Antagonism of Beclin 1-dependent autophagy by BCL-2 at the endoplasmic reticulum requires NAF-1

doi:10.1038/emboj.2009.369

.2010年2月3日；29(3):606-18.

doi:10.1038/emboj.2009.369。 Epub 2009年12月10日。

BCL-2在内质网对抗Beclin 1依赖性自噬需要NAF-1

娜塔莎·C·张¹, Mai Nguyen女士, 热尔曼, Gordon C海岸

附属公司

采购管理信息： 20010695
预防性维修识别码：项目经理2830692
内政部： 10.1038/emboj.2009.369

BCL-2在内质网对抗Beclin 1依赖性自噬需要NAF-1

娜塔莎·C·张等。欧洲工商管理硕士J. 2010.

.2010年2月3日；29(3):606-18.

doi:10.1038/emboj.2009.369。 Epub 2009年12月10日。

作者

娜塔莎·C·张¹, Mai Nguyen女士, 热尔曼, Gordon C海岸

附属

¹加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学生物化学与古德曼癌症中心系。

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预防性维修识别码：项目经理2830692
内政部： 10.1038/emboj.2009.369

摘要

除线粒体外，BCL-2位于内质网（ER），是几个不同复合体的组成部分。在这里，我们确定了内质网处的BCL-2相互作用蛋白，即营养剥夺自噬因子-1（NAF-1），这是一种位性整合膜蛋白，其缺陷表达是神经退行性疾病Wolfram综合征2（WFS2）病因的基础。NAF-1在其细胞溶质区域内含有一个双铁双硫配位结构域，这对于与BCL-2的相互作用是必要的，但并不足够。NAF-1被ER限制的BH3-only蛋白BIK从BCL-2中取代，并有助于调节BIK启动的自噬，但不参与BIK依赖的半胱天冬酶激活。与BCL-2类似，NAF-1与肌醇1,4,5-三磷酸受体相关，是BCL-2介导的ER Ca（2+）储存抑制所必需的。在作为自噬生理刺激的营养剥夺期间，已知BCL-2通过抑制自噬效应器和肿瘤抑制因子Beclin 1发挥作用。在内质网BCL-2的这一途径中需要NAF-1，以在功能上拮抗Beclin 1依赖的自噬。因此，NAF-1是一种BCL-2相关的辅因子，以BCL-2为靶点，对抗内质网自噬途径。

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图1
在ER中鉴定新型BCL-2相互作用伙伴NAF-1(一个)仅BH3-BIK在内质网置换BCL-2复合物的一个子集。从H1299 HA-BCL-2b5细胞纯化的LM模拟感染或感染Ad-BIKb5后与BMH交联，并通过免疫印迹观察。星号(^*)表示BCL-2交联产品，由BIK取代。粗体箭头表示包含交联NAF-1/BCL-2的区域。(B类)NAF-1的氨基酸序列。质谱鉴定的肽序列用双下划线表示。TM域由粗体单下划线表示。细胞溶质域中的半胱氨酸残基用星号表示(^*). CDGSH结构域以灰色突出显示，预测的2Fe-2S配位Cys-3-His-1aa以粗体标记。向下的箭头（∧）表示插入Flag表位的位点。双线箭头(⇓) 指示突变（E37Q）时导致WFS2的Glu残基。使用人类蛋白质参考数据库（HPRD）中的磷酸基序查找器发现的预测磷酸化位点在方框中以粗体显示；β-肾上腺素能受体激酶底物基序（aa 25–29）、PKA和PKC激酶底物模序（aa32–34和67–69）以及酪蛋白激酶II底物模式（aa 34–37）。(C)推导了NAF-1的膜拓扑结构。灰色矩形表示CDGSH结构域。(D类)从H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞中纯化的内源性NAF-1在内质网与BCL-2交联。LM经BMH交联，并用抗NAF-1抗体进行免疫沉淀。用抗BCL-2免疫印迹法分析沉淀。(E类)NAF-1由BCL-2替换为BH3-only BIK。H1299 HA-BCL-2b5细胞要么被模拟感染，要么被Ad-BIK感染。纯化的LM按(D类).

图2
NAF-1/BCL-2相互作用。(一个)内源性NAF-1和BCL-2的协同免疫沉淀。收集SK-Mel5细胞的裂解物，用抗NAF-1抗体进行免疫沉淀。用抗BCL-2和抗NAF-1对沉淀进行免疫印迹。(B类)H1299细胞固定并用抗NAF-1和抗Calnexin或抗细胞色素双重染色*c（c）*抗体。比例尺代表10μm。(C)NAF-1-Flag和HA-BCL-2b5的共免疫沉淀。收集感染Ad-NAF-1-Flag的H1299 HA-BCL-2b5细胞的裂解物，并按(一个). (D类)NAF-1的CDGSH铁结合域突变干扰NAF-1与BCL-2的结合。H1299 HA-BCL-2b5细胞感染了Ad-rtTA、Ad-NAF-1-Flag或Ad-NAF-1-mut-Flag（C99S C101S C110S H114Q）。裂解液按(一个). 使用Scion Image软件进行密度分析，以量化NAF-1-Flag和NAF-1-mut-Flag的表达和共沉淀水平。图表描述了共沉淀蛋白与表达水平的比率。(E类)一个功能性CDGSH铁结合结构域是必需的，但不足以实现NAF-1和BCL-2的细胞溶质结构域之间的相互作用。HA-BCL-2ΔTM为*在体外*将翻译成兔网织红细胞裂解物的等分样品添加到每个GST下拉反应中。使用的GST融合蛋白为GST单独、GST-NAF1-C、GST-NAF1-C-mut（C99S C101S C110S H114Q）和GST-MitoNEET-C。使用抗HA和抗GST检测蛋白。

图3
NAF-1不影响BIK启动的凋亡，但在缺乏caspase激活的情况下影响BIK诱导的自噬。(一个)在不存在或存在50μM zVAD-fmk的情况下，用对照（CTRL）或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞被模拟感染或用Ad-BIK感染。细胞裂解物通过免疫印迹分析。(B类)使用荧光底物DEVD-AMC测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性。结果代表三个独立实验的平均±标准差。(C)延长BIK表达和半胱天冬酶抑制可诱导自噬，而NAF-1的敲除可增强自噬。用CTRL或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞在zVAD-fmk存在下感染Ad-BIK达指定时间。细胞裂解物通过免疫印迹分析。通过密度分析将LC3 II水平归一化为肌动蛋白水平。图表描述了每条车道的标准化LC3 II水平。

图4
NAF-1敲除导致饥饿诱导的Beclin 1依赖性自噬的发生率和强度增加。(一个)NAF-1敲除对饥饿诱导的自噬的影响。感染CTRL或NAF-1 shRNA的H1299细胞在含有DMSO（载体）或Baf A1（100 nM）的EBSS中饥饿4小时。细胞裂解物通过免疫印迹分析。(B类)转染LUC或NAF-1 siRNA、未经处理和饥饿的H1299 GFP-LC3细胞中GFP-LC2染色的代表性图像。比例尺代表10μm。(C)自噬的定量表示为表达GFP-LC3的细胞显示点状GFP-LC3.的百分比。每个样本至少计数100个细胞；结果代表三个独立实验的平均±标准差。细胞裂解物通过免疫印迹分析。

图5
BCL-2抑制Beclin 1依赖性自噬需要NAF-1。(一个)NAF-1有助于BCL-2和Beclin 1之间的相互作用。用Flag-Beclin 1和LUC或NAF-1 siRNA转染H1299 HA-BCL-2b5细胞。裂解细胞并用抗BCL-2抗体进行免疫沉淀。使用抗Beclin 1和抗BCL-2免疫印迹法对沉淀进行分析。所有通道都来自相同的凝胶和相同的暴露。细白线表示车道已被移除的位置。(B类)NAF-1缺失可阻止BCL-2b5对抗饥饿诱导的自噬。用LUC或NAF-1 siRNA转染H1299 GFP-LC3和BCL-2b5/GFP-LC2细胞，并饥饿4 h。如图4C所示，对细胞进行分析。(C)用LUC或NAF-1 siRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞的代表性电子显微照片，有或没有随后的饥饿。比例尺代表10μm。细胞裂解物通过免疫印迹分析。所有通道都来自相同的凝胶和相同的暴露。细白线表示车道已被移除的位置。电子显微镜观察自噬水平(C)被定量并表达为含有自噬液泡的细胞的百分比(D类)或每个细胞的自噬体数量(E类). 每个样本至少计数100个细胞；结果表示平均值±标准误差。

图6
NAF-1击倒逆转BCL-2降低ER-Ca²⁺商店。(一个)用CTRL或NAF-1 shRNA处理的H1299 neo和HA-BCL-2b5细胞装载Fura-2AM和ER-Ca²⁺储存量被测量为细胞质钙的差异²⁺添加TG前后的浓度（2μM）。显示了在340/380 nm激发波长比和510 nm波长发射下测得的Fura-2AM荧光的代表性痕迹。箭头表示添加TG的时间，δ值表示TG敏感ER-Ca²⁺商店。(B类)ER Ca差异²⁺存储显示为三个独立实验的平均±标准误差，如(一个). (C)共免疫沉淀内源性NAF-1和内源性IP3受体Ⅰ型。收集H1299 HA-BCL-2b5细胞的裂解液，用抗IP3R1抗体进行免疫沉淀。通过免疫印迹分析产生的沉淀物。

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Beclin 1相互作用组内凋亡和自噬之间的串扰。
Maiuri MC、Criollo A、Kroemer G。 Maiuri MC等人。 EMBO J.2010年2月3日；29(3):515-6. doi:10.1038/emboj.2009.377。 EMBO J。2010年。采购管理信息：20125189 免费PMC文章。

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