der Geer P、Nechushtai R、Murphy AN、Jennings PA、Dixon JE（2007b）线粒体外膜蛋白mitoNEET含有一个新的氧化还原活性2Fe-2S簇.生物化学杂志 282: 23745–23749 [公共医学][谷歌学者]
  • Yorimitsu T，Klinsky DJ（2005）自噬：自噬的分子机制.细胞死亡差异 12（补充2）: 1542–1552[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zalckvar E、Berissi H、Mizrachy L、Idelchuk Y、Koren I、Eisenstein M、Sabanay H、Pinkas-Kramaski R、Kimchi A（2009）DAP-激酶介导的beclin 1 BH3结构域磷酸化促进beclin-1从Bcl-XL中分离并诱导自噬.EMBO代表 10: 285–292[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Zhu W、Covie A、Wasfy GW、Penn LZ、Leber B、Andrews DW（1996）亚细胞定位受限的Bcl-2突变体揭示了不同细胞类型中不同的凋亡途径.欧洲工商管理硕士J 15: 4130–4141[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团