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.2001年4月；2(4):330-5.
doi:10.1093/embo-reports/kve061。

Beclin-磷脂酰肌醇3-激酶复合物在反式高尔基网络中的功能

A基哈拉 1, Y卡贝亚, Y Ohsumi先生, T吉森
附属公司

Beclin-磷脂酰肌醇3-激酶复合物在反式高尔基网络中的功能

一个Kihara等人。 EMBO代表. 2001年4月.

摘要

自噬是一种细胞内的体蛋白降解系统。众所周知，Beclin参与了这一过程；然而，其作用尚不明确。在这项研究中，我们发现Beclin与磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶共同免疫沉淀，这也是自噬所必需的，这表明Beclin是PtdIns3-激酶复合物的组成部分。使用交联剂进行的定量分析表明，所有Beclin与PtdIns 3-激酶形成复合物，而约50%的PtdIns 3-激酶仍不含Beclin。间接免疫荧光显微镜显示，大多数Beclin和PtdIns 3-激酶定位于反高尔基网络（TGN）。一些PtdIns 3-激酶也分布在晚期内体中。这些结果表明，Beclin和PtdIns 3-激酶在TGN作为复合物控制自噬。

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数字

无
图1。Beclin和PtdIns 3-激酶形成复合物。(A类)用Triton X-100溶解从HeLa细胞制备的细胞裂解物，并使用免疫前血清（第1道）或抗Beclin抗体（第2道和第3道）进行免疫沉淀。免疫沉淀与磷脂酰肌醇[γ]孵育-32P] 锰存在下的ATP和60µM冷ATP2+（车道1和2）或Mg2+（车道3）在30°C下保持5分钟。(B类)按照（A）中所述制备的抗Beclin抗体的免疫沉淀物在沃特曼浓度为0 nM（车道1）、1 nM（道路2）、10 nM（通道3）、100 nM（路径4）的情况下，检测PI 3-激酶活性。用薄层色谱法提取并分离标记的脂质，然后用生物成像分析仪BAS2000（富士胶片）进行放射自显影检测。(C类)用Triton X-100溶解从HeLa细胞制备的细胞裂解物，并与蛋白A固定化的抗Beclin抗体（通道2）或抗PtdIns 3-激酶抗体（通道4）孵育。作为对照，使用了各自抗体（1道和3道）的免疫前血清。通过SDS–PAGE分离保留的蛋白质，并用抗PtdIns 3-激酶（上图）和抗Beclin（下图）抗体进行免疫印迹检测。
无
图2。Beclin和PtdIns 3-激酶的交联。(A类)用DSP（泳道3、4、7和8）或其溶剂二甲基亚砜（泳道1、2、5和6）在4°C下处理总细胞裂解物2小时。用SDS溶解蛋白质，并使用蛋白质A固定的抗PtdIns 3-激酶（PtdIns 3-K）（泳道1-4）或Beclin（泳道5-8）抗体进行免疫沉淀。用1×SDS样品缓冲液（62.5 mM Tris–HCl pH 6.8，2%SDS，10%甘油，微量溴酚蓝）洗脱免疫沉淀物。用5%2-巯基乙醇处理后，用SDS-PAGE分离蛋白质，然后用抗Beclin（上面板）和抗PtdIns 3-激酶（下面板）抗体进行免疫印迹检测。(B类)从HeLa细胞制备的细胞裂解物通过10万离心进行亚细胞分离克持续1h。对膜（1和3道）和上清液（2和4道）部分进行SDS-PAGE，然后用抗PtdIns 3-激酶（1和2道）和抗Beclin（3和4道的）抗体进行免疫印迹。(C类)膜（1-4车道；100 000克，30分钟，颗粒）和可溶部分（车道5–8；100 000克用DSP（3、4、7和8道）或二甲基亚砜（1、2、5和6道）处理HeLa细胞制备的上清液。用SDS溶解蛋白质，并使用蛋白A固定的抗PtdIns 3-激酶抗体进行免疫沉淀。在还原条件下用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，然后用Beclin抗体进行免疫印迹检测。F和E分别表示流经和洗脱压裂。
无
图3。Beclin将定位到TGN。希拉牌手表(A类，D类，E类和F类)，BNL CL.2级(B类)和H-4-II-E电池(C类)生长在盖玻片上。在（C、D和E）或（A、B和F）用3%多聚甲醛固定后，用洋地黄素使细胞渗透。细胞被抗Beclin（A–F，左面板）和抗syntaxin 6（A和B，中面板）、抗TGN38（C，中面板。在合并的图像（右侧面板）中，黄色表示共同定位。棒材，10µm。
无
图4。PtdIns 3-激酶的免疫荧光定位。希拉牌手表(A类和C类)和H-4-II-E电池(B类)进行渗透、固定，然后进行免疫染色。用抗PtdIns 3-激酶（A–C，左面板）和抗突触蛋白6（A，中面板）、抗TGN38（B，中面板，或抗LBPA（C，中面板。）抗体对细胞进行双重标记。棒材，10µm。
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    1. Domin J.和Waterfield，M.D.（1997）使用结构来定义磷脂酰肌醇3激酶家族成员的功能。FEBS信函。，410, 91–95.-公共医学
    1. Dunn W.A.Jr（1990）《自噬机制的研究：自噬空泡的形成》。细胞生物学杂志。，110, 1923–1933.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gillooly D.J.、Morrow，I.C.、Lindsay，M.、Gould，R.、Bryant，N.J.、Gaullier，J.-M.、Parton，R.G.和Stenmark，H.（2000）酵母和哺乳动物细胞中磷脂酰肌醇3-磷酸的定位。EMBO J.，19，4577–4588。-项目管理咨询公司-公共医学

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