DAP-kinase-mediated phosphorylation on the BH3 domain of beclin 1 promotes dissociation of beclin 1 from Bcl-XL and induction of autophagy

doi:10.1038/embor.2008.246

.2009年3月；10(3):285-92.

doi:10.1038/embor.2008.246。 Epub 2009年1月30日。

DAP-激酶介导的beclin 1 BH3结构域磷酸化促进beclin-1从Bcl-XL中分离并诱导自噬

埃纳特·扎克瓦尔¹, 汉娜·贝瑞西, 利亚特·米兹拉奇, 尤利娅·伊德尔丘克, 伊泰·科伦, 米里亚姆·艾森斯坦, 海伦娜·萨巴奈, 罗尼特·平卡斯·克拉玛斯基, 阿迪·泡菜

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DAP-激酶介导的beclin 1 BH3结构域磷酸化促进beclin-1从Bcl-XL中分离并诱导自噬

埃纳特·扎克瓦尔等。 EMBO代表. 2009年3月.

.2009年3月；10(3):285-92.

doi:10.1038/embor.2008.246。 Epub 2009年1月30日。

作者

埃纳特·扎克瓦尔¹, 汉娜·贝瑞西, 利亚特·米兹拉奇, 尤利娅·伊德尔丘克, 伊泰·科伦, 米里亚姆·艾森斯坦, 海伦娜·萨巴奈, 罗尼特·平卡斯·克拉玛斯基, 阿迪·金奇

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摘要

自噬是一种进化上保守的过程，在细胞保护和程序性细胞死亡机制中都具有功能。Beclin 1是一种重要的自噬蛋白，最近被鉴定为一种BH3域蛋白，与Bcl-2抗凋亡家族成员结合。beclin 1与其Bcl-2抑制剂的分离对其自噬活性至关重要，因此应严格控制。在这里，我们表明死亡相关蛋白激酶（DAPK）调节这一过程。DAPK的激活形式以beclin-1依赖的方式触发自噬。DAPK磷酸化位于BH3结构域关键位置的Thr 119上的beclin 1，从而促进beclin 1从Bcl-XL中分离并诱导自噬。这些结果揭示了作为自噬机制核心蛋白之一的DAPK底物，并提供了一种新的基于磷酸化的机制，可以减少beclin 1与其抑制剂的相互作用，从而激活自噬机理。

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利益冲突声明

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数字

图1
DAPK和beclin 1之间的功能相互作用。(一个)用DAPKΔCaM或对照载体（pcDNA3-luciferase，LUC）、靶向beclin 1或HcRed的shRNAs以及GFP–LC3质粒转染HEK293细胞。72小时后，计数细胞并制备裂解物。(一个)量化了点状GFP–LC3荧光细胞占总GFP–LC阳性细胞的百分比。所提供的数据是100个转染细胞的三倍体的平均值±标准差。星号表示重要性等级*P（P）*=0.001. (B类)使用所指示的抗体进行蛋白质印迹分析。(C)转染对照shRNA（HcRed）和pcDNA3-luciferase或DAPKΔCaM的细胞的代表性GFP-LC3染色。钙调素；死亡相关蛋白激酶；绿色荧光蛋白；HEK，人胚胎肾；短发夹RNA。

图2
Beclin 1是DAPK的一种新底物。(一个)标记标记的DAPK（100 ng）与GST（900 ng）或GST–beclin-1（750 ng）在Ca存在下孵育²⁺钙调素和[γ-³³P] ATP作用30分钟或60分钟。通过X射线胶片曝光观察磷酸化蛋白，通过Ponceau S染色观察GST/GST–beclin-1水平。DAPK的自磷酸化表明其催化活性在所有样品中都是完整的。(B类)将标记的DAPK（60 ng）与从HEK293T细胞中纯化的标记的beclin 1（250 ng）孵育，并进行60分钟的激酶分析。如有指示（+LiCl），首先在0.5 M LiCl和0.5 M KCl中严格清洗beclin-1结合珠。通过X射线胶片曝光观察磷酸化蛋白，并使用beclin 1抗体通过Western blot分析观察beclin 1的水平。死亡相关蛋白激酶；GST、谷胱甘肽*S公司*-转移酶；HEK，人类胚胎肾。

图3
DAPK和beclin 1之间的物理相互作用。(**澳大利亚**)将COS7细胞、HEK293T细胞的蛋白质提取物或不将提取物添加到细菌产生的GST或GST–beclin-1中。取下的蛋白质以及总细胞提取物，用指示的抗体进行印迹。(抗体)添加提取物的GST和GST–beclin-1的Ponceau S染色。(B类)用标记beclin 1或缺失Bcl-2结合域（ΔBD）的标记beclin-1与Bcl-X联合转染HEK293细胞_L（左）和HA-标记的DAPK。使用Flag抗体对Beclin 1进行免疫沉淀，并用DAPK、Bcl-X对共免疫沉淀蛋白以及总细胞提取物进行印迹_L（左）和beclin 1抗体。(C)用Flag–beclin-1或Flag–GFP转染HEK293细胞，并使用Flag抗体对Flag标记的蛋白质进行免疫沉淀，并用过量的Flag肽洗脱。在不同暴露时间，印迹与DAPK抗体或Flag抗体反应。死亡相关蛋白激酶；绿色荧光蛋白；GST、谷胱甘肽*S公司*-转移酶；HA、血凝素；HEK，人类胚胎肾。

图4
DAPK磷酸化位于其BH3结构域内的Thr 119上的beclin 1。(一个)将细菌纯化的DAPK催化结构域在30°C下与对应于beclin 1的BH3结构域（aa 108–127）的肽浓度增加（5–10 nmol）和Thr 119被丙氨酸取代的相同肽孵育15分钟。安*在体外*进行激酶分析，并将反应应用于Whatman过滤器。测量TCA不溶性计数的总水平，并绘制底物浓度图。数据是三个实验的平均值±标准差。(B类)beclin 1的BH3结构域与Bcl-X疏水囊相互作用的模型_L（左）。青色箭头指向可容纳磷酸化Ser 113的凹槽。黑色箭头指向可能被Thr 119磷酸化破坏的位点。品红色箭头指向带正电的凹槽，其中可以容纳磷酸化的Ser 127。(C)将标记的DAPK（60 ng）与GST–WT beclin 1或GST–T119A beclin 1（1000 ng）在钙的存在下孵育²⁺Ponceau S染色显示GST-beclin 1水平，并用磷酸化Thr 119抗体（Western blot）检测Thr 119的磷酸化。(D类)用带或不带ΔCaM DAPK的标记beclin 1联合转染HEK293细胞。24小时后，使用Flag抗体从细胞中免疫沉淀beclin 1，免疫沉淀与phosphoThr 119抗体反应。Ponceau染色显示等量的免疫沉淀beclin 1。细胞提取物印迹与血凝素抗体或beclin 1抗体反应。钙调素；DAPK，死亡相关蛋白激酶；GST、谷胱甘肽*S公司*-转移酶；HEK，人胚胎肾；TCA，三氯乙酸。

图5
DAPK促进beclin 1从Bcl-X中分离_L（左）. (一个)用标记的beclin 1和Bcl-X转染HEK293细胞_L（左）有或没有血凝集素标记的DAPK。使用Flag抗体对Beclin 1进行免疫沉淀，并使用指示的抗体对共免疫沉淀蛋白以及总细胞提取物进行印迹。(B类)用标记的T119A或T119E beclin 1突变体和Bcl-X联合转染HEK293细胞_L（左）使用Flag抗体对Beclin 1进行免疫沉淀，并使用指示的抗体对共免疫沉淀蛋白以及总细胞提取物进行印迹。(C)将5或10μg T119A或T119E beclin 1突变体与GFP–LC3质粒一起转染HEK293细胞。24小时后，计数细胞并制备裂解物。(一)代表性GFP–LC3染色。(b条)量化了点状GFP–LC3荧光细胞占总GFP–LC阳性细胞的百分比。给出的数据是100个转染细胞的三次重复实验的平均值±标准差。星号表示重要性等级：^**P（P）*=0.01;^***P（P）*=0.005。(**c（c）**)使用所示抗体进行Western blot分析。(D类)用Bcl-X转染HEK293细胞_L（左）、带或不带血凝集素标记活化DAPK（ΔCaM）的标记beclin 1（WT）或标记T119A beclin l突变体。使用Flag抗体对Beclin 1进行免疫沉淀，并使用指示的抗体对共免疫沉淀蛋白以及总细胞提取物进行印迹。Bcl-X水平_L（左）使用NIH图像软件定量，免疫沉淀和表达Bcl-X的比率_L（左）已计算。(E类)转染Bcl-X后24小时HEK293细胞的透射电镜照片_L（左）、标记beclin 1和ΔCaM或pcDNA3-核糖核酸酶作为对照。中的图像(**c（c）**)和(d日)在ΔCaM处理的较高放大倍数下拍摄（见比例尺）AV’表示自噬液泡。钙调素；死亡相关蛋白激酶；绿色荧光蛋白；GST、谷胱甘肽*S公司*-转移酶；HEK，人胚胎肾；美国国立卫生研究院。

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