被活活吃掉：大型自噬的历史

摘要

术语“自噬”来自希腊语单词“phagy”，意思是吃，“auto”意思是自我。自噬是真核生物中一个进化上保守的过程，通过这个过程，隔离在双膜囊泡内的细胞质货物被输送到溶酶体进行降解。当40多年前首次发现自噬时，细胞为什么会自我消化自己的成分，这一点令人困惑。最简单的假设是自噬是一种细胞垃圾处理机制。然而，我们后来了解到，这种“自噬”过程不仅可以清除细胞内错误折叠或长寿命的蛋白质、多余或受损的细胞器以及入侵的微生物，而且是一种适应反应，在暴露于各种压力时提供营养和能量。自噬已与人类病理生理学联系在一起，我们对自噬知识的不断扩展已对癌症、神经退行性变、免疫反应、发育和衰老等广泛领域产生了影响。这条时间表回顾了自噬研究的历史，重点关注了过去15年中发生的关键事件，当时我们对这个过程的分子理解才刚刚开始。

自噬概念的发展

40多年前，克拉克和诺维科夫在被称为“致密体”的膜结合隔室中观察到小鼠肾脏的线粒体，随后发现其中包括溶酶体酶^1,2阿什福德和波特后来在暴露于胰高血糖素的大鼠肝细胞中观察到含有半消化线粒体和内质网的膜结合小泡^三Novikoff和Essner观察到相同的小体中含有溶酶体水解酶⁴一年后，即1963年，在汽巴基金会溶酶体专题讨论会上，德杜夫创造了“自噬”一词，用来描述在各种解体状态下含有部分细胞质和细胞器的单膜或双膜小泡。他指出，这些隔离囊泡或“自噬体”与溶酶体有关，出现在正常细胞中。自噬体周围膜的起源仍有争议；德杜夫认为隔离膜来源于预制膜，如滑面内质网⁵.

细胞自噬在正常大鼠肝细胞中观察到，但在饥饿动物的肝脏中增强⁶1967年，de Duve and Deter证实胰高血糖素诱导自噬⁷十年后，Pfeifer证明了相反的情况——胰岛素抑制自噬⁸Mortimore和Schworer的开创性工作进一步证明，氨基酸是自噬降解的最终产物，对大鼠肝细胞的自噬具有抑制作用⁹这些早期证据与我们目前对自噬作为一种适应性分解代谢和能量生成过程的理解是一致的。随后，Seglen和Gordon对自噬进行了第一次生化分析，并将药理试剂3-甲基腺嘌呤确定为自噬抑制剂¹⁰; 他们还首次证明蛋白激酶和磷酸酶可以调节自噬¹¹.

从20世纪50年代到80年代初，这些早期的自噬研究都是基于形态学分析。德杜夫和其他人主要检查了该过程的末端阶段，即与溶酶体融合之前或之后的步骤。塞格伦实验室随后的研究开始使用电针注入放射性探针来检测自噬的早期和中期步骤，从而鉴定吞噬体（形成自噬体的最初隔离囊泡；图1)以及两性体（由自噬体和内体融合形成的非溶酶体囊泡¹²).

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图1

自噬的示意图。(一)在酵母中，自噬和Cvt途径都吞噬不同双膜囊泡内的货物，这些囊泡被认为起源于吞噬体组装位点（PAS）。PAS被定义为自噬相关（Atg）蛋白募集的初始位点。Cvt途径是选择性自噬的一个例子，也是生物合成自噬相关途径的唯一例子。Cvt囊泡（直径140-160 nm）似乎紧紧包裹着特定的物质——Cvt复合物（由氨肽酶I-prApe1的前体形式和Atg19受体组成），并排除了大量细胞质。自噬体（直径300-900纳米）吞噬细胞质，包括细胞器和Cvt复合体。然后，完整的囊泡与哺乳动物溶酶体的酵母类似物液泡融合，并将内部单膜囊泡（自噬或Cvt体）释放到腔中。随后内囊泡的破裂使prApe1成熟并降解细胞质，从而通过液泡渗透循环产生的大分子。(b条)哺乳动物的自噬是由吞噬细胞的形成开始的，随后是一系列步骤，包括吞噬细胞的伸长和扩张，双膜自噬体（包围部分细胞质）的闭合和完成，自噬体通过与内体（融合的产物被称为两栖体）和/或溶酶体（融合的产物被称为自溶体）对接和融合而成熟，自噬体内膜和货物通过自溶体内的酸性水解酶分解和降解，并通过渗透酶回收产生的大分子。到目前为止，还没有证据表明哺乳动物细胞中存在PAS，因此哺乳动物吞噬体可能等同于酵母PAS，或源自PAS。还描述了核心分子机制，如自噬诱导所需的ULK1和ULK2复合物，参与自噬体形成的III类PtdIns3K复合物，可能有助于将膜递送到形成的自噬体的哺乳动物Atg9（mAtg9）和两个缀合系统，LC3-II和Atg12–Atg5–Atg16L复合物，建议在吞噬细胞膜的伸长和膨胀过程中发挥作用。

早在20世纪60年代，德杜夫就提出，大多数（如果不是全部的话）活细胞必须采用一种机制，对溶酶体中自身细胞质的部分进行非特异性的分离和消化⁵但也暗示需要一种选择性的蛋白水解机制来作用于异常的细胞蛋白质或细胞器。1973年，Bolender和Weibel提供了一些第一批证据，证明特定的细胞器（滑面内质网）可以被自噬吞噬¹³四年后，Beaulaton和Lockshin认为线粒体在昆虫变态过程中被选择性清除¹⁴1983年，Veenhuis证明多余的过氧化物酶体通过酵母中的自噬选择性降解多形Hansenula polymorpha¹⁵五年后，Lemasters及其同事发现线粒体膜电位的改变导致自噬的发生¹⁶酵母和高等真核生物的后续研究进一步证明了自噬具有选择性。

分子时代

自20世纪90年代末开始，对自噬的分子控制的深入研究彻底改变了检测和遗传操纵这一过程的能力，使该领域以非常快的速度增长，并揭示了自噬在人类健康和疾病中的重要性。

虽然自噬最初是在哺乳动物中发现的，但我们对自噬是如何控制的理解的一个重大突破来自于对遗传易驯化酵母系统的分析。Ohsumi小组的开创性工作表明，酵母中自噬的形态与哺乳动物中的自噬相似¹⁷然后，他们对影响蛋白质周转的酵母突变体（非特异性宏观自噬）进行了第一次基因筛查¹⁸在这项工作之后，对影响过氧化物酶体降解（pexophagy）的突变体进行了类似的筛选¹⁹和传递常驻液泡水解酶（细胞质到液泡靶向（Cvt）途径²⁰，参考文献。21). 第一个自噬相关（Atg）基因的鉴定，自动液位计11997年出版（参考。22). 最近对影响选择性线粒体降解（线粒体吞噬）的突变体进行的基因筛查，导致了对自动液位计32和自动液位计33（参考文献²³和²⁴).

尽管Cvt途径、pexophagy、有丝分裂和巨自噬在形态和机制上相似，并且需要大多数Atg成分，但它们在重要方面有所不同。巨自噬通常被认为是非选择性的，而Cvt途径、pexophagy和有丝分裂是高度选择性的。Pexophagy、丝裂原phagy和非特异性大自噬是降解性的，而Cvt途径是生物合成的，向液泡输送至少两个驻留水解酶^25,26(图1a). 总的来说，它们共享Atg蛋白的一个子集，这些蛋白对自噬体的形成至关重要，并被称为“核心”分子机制（参考文献综述）。27). 核心机制包括四个主要功能基团：（1）Atg1–Atg13–Atg17激酶复合物，（2）III类磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）复合物I，由Vps34、Vps15、Atg6和Atg14组成，（3）两个泛素样蛋白结合系统（Atg12和Atg8）和（4）Atg9及其循环系统。此外，在酵母中，自噬机制集中在一个被称为吞噬物组装位点（PAS）的液泡周围（液泡是溶酶体的酵母等效物），而PAS处自噬机构的协同作用导致吞噬物扩张和自噬体形成^28,29第五组核心成分包括单膜泡内小泡（由自噬体或其他隔离小泡与空泡限制膜融合而成）及其货物分解时自噬最后步骤所需的蛋白质，并将这些降解产物释放回细胞溶质以供再次使用^30–32.

的标识自动液位计酵母中的基因导致了高等真核生物自噬的分子分析。水岛在Ohsumi的实验室中发现了第一个哺乳动物自噬基因，ATG5型和ATG12型，并证明了Atg12–Atg5共轭系统是保守的³³也许在高等真核生物中最关键的发现是Yoshimori及其同事鉴定了哺乳动物Atg8同源物MAP1LC3（也称为LC3），随后开发了基于LC3的检测方法，用于监测哺乳动物和其他高等真核生物的自噬³⁴然而，LC3合成或脂质化的增加不足以评估自噬，而且跟踪整个途径的流量也很重要，包括溶酶体中的流量³⁵除了这两个共轭系统外，还鉴定和研究了其他哺乳动物的Atg同源物(图1b，在参考文献中审查。36). 两种Atg1同源物ULK1和ULK2是诱导自噬所必需的，存在于一个大型复合物中，该复合物包括哺乳动物Atg13同源物（mAtg13）和支架蛋白FIP200（酵母Atg17的同源物）。人类III类PtdIns3K复合体的形成，包括人类Vps34（hVps34）、Beclin 1（Atg6的同源物）、Atg14L（Atg14的同源体）和p150（Vps15的同源物。水岛等人。使用绿色荧光蛋白标记的Atg5（参考。37)跟随自噬体的形成，表明它以一种渐进的方式进行，以隔离囊泡的扩张为标志(图1b).

最近的分子分析表明，多细胞真核生物自噬调控的复杂性越来越明显。例如，使用秀丽隐杆线虫，田等人。确定了四个多细胞动物特有的自噬基因，命名为epg-2型,epg-3/VMP1,epg-4/EI24和epg-5:epg-2型调解货物识别并特定于秀丽线虫而其他三个基因从蠕虫到哺乳动物都是保守的³⁸最后，两个大规模的人类细胞筛选已经鉴定出许多其他成分，这些成分可能与已知的自噬相关蛋白相互作用，或参与控制这一过程的信号转导途径^39,40.

自噬体膜的起源仍有相当大的争议。例如，最近的研究表明内质网膜^41–43线粒体外膜⁴⁴和质膜⁴⁵可能有助于自噬体的形成，这表明一系列细胞器可以提供所需的膜成分（有关详细信息，请参阅本期第831页）⁴⁶.

Atg蛋白的结构分析应揭示自噬机制；哺乳动物Atg8同源物的结构，包括γ-氨基丁酸受体相关蛋白（GABARAP）⁴⁷和LC3（参考。48)是第一个被报道的。最近，米勒等人。报告了的结构黑腹果蝇Vps34与PtdIns3K抑制剂的复合物中，这可能有助于设计针对该激酶的新药⁴⁹.

自噬的信号调节

我们对调节自噬的信号通路的理解取得了关键突破，这发生在雷帕霉素激酶（TOR）靶点的鉴定之后^50,51调节细胞生长、细胞周期进展和蛋白质合成。1995年，Meijer的研究小组表明，TOR抑制剂雷帕霉素可诱导大鼠肝细胞自噬，并减轻氨基酸对自噬的抑制作用⁵²他们还证明，氨基酸刺激核糖体蛋白S6磷酸化，这种作用被雷帕霉素抑制，提供了氨基酸依赖性和TOR依赖性调节之间的联系(图2). TOR信号通路至关重要，因为它能够整合来自营养、代谢和激素信号的信息。酵母系统的研究最初落后于哺乳动物领域，但1998年Ohsumi的实验室报告称雷帕霉素也能诱导酵母自噬⁵³.

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图2

哺乳动物自噬的信号调节。在图中，蓝色成分代表刺激自噬的因子，而红色成分对应抑制因子。自噬受各种刺激（蓝色箭头）和抑制（红色条）输入的复杂信号网络调节。TOR通过整合I类PtdIns3K信号和氨基酸依赖信号通路，在自噬中发挥中心作用。胰岛素受体的激活刺激I类PtdIns3K复合物和小GTPase Ras，从而激活PtdIns3K–PKB–TOR通路。PKB磷酸化并抑制结节性硬化复合物1/2（TSC1–TSC2），导致Rheb GTPase稳定，进而激活TOR，导致自噬抑制。氨基酸抑制Raf-1–MEK1/2–ERK1/2信号级联，从而抑制自噬。能量消耗导致AMP-activated protein kinase（AMPK）被磷酸化并被LKB1激活。AMPK磷酸化并激活TSC1–TSC2，导致TOR失活和自噬诱导。p70S6K激酶是TOR的底物，可能对TOR活性产生负反馈，确保了对内环境稳定至关重要的自噬基础水平。JNK1和DAPK磷酸化并破坏抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X的关联_L（左）与Beclin 1结合，导致Beclin 1-associated class III PtdIns3K复合物激活并刺激自噬。Beclin 1与吞噬细胞膜结合。

1997年，Meijer的小组发现，在大鼠肝细胞中，氨基酸诱导的S6磷酸化被PtdIns3K抑制剂沃特曼和LY294002阻止⁵⁴因此，与雷帕霉素类似，应诱导自噬。出乎意料的是，这些PtdIns3K抑制剂（和3-甲基腺嘌呤）在缺乏氨基酸的情况下阻断了自噬。这一明显矛盾的一个解释是存在两类磷脂酰肌醇和磷脂酰肌糖激酶。事实上，Codogno的小组与Meijer的实验室合作表明，III类PtdIns3K产品，即磷脂酰肌醇3-磷酸（PtdIns（3）P），对自噬至关重要，而I类PtdIns3K产品磷脂酰肌糖醇（3,4）-二磷酸（PddIns（3,4P）₂)和磷脂酰肌醇（3,4,5）-三磷酸_三)，具有抑制作用⁵⁵与这些结果一致，PTEN过度表达，水解PtdIns（3,4）P₂和PtdIns（3,4,5）P_三，刺激自噬⁵⁶PtdIns3K抑制剂抑制两类PtdIns3K酶，从而下调自噬和S6磷酸化。

胰岛素已经被证明可以抑制自噬，我们现在知道胰岛素信号转导的最初步骤发生在质膜上，导致I类PtdIns3K的激活和PtdIns（3,4,5）P的产生_三通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）促进蛋白激酶B（PKB；也称为AKT）的膜募集和活化；图2). 随后的研究表明，通过表达PKB的活性形式或PDK1的组成活性形式，激活该通路对自噬具有抑制作用^56,57此外，TOR是一个下游靶点：雷帕霉素逆转因激活I类PtdIns3K通路而导致的自噬抑制。

虽然TOR被认为是自噬调控的核心，但最近有报道称TOR依赖性途径(图2). 例如，Beclin 1可以被应激反应性c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）和死亡相关蛋白激酶（DAPK）激活^58,59.

健康与疾病

癌症

越来越多的证据表明，自噬的改变发生在各种人类疾病中。癌症是最早与自噬受损相关的基因疾病之一：莱文实验室的一项里程碑式发现发现，Beclin 1，一种对自噬至关重要的系统发育保守蛋白，也是一种单倍体肿瘤抑制因子⁶⁰Beclin 1最初是作为Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）相互作用蛋白分离出来的。Beclin 1与抗凋亡蛋白Bcl-2的结合降低了Beclin 1相关的hVps34 PtdIns3K活性，从而抑制自噬⁶¹.贝克林1染色体17q21位点的单等位基因缺失发生在40-75%的卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌中⁶²杂合性缺失小鼠贝克林1显示肿瘤自发性发展速度加快^63,64、和附件4C-缺陷小鼠表现出类似的倾向⁶⁵这些观察结果表明自噬对肿瘤抑制很重要。

怀特和他的同事提供了证据来解释为什么自噬（主要作为细胞生存途径）也在肿瘤抑制中起作用这一明显的悖论(图3). 首先，在凋亡缺陷细胞中，自噬可以防止坏死导致的死亡，这一过程可能会加剧局部炎症并促进肿瘤生长⁶⁶第二，应激性自噬缺陷肿瘤细胞积聚p62（也称为固碳体1）、受损线粒体、活性氧（ROS）和蛋白质聚集体，可能导致DNA损伤、癌基因激活和肿瘤发生^67,68然而，在缺氧和低营养条件下，在肿瘤微环境中的代谢应激期间，自噬也可能促进肿瘤细胞存活。因此，基因或药物抑制自噬被证明可以增强癌症化疗药物的细胞毒性，并促进肿瘤退化^69,70因此，自噬对癌细胞生存既有积极作用，也有消极作用；自噬最初可能起到预防癌症的作用，但一旦肿瘤形成，癌细胞就会利用自噬来保护自己的细胞。

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图3

凋亡和自噬在肿瘤发生中作用的模型。细胞对代谢应激的一种常见反应是细胞凋亡介导的细胞死亡，这限制了肿瘤的生长。肿瘤可能在某些代谢应激肿瘤区域触发自噬介导的细胞存活。在凋亡缺陷、代谢应激的肿瘤细胞中，自噬激活可防止坏死导致死亡，而自噬缺陷可导致p62、受损线粒体、活性氧和蛋白质聚集体的积聚，从而导致基因组损伤和肿瘤发生。有关更多信息，请参阅参考文献⁶⁸和¹¹⁹.

结论

这一历史调查中出现了三个关键点。首先，我们目前对自噬的认识，特别是在人体生理学方面，只是冰山一角。自噬可能主要起到细胞保护机制的作用，例如，在饥饿状态下维持营养和能量的稳态，或清除有缺陷的蛋白质，细胞器受损和侵袭性病原体导致各种疾病。然而，自噬的激活也可能有害：自噬可能会使癌细胞对化疗产生耐药性，或者过度自噬会导致不良细胞死亡。因此，确定自噬在特定疾病环境中的确切作用，以及确定刺激或抑制自噬是否更有益是未来的目标。其次，我们需要对控制自噬的调控途径有更深入的了解。特别是，细胞如何根据复杂的信号输入来确定自噬的特异性和大小？最后，关于Atg蛋白的分子作用、自噬体形成的膜来源、隔离囊泡形成的机制以及自噬的选择性，还有许多基本问题。我们对自噬的认识正在迅速增长。也许很快，我们就能操纵自噬来对抗疾病和促进健康。

致谢

脚注

参考文献