功能丧失分析表明Omi/HtrA2不是的基本组件粉红色/派金通路在体内

奥米空突变体是雄性不育的，但表现出不同于粉红色1或停车场空突变体

为了进一步探讨奥米因为它与粉红色1，我们对奥米突变体。的内生功能奥米在里面果蝇属由于缺乏功能丧失突变体，尚未进行充分研究。该分析与奥米因为它与PD有关，因为奥米在帕金森病患者中观察到的是功能丧失或显性阴性突变，并没有导致活动增加。为了获得功能丧失突变奥米，我们使用了TILLING(Till等人，2003年)一种检测化学诱变后感兴趣基因中甲基磺酸乙酯（EMS）诱导的点突变的方法。我们在奥米,奥米^{国家统计局}和一个错义突变V110E（见下文）。截短的蛋白质由奥米^{国家统计局}预计缺乏蛋白酶域和PDZ域的活性位点(图3A类)，因此代表一个空等位基因。纯合的苍蝇奥米^{国家统计局}是半致命的。然而，苍蝇携带奥米^{国家统计局}转化为该地区的缺陷，英国国防部（3R）ED5644，完全可行，表明致命性与奥米^{国家统计局}是由背景突变引起的。普遍表达RNAi的苍蝇-奥米使用tubulin-Gal4驱动器也是可行的。RNAi的沉默效应-奥米被其完全抑制的能力所证实奥米过度表达诱导的眼睛表型（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)。正如预期的那样，使用抗Omi抗体进行的Western blotting显示，在奥米^{国家统计局}/英国国防部（3R）ED5644苍蝇（补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).

在单独的窗口中打开

图3。

奥米空突变体显示精子发生缺陷，但睾丸线粒体形态正常。A类，Omi域示意图。MTS，线粒体靶向序列。TM，跨膜结构域。IBM，IAP-binding motif。的确切位置奥米^{国家统计局}和奥米^V110E型分别用蓝色和红色星号表示。B类，Omi/HtrA2在高度保守区域的不同物种中的序列比对，其中保守缬氨酸在奥米^V110E型，标记为红色。C–E类,C′–E′，睾丸的相控显微照片。与控制飞行相比(C类,C′)，其中精囊（箭头）充满精子（暗相），奥米突变体(D类,D′)显示一个空的精囊（括号内有星号），可以通过奥米过度表达(E类,E′)（箭头指向精囊）。C′–E′精囊的高分辨率视图来自C–E类.F–H（飞行高度），一个合胞体囊肿内投资锥的Phalloidin染色。与投资锥排列良好的控制相反，这表明同步运动(F类),奥米突变体在一些囊肿中显示出分散的投资锥，表明个体化存在轻微缺陷(G公司)，可以通过奥米过度表达(H（H）).输入-输出“洋葱期”精子细胞线粒体的示意图和相控显微照片(I–L型)和“叶片阶段”(我,M–O型)。与野生型相比(J型,M（M）),奥米突变体在这两个阶段都没有任何缺陷(K（K）,N个)，而粉红色1在洋葱期，突变体在nebenkern中表现出液泡化（红色箭头）(L（左）)叶片期野生型中的线粒体衍生物（黄色箭头）有一种，而不是两种(O（运行）).P–S公司，个体化后囊肿部分的示意图和透射电镜图像。每个精子细胞在单个质膜内都包含一个轴丝（橙色箭头）和线粒体衍生物（红色箭头）。这个奥米突变囊肿(R（右）)显示精子细胞的紊乱和偶尔的个体化缺陷（数据未显示）。然而，与粉红色1突变体，表现出线粒体的大小和形态严重受损(S公司),奥米突变囊肿显示正常线粒体(R（右）)。基因型：野生型：w个/是；控制：w个/是；奥米^{国家统计局}/+;奥米突变体：w个/是；奥米^{国家统计局}/英国国防部（3R）ED5644;奥米突变体+救援：w个/是；TMR公司-奥米/+;奥米^{国家统计局}/英国国防部（3R）ED5644。比例尺：C–E类500微米；问-答500纳米。

奥米^{国家统计局}/英国国防部（3R）ED5644苍蝇，以下简称奥米突变体没有表现出任何明显的外部缺陷。奥米突变体雌性可以生育（96%，n个=50），但奥米突变雄性不育（100%，n个= 110). 在这些雄性中，储存成熟精子的精囊是空的(图3D类,D′)，没有观察到活动精子，这表明精子的产生或向精囊的转运存在缺陷。确保这些表型归因于缺乏奥米，我们产生了多个表达奥米特别是在雄性生殖系（TMR-奥米)。的过度表达奥米使用抗Omi抗体（补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)。这些品系中有许多是雄性不育系。然而，10个品系中有3个是可育的。这些可育系表现出较弱的奥米而不是不育系（补充图S3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)。这表明不育是由高水平的过度表达引起的，可能导致Omi蛋白酶的混杂活性。引进任何肥沃的奥米过度表达线进入奥米突变背景导致精囊中存在活动精子(图3E类,E′)和恢复生育能力（95%，n个= 100). 基因组拯救转基因的单个拷贝包含奥米，但不是周围的基因，也完全挽救了雄性不育的奥米突变体（100%，n个= 50). 这些结果表明奥米对精子发生至关重要。

我们还分析了第二个奥米EMS等位基因。V110对应于人类Omi/HtrA2中的V154，它位于一个高度保守的区域(图3A类,B类)结构研究预测Omi/HtrA2的同质化，激活其蛋白酶活性所需(Li等人，2002年).奥米^V110E型/英国国防部（3R）ED5644和奥米^V110E型/奥米^{国家统计局}突变果蝇也具有雄性不育性（0%，n个= 45; 0%，n个=65），显示精囊空，没有活动精子，表明奥米^V110版本很可能是一个空的或强的低形态等位基因。这些结果提供了体内支持三聚基序对Omi功能的重要作用，并表明Omi的蛋白酶活性对其调节精子发生的作用至关重要。

因为粉红色1突变体也表现出雄性不育，我们询问是否奥米突变睾丸显示线粒体形态缺陷，这是粉红色1突变体(Clark等人，2006年;邓等人，2008)。期间果蝇属精子发生，线粒体发生显著形态学变化(富勒，1993年)。干细胞分化后，有丝分裂和减数分裂伴随不完全胞质分裂，形成64个精子细胞的合胞囊。早期精子细胞经历线粒体聚集和融合，产生两个巨大的线粒体，形成一个球形结构，称为nebenkern(富勒，1993年)。在相控显微镜下，这种“洋葱期”精子细胞可以被鉴定为具有两个相邻的球形结构：细胞核和内本核(图3我,J型)。在随后的精子细胞伸长过程中，内本核开始展开，在这个“叶片”阶段产生两个线粒体(图3我,M（M）)。在伸长后，精子细胞经历一个称为个体化的过程，在这个过程中，连接一个囊肿内64个精子细胞的细胞质桥被打破，多余的细胞质被挤出(富勒，1993年)。这种个性化的过程需要以肌动蛋白为基础的结构（称为投资锥）的同步运动。个体化后，每个精子细胞的尾部主要由轴丝、运动所需的微管结构和线粒体衍生物组成(图3P（P）,问).

正如预期的具有线粒体靶向序列的蛋白质一样，Omi定位于nebenkens（参见图6A–C)。在洋葱期精子细胞中粉红色1突变体表现出明显的空泡化(图3L（左）)，以及在随后的叶片阶段粉红色1和停车场突变体只含有一种线粒体衍生物(图3O（运行）)而不是野生型的(图3M（M）) (Clark等人，2006年;Riparbelli和Callaini，2007年;邓等人，2008)。令人惊讶的是奥米突变体与野生型突变体没有区别。在洋葱期，内本核边缘光滑，没有观察到液泡化(图3K（K）)。在叶片期，奥米突变精子细胞含有两种线粒体衍生物，而不是在粉红色1或停车场突变体(图3N个).粉红色1和停车场如透射电镜所示，突变体在个体化后阶段的线粒体形态也显示出明显缺陷(图3S公司) (Greene等人，2003年;Clark等人，2006年;Riparbelli和Callaini，2007年;邓等人，2008)。相比之下，线粒体在匹配的阶段表现正常奥米突变体，尽管单个精子细胞在囊肿内有点紊乱(图3R（右）)。此外，投资在奥米突变体分散(图3G公司与…相比F类)，表明这些结构的运动是异步的。这种表型与个体化缺陷有关(Huh等人，2004年)。虽然个体化缺陷被特异性试验抑制奥米过度表达(图3H（H）)，我们不能排除精子发生的其他个体化后步骤中的缺陷也可能导致与奥米突变体。这种可能性似乎特别可能，因为在奥米突变体似乎相对温和。综上所述，奥米睾丸中的突变表型与粉红色1或停车场突变体，其中观察到线粒体形态缺陷。

与…对比粉红色1突变体，奥米突变体没有显示多巴胺能神经元丢失、肌肉变性或线粒体完整性缺陷

接下来，我们问是否奥米突变体的表型与粉红色1其他组织和环境中的突变体。奥米突变体对多种应激诱导剂敏感，包括百草枯（一种自由基诱导剂）；鱼藤酮，它损害线粒体呼吸链中的复合物I活性(Przedborski和Ischiropoulos，2005年); 蛋白质折叠抑制剂；和高浓度盐（补充图S4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料)。因此不是对氧化应激特别敏感，奥米突变果蝇通常对压力敏感。这些结果可能表明奥米突变体，特别是因为奥米突变体的寿命缩短（补充图S5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料).

据报道，多巴胺能神经元的数量随着年龄的增长而减少粉红色1或停车场突变体(Meulener等人，2005年;Park等人，2006年;Yang等人，2006年) (图4A类,B类,D类,E类)。相反，奥米突变体在40天龄的苍蝇大脑中没有表现出任何多巴胺能神经元损失(图4C类,F类).粉红色1或停车场突变体还表现出显著的间接飞行肌退化，线粒体形态严重受损，嵴断裂，这在1至2岁的果蝇中尤为明显(图4我,J型与…相比G公司,H（H）) (Greene等人，2003年;Pesah等人，2004年;Clark等人，2006年;Park等人，2006年;Yang等人，2006年)。相反，尽管Omi在肌肉中表达并定位于线粒体（数据未显示），奥米突变体没有表现出任何肌肉退化，即使它们老化了30天(图4K（K）)。EM分析奥米突变体肌肉也没有表现出线粒体完整性的任何缺陷(图4L（左）)。总之，我们的数据表明奥米突变体，与粉红色1突变体在包括精子细胞和肌肉在内的多个组织中不显示线粒体形态缺陷。奥米突变体也不能显示多巴胺能神经元的丢失粉红色1突变体。

在单独的窗口中打开

图4。

奥米空突变体没有显示多巴胺能神经元丢失、肌肉变性或线粒体形态缺陷。A–C，40d龄野生型全脑的抗酪氨酸羟化酶免疫染色(A类),粉红色1突变体(B类)、和奥米突变体(C类)苍蝇。对每个基因型的17到27只个体苍蝇（两个半球）进行了计数。D类，示意图描绘了成年人大脑中主要多巴胺能神经元簇的位置，如缩写所示(Nässel and Elekes，1992年)。主要多巴胺能神经元簇位于大脑后表面附近，但位于前表面附近的原大脑前外侧（PAL）除外（标记为灰色）。PPL，前脑后外侧；前脑后内侧；VUM，腹侧不成对内侧。E类,F类，每簇多巴胺能神经元的量化粉红色1突变苍蝇和野生型苍蝇(E类)、和奥米突变苍蝇和野生型苍蝇(F类)在25°C下老化40 d。错误栏代表SD和Studentt吨测试用于统计分析*第页< 0.05; **第页< 0.01.G–L间接飞行肌纤维甲苯胺蓝染色(G公司,我,K（K）)和这些肌肉的EM研究(H（H）,J型,L（左）)。线粒体的边界用白色虚线标记。与…对比粉红色1突变体(我,J型),奥米突变体没有显示肌肉退化或线粒体形态缺陷(K（K）,L（左）)，即使年龄达到30天。基因型：野生型：w个/年。奥米突变体：w个/是；奥米^{国家统计局}/英国国防部（3R）ED5644。粉红色1突变体：w粉红色1⁵/年。比例尺：H（H）,J型,L（左），1微米。

功能丧失研究未能检测到粉红色1和奥米

为了进一步探讨以下假设：奥米和粉红色1为了共同调节线粒体的完整性，我们在这些基因功能丧失的基础上寻找遗传相互作用。之间的遗传相互作用粉红色1和停车场为测试奥米和粉红色1以共同的方式行动(Clark等人，2006年;Park等人，2006年)。我们以及其他人之前已经表明粉红色果蝇1和停车场以共同的遗传途径行事粉红色1上游功能停车场(Clark等人，2006年;Park等人，2006年;Yang等人，2006年)。这一结论是基于几项观察结果得出的。功能丧失突变粉红色1和停车场导致线粒体完整性的高度相似（如果不完全相同）缺陷(Clark等人，2006年;Park等人，2006年;Yang等人，2006年;邓等人，2008;Poole等人，2008年)。尽管过度表达停车场救援粉红色1空突变表型，过度表达粉红色1未能救援停车场零突变表型(Clark等人，2006年;Park等人，2006年)。此外，双突变体消除了两者粉红色1和停车场表现出与单个突变体相同的表型(Clark等人，2006年;Park等人，2006年).

与…对比粉红色1(图5C类,H（H）)或停车场过度表达(Clark等人，2006年)，特定于测试奥米过度表达并不能挽救雄性不育或线粒体表型粉红色1突变体（0%可育，n个= 65) (图5D类,我)。类似于S306A、S276C、G399S或S400A（见下文）的Omi突变型的表达也没有挽救雄性不育粉红色1突变体（0%可育，n个> 30). 同样，奥米过度表达导致肌肉完整性的大量丧失，也未能挽救肌肉退化表型粉红色1突变体。此外，蛋白酶死亡型Omi S266A的表达不会导致肌肉完整性的丧失，也未能挽救肌肉表型粉红色1突变体（数据未显示）。与假设一致粉红色1和奥米功能独立，奥密克戎的表达水平和线粒体定位在粉红色1突变体(图6D–F型).

在单独的窗口中打开

图5。

之间缺乏遗传交互作用粉红色1和奥米线粒体形态的功能丧失研究。A–J，“洋葱期”精子细胞线粒体的相控显微照片(A–E)和“叶片阶段”(F–J型).粉红色1空突变体显示nebenkens的空泡化(B类)和一个线粒体衍生物(G公司)。这种表型可以被粉红色1过度表达（过度反应）(C类,H（H）)，但不是由奥米过度表达(D类,我)。双突变体同时去除粉红色1和奥米函数结果粉红色1无任何增强的突变体样表型(E类,J型)。红色箭头表示nebenkern的液泡化，黄色箭头表示每个线粒体衍生物。K–N（K–N）间接飞行肌线粒体用丝裂原原纤维蛋白标记。与对照组相比(K（K）),粉红色1突变体表现出丝裂原纤维蛋白信号的整体水平降低，以及大量强烈的纤维蛋白信号(L（左）)，完全可以通过粉红色1过度表达(M（M）)。双突变体粉红色1和奥米显示粉红色1突变体样表型(N个)。基因型：A类,F类,w个.B类,G公司,w粉红色1⁵/年。C类,H（H）,w粉红色1⁵/是；TMR公司-粉红色1/+.D类,我,w粉红色1⁵/是；TMR公司-奥米/+.E类,J型,w粉红色1⁵/是；奥米^{国家统计局}/英国国防部（3R）ED5644.K（K）,FM6公司/是；Mef2-Gal4，UAS-mitoGFP/+。L（左）,w粉红色1⁵/是；Mef2-Gal4，UAS-mitoGFP/+。M（M）,w粉红色1⁵/是；Mef2-Gal4、UAS-mitoGFP/UAS-粉红色1.N个,w粉红色1⁵/是；Mef2-Gal4，UAS-mitoGFP/UAS-RNAi-奥米.

在单独的窗口中打开

图6。

Omi定位于线粒体，其表达在粉红色1空突变体；Pink1表达在奥米也有突变体。A–F、野生型卵泡期精子细胞的双重标记(A–C)和粉红色1突变体(D–F型)使用Prosα6T-GFP（绿色）标记细胞核，使用抗Omi抗体（红色）标记nebenkern。在粉红色1零突变体，Omi仍然定位于精子细胞的nebenknes。G公司，使用基因组拯救转基因对内源性Pink1-9Myc表达进行Western blotting（WB）。损失奥米功能不会改变Pink1的解理模式。

调查是否粉红色1的下游功能奥米，我们进行了反向救援实验。然而，粉红色1过度表达未能挽救雄性不育奥米突变体（0%可育，n个=70）。此外，Pink1的蛋白质水平和卵裂模式在奥米突变体(图6)。因此，我们没有找到任何积极的证据表明奥米的上游或下游功能粉红色1在共同的道路上。

为了检验以下假设奥米可能与粉红色1以部分冗余的方式，我们生成了两个突变体，将两者都删除粉红色1和奥米。这些双突变果蝇是活的，存活率与粉红色1仅突变体。这些动物是雄性不育动物，在精子细胞和肌肉中表现出线粒体形态缺陷，与粉红色1仅突变体，表明奥米功能未增强粉红色1突变表型(图5E类,J型,N个; 与…相比B类,G公司,L（左）)。总之，我们失去了功能体内研究没有为以下假设提供支持：奥米的上游或下游功能粉红色1，或与粉红色1至少在线粒体完整性的调节方面。

Omi和Pink1的相互作用

观察到的遗传相互作用粉红色1和停车场作为检验以下假设的重要参考奥米和粉红色1以共同的方式行动。与…对比粉红色1突变体，显示肌肉和睾丸线粒体完整性存在显著缺陷，多巴胺能神经元数量减少，奥米突变体显示肌肉和睾丸的线粒体形态正常，多巴胺能神经元数量正常。此外，与停车场过度表达，奥米过度表达无法挽救粉红色1突变表型。的过度表达粉红色1也未能挽救因奥米功能丧失。缺乏粉红色1不影响Omi的水平或亚细胞定位，Pink1水平和处理在奥米突变体。此外，双突变体消除了两者粉红色1和奥米表现出与粉红色1只有突变体，这表明粉红色1没有负面调节奥米还有那个奥米不执行部分冗余功能粉红色1。这些数据加在一起不会提供任何体内支持以下假设的证据奥米在同一途径的上游或下游的功能粉红色1或以平行方式调节线粒体形态。这些基于功能损失的分析与PD相比更为相关奥米基于过度表达的分析，因为报告Omi/HtrA2与PD相关的突变被认为是功能丧失或显性负突变(施特劳斯等人，2005年).

之间的遗传相互作用粉红色1和奥米已被我们（见结果）和其他人观察到(Whitworth等人，2008年)在基于眼睛的过度表达研究中：粉红色1具有奥米结果小眼表型与任一蛋白的表达无关。虽然是孤立的，但这些结果可以用一个模型来解释，其中奥米和粉红色1共同途径中的功能(Whitworth等人，2008年)，这个模型很难与我们丢失的函数数据相协调。细胞基础粉红色1过度表达诱导的眼部表型及其与正常内源性作用的关系粉红色1在调节线粒体功能方面，尚不清楚。虽然无突变体粉红色1和停车场在几乎所有测试的分析中，表现出高度相似（如果不完全相同）的表型粉红色1导致粗糙的眼睛表型，而过度表达停车场不（未显示数据）(Poole等人，2008年;Whitworth等人，2008年)。此外，一种引起帕金森病的激酶缺陷突变形式粉红色1，但未能救援粉红色1多组织中的空突变表型，仍与奥米在基于眼睛的过度表达检测中，表明Pink1激酶活性是线粒体功能所必需的，但不是与奥米在本试验中。根据我们的发现，我们可以得出以下结论：粉红色1调节其与奥米不同于粉红色1和停车场调节线粒体形态。这种线粒体完整性独立的作用粉红色可能很重要，但尚未确定体内。或者，也可以粉红色-omi眼睛中观察到的相互作用在生理上并不相关。过度表达研究，以及在体外研究可以确定被迫发生但通常不会发生的交互作用。例如，当蛋白质过度表达时，可能会作用于不适当的靶点或作用于不合适的亚细胞隔室，从而产生细胞毒性。结合使用，这种毒性可能会增强。基于过度表达的观察结果进一步表明了这种可能性，这些观察结果将菱体7作为Pink1的上游正调控因子(Whitworth等人，2008年)。这一结论很难与更多基于生理功能丧失的观察结果相一致，这些观察结果表明菱形果蝇7促进线粒体融合的功能(McQuiban等人，2006年)，而两者都是粉红色1和停车场促进线粒体分裂的功能(邓等人，2008;Poole等人，2008年;Yang等人，2008)。无论如何，我们的功能丧失研究表明奥米在调节线粒体完整性方面不起重要作用粉红色/派金通路。他们留下了相互作用的可能性粉红色1和奥米是调节性的，或在其他情况下很重要。然而，这些体内上下文仍有待确定。