Dis模型机械。2008年9月至今;1(2-3): 168–174.
菱形-7和HtrA2/Omi与帕金森病因子Pink1和Parkin共同作用于一条通路
,1中,2,*‡ ,三,‡ ,1中,2 ,三 ,4和三,*
亚历山大·惠特沃思
1MRC发育和生物医学遗传学和
2英国谢菲尔德大学生物医学系,谢菲尔德,S10 2TN
杰弗里·R·李
三加拿大多伦多大学生物化学系,M5S 1A8
维纳斯·M·W·何
1MRC发育和生物医学遗传学和
2英国谢菲尔德大学生物医学系,谢菲尔德,S10 2TN
罗伯特·弗利克
三加拿大多伦多大学生物化学系,M5S 1A8
鲁赫娜·乔杜里
4英国商品研究所,伦敦学院,林肯酒店,伦敦,WC2A 3PX,英国
G.安格斯·麦克奎班
三加拿大多伦多大学生物化学系,M5S 1A8
1MRC发育和生物医学遗传学和
2英国谢菲尔德大学生物医学科学系,S10 2TN
三加拿大多伦多大学生物化学系,M5S 1A8
4CRUK,伦敦研究所,Lincoln’s Inn Fields,London,WC2A 3PX,UK
‡这些作者对这项工作贡献均等
收稿日期:2007年11月17日;2008年6月16日接受。
- 补充资料
补充材料
GUID:DBC577F9-9380-49ED-9247-849C75D595B4
GUID:31CE0E11-5BFF-4B15-845B-0B7F9E629DCB
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总结
帕金森病(PD)是一种常见的由中脑多巴胺能神经元缺失引起的神经退行性疾病,其发病机制尚不清楚。线粒体功能障碍长期以来一直与散发性PD有关,最近被强调为一个关键的病理原因,特别是在确定了线粒体突变后PTEN诱导的假定激酶(pink1),停车场和htrA2(也称为omi)与PD相关的基因黑腹果蝇已经证明了粉红色1和停车场作用于维持线粒体完整性的共同遗传途径,但该途径的其他上游或下游成分目前尚不清楚。利用果蝇眼睛中的异位表达作为一种检测方法,我们研究了由奥米在Pink1/Parkin途径中发现,它在粉红色1但功能独立于Parkin。使用相同的方法,我们还发现Rhomboid-7,一种以前未参与PD的线粒体蛋白酶,充当此途径的上游成分,并表明需要裂解Pink1和Omi的前体形式。这些数据进一步阐明了Pink1通路的组成,并表明受调控的膜内蛋白水解参与其调控。
结果
Omi在Pink1下游,独立于Parkin
果蝇复眼形成约800个小眼的典型晶格()。果蝇过度表达粉红色1导致小眼排列紊乱和眼球外部形态粗糙()。这一表型与Pink1/Parkin通路的正常功能的生理相关性可以从以下原因推断出来:粉红色1过度表达,通过去除作用于Pink1下游的Parkin显著抑制()。此外,两者的过度表达粉红色1和停车场导致严重的粗糙眼表型,这大大超过了粉红色1或停车场仅过度表达(和补充材料图S1B)。这些数据与pink1过度表达表型是通过pink1的正常生理靶点通过信号放大而获得的这一发现相一致,这表明该系统是测试某些基因是否与粉红色1.
果蝇眼睛的Gentic上位性分析表明Parkin和Omi在Pink1下游起作用。表达转基因的苍蝇眼睛的扫描电子显微镜(SEM)图像。(A) 仅GMR-GAL4驱动程序即可显示规则排列的小眼的野生型眼睛形态。的过度表达粉红色1导致眼睛粗糙表型(B),该表型在停车场突变体(C)。(D) 两者过度表达粉红色1和停车场表现出增强的表型。(E) 两者过度表达粉红色1和奥米也显示出强烈的相互作用。(F)奥米突变体抑制粉红1型粗糙的眼睛。(G) Parkin和Omi在基因上没有相互作用。(H)停车场突变体不抑制Pink1/Omi相互作用,和(I)奥米突变体不抑制Pink1/Parkin相互作用。(J) 两者的损失停车场和奥米完全抑制pink1过度表达表型。(K) 50多只特定基因型苍蝇的平均值+s.d,相对粗糙度盲分(见方法)。
PD-linked线粒体丝氨酸蛋白酶Omi以Pink1依赖方式磷酸化(Plun-Favreau等人,2007年); 然而,Omi和Pink1/Parkin通路之间的功能关系尚未得到证实。因此,我们试图测试Omi是否在Pink1通路中发挥作用,并确定其与粉红色1和停车场.测试奥米和粉红色1,我们评估了奥米和粉红色1过度表达和功能丧失。的过度表达奥米单独使用不会导致眼表紊乱,但会导致色素沉着的丧失(补充材料图S1C,E)。双重过度表达奥米和粉红色1导致眼睛尺寸急剧缩小()表明有很强的遗传相互作用。此外,pink1过度表达表型在很大程度上受到奥米功能()。相反,由于奥米在粉红色1突变背景(补充材料图S1F)。验证通过丢失奥米并不是由于非特异性防止凋亡,我们表达了泛型蛋白酶抑制剂P35,并发现这并没有抑制pink1的过度表达表型(补充材料图S1H)。这些数据共同表明奥米作用于下游粉红色1.
考虑到粉红色1和奥米,我们惊讶地发现停车场和奥米没有这种协同作用()。为了更好地理解这些因素之间的上位关系,我们测试了停车场或奥米功能丧失突变破坏了与粉红色1我们发现,通过共同表达粉红色1和奥米不会因失去停车场()。类似地粉红色1/停车场交互不受影响奥米突变体()。这些发现表明停车场不在粉红色1/奥米相互作用和奥米在中不起作用粉红色1/停车场交互,建议停车场那个和奥米在下游平行路径中的功能粉红色1。该通路的分叉也解释了为什么在以下情况下抑制粉红1型粗视是不完整的停车场或奥米已删除。为了进一步支持这种解释,我们发现停车场和奥米两者都被去除,pink1过表达表型被完全抑制()。综上所述,这些结果与两者一致停车场和奥米作用于下游粉红色1但在独立的途径中。
菱形-7基因相互作用粉红色1,停车场和奥米
果蝇的突变表型菱形-7与粉红色1和停车场因此,我们假设Rhomboid-7可能在Pink1/Parkin途径中发挥作用。为了探索菱形-7和粉红1之间的潜在功能关系,我们利用果蝇的眼睛进行了一系列遗传相互作用实验。的过度表达菱形-7导致粗糙的眼睛表型,并广泛失去鬃毛(); 两者的表达菱形-7和粉红色1共同增强了这种表型,导致眼睛小得多,形态扭曲,鬃毛完全脱落()。重要的是,当菱形-7催化丝氨酸残基突变为丙氨酸残基时,这种强相互作用显著减少()。要解决的上位关系菱形-7和粉红色1我们将过表达基因型与功能丧失突变背景相结合。有趣的是,我们发现菱形-7的过度表达表型在粉红色1突变背景;值得注意的是,猪鬃的数量恢复了正常()。相比之下,pink1过度表达表型(紊乱和粗糙)在菱形-7突变背景(;)表明菱形-7作用于的上游粉红色1.
遗传上位性分析表明,Rhomboid-7是Pink1通路的上游调节器。(A) 的过度表达菱形-7导致眼睛粗糙表型。两者过度表达菱形-7和粉红色1通过需要Rhomboid-7(C)的催化丝氨酸的相互作用增强粗糙的眼睛(C)。菱形-7表型在粉红色1突变体(D),而pink1表型在菱形-7突变体(E)。菱形-7过表达也通过与停车场(F) 和奥米(G) ●●●●。菱-7和Omi的协同作用需要菱-7(H)的催化丝氨酸。菱形-7表型也被丢失的停车场(一) 和奥米(J) ●●●●。(K) 50多只特定基因型苍蝇的平均值+标准日数,对相对粗糙度进行盲法评分(见方法)。
符合停车场和奥米作为的下游效应器粉红色1,我们发现停车场和奥米也作用于下游菱形-7.过度表达菱形-7无论是哪一种停车场或奥米显示出强烈的遗传相互作用,导致眼部组织严重缺失()。此外,菱形-7的过度表达表型在两种细胞中都被部分抑制停车场或奥米突变背景()。将这些数据放在一起菱形-7的上游粉红色1与这两者共同发展停车场和奥米()。另外,因为其他证据表明停车场和奥米在下游独立行动粉红色1,我们发现奥米和停车场突变体分别不抑制菱形-7/parkin和菱形-7/omi协同表型(补充材料图S1I,J)。
Pink1和Omi的解理需要菱形-7。(A) Western blot分析具有指定基因型的全蝇裂解物中Pink1-myc的表达。粉色1以两种形式出现,长形式(箭头)和短形式(带星号的箭头),在菱形-7突变体。Tubulin表达式用作加载控件。(B) 将成年苍蝇细胞差速离心分离为线粒体(有丝分裂)和细胞质(细胞质)部分。孔蛋白和微管蛋白分别表示线粒体和细胞质的分离。(C) 左侧面板:对全苍蝇裂解物中内源性Omi进行的western blot分析,显示Omi的长形式(箭头)和短形式(带星号的箭头),在菱形-7变种苍蝇。右侧面板:经Omi特异性双链RNA处理的S2细胞的western blot分析。线粒体内膜蛋白CV-α被用作负载对照。(D) 利用FLAG标记的Rhomboid-7和Rhombiod-7 S256A催化突变体对S2细胞中Omi-HA表达进行Western blot分析。(E) 果蝇Pink1通路示意图。
Rhomboid-7需要在体内处理Pink1和Omi
之间的遗传相互作用菱形-7,粉红色1,停车场和奥米表明可能存在一些物理和功能交互作用;因此,我们研究了这些因素之间的分子关系。与已知的线粒体功能一致,菱形-7、粉红1和Omi相互共存()以及果蝇S2细胞内膜ATP酶复合物V(CV-α)的α亚单位(补充材料图S2A),表明它们可以进行物理相互作用。为了验证这一点,我们使用培养的果蝇细胞进行免疫沉淀分析。我们发现Omi和Pink1都能与Rhomboid-7发生物理相互作用,因为这两种蛋白在各自的免疫沉淀分析中都能用Rhombiod-7检测到()。有趣的是,我们还检测到Pink1和Omi之间的相互作用()与最近的一份报告一致,该报告表明Omi以Pink1依赖的方式磷酸化(Plun-Favreau等人,2007年)。此外,我们还发现当Pink1和Parkin在培养的果蝇细胞中表达时,它们在免疫沉淀物中共同纯化()。为了证明外源性免疫沉淀分析中蛋白质相互作用的特异性,我们研究了其他潜在的相互作用,发现Rhomboid-7与内膜ATP酶的CV-α亚基之间没有关联,也没有与外膜蛋白Porin关联(补充材料图S2D,E)。
菱形-7、Pink1和Omi在线粒体中发生物理相互作用。(A) 菱形-7和Omi的共表达(顶行);粉红色1和菱形7(中排);果蝇S2细胞中的Pink1和Omi(底行)在线粒体中显示出各自的共同定位。(B)Rhomboid-7-FLAG与Omi-HA在S2细胞的免疫沉淀。(C) Rhomboid-7-FLAG与Pink1-HA在S2细胞中的免疫沉淀。(D) Pink1 FLAG与Omi HA在S2细胞中的免疫沉淀。(E) Parkin-HA与Pink1-FLAG在S2细胞中的免疫沉淀。
Rhomboid-7与Pink1和Omi的物理相互作用,再加上我们的遗传相互作用和上位性数据,表明Pink1与Omi可能是Rhombiod-7膜内蛋白水解的靶点。为了测试Pink1在体内的处理过程,我们使用了一个9myc标签粉红色1由内源性启动子驱动表达的转基因系,此前已证明其功能正常(Clark等人,2006年)。与之前的报告一致,我们发现Pink1是两种不同的亚型()全长型和C末端部分,在假定的跨膜结构域被裂解(Muqit等人,2006年)。为了测试Rhomboid-7是否在Pink1的加工过程中发挥作用,我们评估了菱形-7突变背景。令人惊讶的是,我们发现在没有菱形-7的情况下,不再发现粉红色1的较短亚型(和补充材料图S2F)。值得注意的是,这种短亚型的生产在野生型的重新引入后恢复菱形-7转基因。这一结果表明,Rhomboid-7是加工全长Pink1所必需的。鉴于Pink1在线粒体内外的重要作用,我们评估了这两种Pink1亚型的亚细胞定位。虽然两种类型的Pink1都存在于线粒体中,但我们发现只有依赖Rhomboid-7的较短亚型Pink1在体内和体外的细胞质中组成性存在(; 补充材料图S2C)。
为了确定Omi是否为菱形-7底物,我们在体内分析了Omi蛋白模式。野生型苍蝇内源性Omi的检测显示有三种亚型(),与前面描述的全长表单和两个处理过的表单一致(Challa等人,2007年)。在菱形-7空变种苍蝇,Omi的一个较短形式丢失(以及补充材料图S2F),表明该处理事件需要菱形-7。此外,当奥米与共同表达菱形-7在培养的细胞中,短型Omi的数量相对于长型增加,而催化活性的菱形-7对Omi处理没有影响()。此外,最近的一份报告确定,与菱体依赖亚型相对应的裂解位点位于假定的跨膜结构域内(Khan等人,2008年)。这些数据强烈表明,菱形-7膜内蛋白酶执行这种切割。有趣的是,Rhomboid-7对Pink1和Omi的切割似乎在功能上很重要,因为在我们的眼睛检测中,它们的协同遗传相互作用在Rhombiod-7的催化丝氨酸突变后显著减弱().
由于处理线粒体内膜的两种跨膜蛋白Pink1和Omi似乎需要Rhomboid-7,因此我们试图确定Rhombiod-7是否是线粒体内膜蛋白的非选择性蛋白酶。目前已知的线粒体内膜栓系形式存在的蛋白质并不多,它们通过蛋白质水解产生可溶性形式,但其中一种蛋白质是动力相关GTPase视神经萎缩1(OPA1)(Satoh等人,2003年)。因此,我们评估了在体内切割OPA1(dOpa1)的果蝇直系后代是否需要Rhomboid-7。尽管我们检测到dOpa1的多个亚型,但Rhomboid-7的缺失并不影响这些亚型的相对丰度(补充材料图S2B),这表明dOpa1-7的加工不需要Rhombiod-7。
总之,我们的结果表明,Rhomboid-7切割Pink1通路的两个不同成分,这种活性对信号传导具有重要的功能,至少在我们的检测系统中是如此。
讨论
果蝇的遗传分析在阐明PD的病理机制方面取得了重大进展粉红色1和停车场研究表明,它们通过共同的途径维持线粒体内环境稳定(Clark等人,2006年;Park等人,2006年;Yang等人,2006年); 然而,该途径的其他成分尚未在体内得到证实。我们在苍蝇眼睛中使用遗传方法,试图识别Pink1通路的其他成分。我们已经证明线粒体膜内蛋白酶Rhomboid-7作用于Pink1的上游,此外,我们还发现Omi在Pink1下游发挥功能,但其作用途径独立于Parkin().
我们还发现需要Rhomboid-7来切割Pink1和Omi的全长形式;它们各自的遗传相互作用所需的处理事件。这在很大程度上与最近的一项研究一致,该研究表明,早老素相关的菱形蛋白酶(PARL),即rhomboid-7的哺乳动物直系同源物,促进脊椎动物奥密克戎的切割(Chao等人,2008年); 然而,我们注意到与这份报告存在一些差异。我们发现,果蝇Rhomboid-7和Omi可以进行物理相互作用,并且Rhombiod-7对于在体内和体外处理一种Omi亚型都是必要的。相反,脊椎动物PARL并不直接与OMI相互作用,需要HAX1(果蝇中未发现的Bcl-2家族蛋白)来处理它;然而,在脊椎动物PINK1的加工过程中,PARL的作用是否与果蝇Rhomboid-7相似尚待确定。
最近,Omi被证明以Pink1依赖的方式被磷酸化(Plun-Favreau等人,2007年)尽管这种相互作用的功能重要性尚不清楚。我们的研究证实了Pink1与Omi的相互作用,并进一步证明了Omi在Pink1下游发挥作用。然而,令人惊讶的是,我们没有发现任何证据表明奥米与基因相互作用停车场相反,我们的认知实验表明停车场和奥米作为独立的下游效应器粉红色1虽然新的证据表明Pink1/Parkin途径可能影响线粒体动力学,但Pink1/Omi途径的功能目前尚不清楚。
我们的亚细胞分离结果证实了以前的报道,即在细胞质中发现了Pink1的加工形式(Haque等人,2008年;Takatori等人,2008年)而在那里并没有发现裂开的果蝇Omi(Challa等人,2007年;Khan等人,2008年)。虽然已知Omi释放到胞浆中可以诱导细胞凋亡(Vande Walle等人,2008年)相反,Omi最近被证明与Pink1合作,可能位于线粒体内,以促进细胞存活(Plun-Favreau等人,2007年)。值得注意的是,细胞质Pink1已被证明可以保护神经元免受毒害(Haque等人,2008年),这表明它在线粒体外还有其他重要的未知功能。这些结果共同表明Pink1和Omi的线粒体和细胞质形式可能具有不同的功能,进一步,我们已经确定的菱形依赖性裂解可能在调节这些亚型的丰度和定位方面发挥重要作用。
有趣的是,虽然Pink1/Parkin途径最近与线粒体动力学有关(Exner等人,2007年;Poole等人,2008年;Yang等人,2008)–控制线粒体形态的裂变和融合反应过程–酵母、苍蝇和哺乳动物中线粒体菱形体的功能以前也与线粒体动力学有关(McQuiban等人,2003年;Cipolat等人,2006年;McQuiban等人,2006年)。需要进一步的工作来确定这些PD信号通路成分在线粒体动力学中的作用和/或重要性,但我们的研究结果进一步表明了Pink1通路的这一功能的重要性。
总之,我们对果蝇的分子和遗传学研究表明,线粒体Rhomboid-7通过调节线粒体内膜结合和裂解形式的Pink1和Omi的水平参与Pink1途径。然而,还需要进一步的研究来确定脊椎动物的通路是否具有类似的组成,以及该通路如何维持神经元的完整性。
方法
飞行股票
黑腹果蝇在标准条件下,在玉米粉琼脂培养基上饲养。玻璃多重报告器(GMR)-GAL4驱动线来自布鲁明顿果蝇库存中心,为了保持一致性,始终使用同一条线。菱形-7ΔP空突变体(McQuiban等人,2006年),停车场25空突变体和停车场与上游激活序列(UAS)相结合-停车场)已在前面进行了描述(Greene等人,2003年).粉红色1B9公司空变种苍蝇和UAS-粉红色1和UAS-奥米序列是J.Chung(KAIST)的礼物(Park等人,2006年)、和粉红色1-9myc转基因系由M.Guo(加州大学洛杉矶分校)提供(Clark等人,2006年)。无人机-菱形-7使用网关系统(华盛顿卡内基研究所)建造。损失omi/htrA2通过使用omi/htrA2null突变体,由N.Tapon(CRUK)提供,或使用UAS-奥米-来自M.Miura(东京大学)的RNAi(Igaki等人,2007年); 这两种方法都给出了等效的表型。
扫描电子显微镜和眼睛定量
根据标准方案进行扫描电子显微镜(SEM)(Sullivan等人,2000年)。给定基因型的所有动物显示基本相同的表型,并显示随机选择的代表性图像。部分粗视眼表型的量化通过以下方式实现:由一名研究人员收集特定基因型,编码并交给另一名研究者进行盲评。相对粗糙度评分是与已知的、未编码的“标准”苍蝇,即GMR/+苍蝇或过表达的苍蝇进行比较粉红色1(GMR>Pink1)或菱形-7(GMR>R7)。我们给GMR/+苍蝇的相对粗糙度评分为0,给GMR>Pink1或GMR>R7苍蝇的评分为3。”在解剖显微镜下,测试苍蝇与一些“标准”基因型的样本苍蝇并排观察。与已知标准相比,给每只苍蝇一个相对粗糙度得分:
0–完美WT眼,无畸变;完美的端面/刷毛对齐
1–WT不完美,略显粗糙/杂乱无章
2–略低于GMR>Pink1/R7标准的粗糙度;组织程度更高
3–与GMR>Pink1/R7标准的相同/等效粗糙度
4–比GMR>Pink1/R7标准更粗糙。
与“标准”基因型相同的成群苍蝇也被纳入盲评。为了一致性,一名研究人员对所有个体苍蝇进行了评分。在去除盲法之前,至少收集了50只苍蝇的得分。此外,另一位研究人员评估了成组的编码苍蝇(修饰物和适当的对照物),并对各组的粗糙度进行了相对排序。排名组与得分个体苍蝇的详细数量完全一致。
免疫组织化学
将接种在刀豆球蛋白A包被的盖玻片上的转染的果蝇S2细胞在PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟,在PBS中的0.1%TX-100中透化15分钟,在PBS中的10%山羊血清中封闭过夜,然后在室温下与10%山羊血清中的一级和二级抗体在PBS中孵育(每次1-2小时),并在孵育之间在PBS内进行大量洗涤。使用以下主要抗体:小鼠M2抗体(Sigma)、兔抗HA抗体(Simma)、小鼠抗CVα抗体(线粒体)。Alexa Fluor 546和488-共轭二级抗体(Invitrogen)用于使用蔡司LSM 510共焦显微镜检测一级抗体。
免疫沉淀、分离和免疫印迹
用FuGENE6(Roche)瞬时转染S2细胞。转染后48小时收获细胞,并在IP缓冲液(150mM NaCl、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、1%TX-100、0.5%NP-40)中用蛋白酶抑制剂混合物(Bioshop Canada)和PMSF裂解。1000离心后克,用蛋白G Sepharose珠(Invitrogen)预处理裂解产物,与一级抗体孵育过夜,然后用蛋白G Sepharose珠子沉淀标记蛋白。通过差速离心分离整只成虫。在最初的1500之后克旋转,线粒体在10–10时沉淀三 克当细胞液从剩余的细胞器中纯化出来时,作为上清液,经过100–10三 克旋转。使用了以下主要抗体:小鼠M2抗体(Sigma)、小鼠HA7抗体(Simma)、兔抗HA抗体(Sigram)、鼠抗myc抗体(Santa Cruz Biotechnology)、鼠抗体Tubulin抗体(西格玛)、兔抗体Porin/VDAC抗体(Siga)和兔抗Omi抗体(Masayuki Miura慷慨赠送)。
致谢
我们感谢J.K.Chung、N.Tapon、M.Guo和M.Miura提供的苍蝇种群,并感谢谢菲尔德大学光电显微镜中心的协助。我们感谢D.Strutt和J.Parker对手稿的批判性阅读。A.J.W.还感谢L.Pallanck对手稿的批判性阅读以及他持续的支持和鼓励。这项工作得到了英国帕金森病学会(4063)和Wellcome信托基金会(081987)向A.J.W.、加拿大卫生研究院(303157)向G.A.M.以及向V.M.-W.H.颁发的MRC学生奖学金的资助。MRC发育和生物医学遗传学中心由G070091资助。
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