自噬是一个高度保守的分解代谢过程，其中胞质内蛋白质和细胞器被称为自噬体的双层膜囊泡吞噬，然后运输到溶酶体进行降解。自噬体是由吞噬细胞的伸长和融合形成的，吞噬细胞是由自噬前结构形成的。自噬体的膜起源尚不清楚，可能涉及多种来源，尽管有人提出了内质网和线粒体的作用1-4哺乳动物（和酵母）自噬体的生物发生涉及两种泛素样分子，Atg12和LC3/Atg85在第一个反应中，Atg12的C末端甘氨酸与Atg5的内部赖氨酸共价连接。然后，Atg12-Atg5共轭物与Atg16L1形成800kDa络合物6Atg16L1定位于自噬前结构的外表面，并与完全形成（成熟）的自噬体分离5因此，Atg16L1阳性小泡代表自噬前结构。在第二个泛素样反应中，LC3与磷脂酰乙醇胺（PE5因此，作为肌动蛋白/微管蛋白或LC3阳性小泡的功能，LC3-II水平反映了细胞中的自噬体数量。Atg12-Atg5复合物显示出LC3-PE偶联的E3连接酶样活性7此外，Atg16L1复合物的定位是LC3脂质沉积位置的重要决定因素8有趣的是，最近一项全基因组关联研究确定了一种Atg16L1（T300A）变异体，该变异体在克罗恩病患者中过度表达9.
结果
Atg16L1与氯氰菊酯重链相互作用
为了了解Atg16L1的作用，我们对用抗内源性Atg16L抗体免疫沉淀的细胞裂解物进行了质谱分析，确定了氯氰菊酯重链（包被囊泡的主要成分，在内吞途径中起重要作用）是一种新的相互作用物(). 我们通过共免疫沉淀实验验证了相互作用(). 我们发现内源性氯氰菊酯重链与内源性或过表达的Atg16L1相互作用，这种相互作用是通过Atg16L的N末端区域介导的(). 因为Atg5也与Atg16L1的N末端区域相互作用6()，我们测试了增加Atg5浓度的过度表达是否改变了氯氰菊酯-Atg16L1的相互作用。由于我们没有观察到增加Atg5表达对氯氰菊酯-Atg16L1相互作用的明显影响，因此Atg5和氯氰菊酯可能结合到Atg16L1上的不同位点，甚至结合到Atg 16L1分子的不同亚群(). 我们还注意到，氯氰菊酯重链与Atg16L1的T300A变异体相互作用，其效率与“野生型”Atg16L2相似，这并不奇怪，因为变异体位点距离N末端下游很远(补充信息，图S1A).
Atg16L1与氯氰菊酯重链相互作用答：。用Atg16L1抗体（Atg16L2）或无抗体（no Ab）免疫沉淀HeLa细胞裂解物，进行SDS-PAGE，并根据制造商的方案用SimplyBlue安全染色（Invitrogen）对蛋白质进行染色。切下盒子中显示的条带，用胰蛋白酶消化，并用MALDIToF鉴定。B。将转染对照载体或Flag-Atg16L1野生型或不同缺失突变体（2-77、2-275、232-607）的HeLa细胞转染24小时后，用抗Flag抗体（Atg16L1）免疫沉淀，并用抗甲氰菊酯、抗Flag-和抗Atg5抗体免疫印迹。氯菊酯与Atg16L1的N末端相互作用，类似于Atg12-Atg5。将总裂解物作为蛋白质输入的对照品一起运行。C、。HeLa细胞裂解物用Atg16L1抗体（+Ab）或无抗体（no-Ab）免疫沉淀（IP），用抗甲氰菊酯、抗AP2和抗Atg16L抗体免疫印迹。输入对照品的总细胞裂解物（TL）也被吸光。内源性Atg16L1与氯氰菊酯重链和AP2相互作用。D。转染Flag-Atg16L1和增加Atg5浓度24h的HeLa细胞用抗Flag抗体（Atg16L1）进行免疫沉淀（IP），并用抗氯氰菊酯、抗Flag和抗Atg5抗体进行免疫印迹。Atg5过度表达既不干扰也不增加氯菊酯-Atg16L1结合。TL–总细胞裂解物。
氯菊酯介导的内吞调节自噬体形成的早期阶段
在证明了网格蛋白重链与自噬体前体标记Atg16L1相互作用后，我们接下来测试了网格蛋白介导的内吞作用的早期步骤是否调节了自噬小体形成的初始阶段。（这个问题需要与完全形成的成熟（Atg16L1-阴性）自噬体与早期和晚期内体融合形成称为两性体的杂交细胞器的独特过程加以区分，这一步骤似乎对随后的自噬体液溶体融合很重要10-12). 我们首先测试了与早期内吞有关的一些关键成分的敲除对自噬体形成的影响。LC3-II稳态水平的变化可因形成和/或降解而改变。为了评估LC3-II（自噬体）形成的变化，可以在巴非霉素A1（BafA1）饱和浓度下评估LC3-III水平。由于BafA1抑制LC3-II降解和自噬体-溶酶体融合，因此在BafA1饱和水平下，LC3-II水平对特定siRNAs的反应差异反映了LC3-II（自噬小体）合成的变化13,14(补充信息，图S1B、S1C). 丝裂霉素重链（epsin 1，AP2，而非AP1）的siRNA敲除抑制了新自噬体的形成约30%，因为这些扰动降低了在巴非霉素A1（BafA1）存在下的LC3-II水平(;补充信息，图S1D、S1E、S1F). Epsin是clathrin的一种辅助蛋白，可诱导膜弯曲，而AP2和AP1分别是位于质膜和高尔基体上的clathrin-衔接蛋白。我们注意到，在没有BafA1的情况下，氯氰菊酯重链敲除对LC3-II水平的影响是不同的，这可能是因为氯氰菊酯敲除减少了LC3-II的形成，这将在没有BafA1的情况下降低LC3-II含量，但氯氰嘌呤敲除也会减少自噬体-溶酶体融合/LC3-II降解11（另见下文），这将在没有BafA1的情况下增加LC3-II水平，而净效应将取决于两个系统的相对动力学，这可能会根据击倒效率或使用的不同处理条件而不同14。我们的印象是，网格蛋白敲除对合成的影响随着更有效的敲除而更加明显，例如两轮敲除5天。众所周知，由于氯氰菊酯的半衰期较长，有效击倒氯氰菊酯需要这些策略15.
抑制网格蛋白介导的内吞减少自噬体的形成答：。转染两轮对照、epsin 1、clathrin重链、AP2或AP1 siRNA的HeLa细胞5 d后，要么不处理，要么用Bafilomycin A1（+/-BafA1）处理4 h，然后用抗LC3和抗ubulin抗体进行western blot分析。注意，在我们使用的蛋白质提取条件下，与HeLa细胞中的LC3-II相比，LC3-I通常非常微弱。但这不是问题，因为建议将LC3-II与微管蛋白/肌动蛋白联系起来13,14.B。LC3-II与对照组、epsin、clathrin重链、AP2或AP1敲除后的微管蛋白的比率，无论是否使用Bafilomycin A1，都是通过三个独立实验（两个实验用于epsin）进行量化的，并在图中表示。*-p<0.01，**-p<0.001，***-p<0.0001。C、。稳定表达GFP-mRFP-LC3的HeLa细胞17用两轮对照组或甲氰菊酯重链siRNA转染5 d，在此期间，未经处理（UT）或用Bafilomycin A1（BafA1）处理15 h。然后将细胞固定并在细胞组学阵列扫描系统上进行分析。图中显示了不同条件下每个细胞自噬空泡（AV）或自溶体（AL）的定量p<0.01，NS-不显著。n=2000个单元。D。将转染有对照、氯氰菊酯重链、AP1或AP2 siRNA的HeLa细胞在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中培养4d，6h后固定细胞，并进行内源性LC3免疫染色。如图所示，对具有50个以上LC3囊泡（用箭头标记）的HeLa细胞的百分比进行计数。***-p<0.0001。n=500个单元。图中的所有误差条代表SEM。
为了进一步支持网格蛋白在自噬小体形成中的作用，考虑到其额外的影响会损害自噬体的成熟，我们研究了网格蛋白重链敲除对稳定表达mRFP-GFP-LC3结构的HeLa细胞的影响16,17.由于pK不同一在这两种荧光蛋白中，这个结构可以用作自噬体成熟的探针。在生理pH值下，即在新形成的自噬体中，这两种蛋白质都是稳定的，导致红色和绿色荧光。酸化后，即与溶酶体融合，由于高pK，绿色荧光迅速消失一只有红色荧光残留16,17与我们的LC3-II印迹数据一致，在缺乏BafA1的情况下（由于自噬体向溶酶体传递的减少），克拉菊酯重链敲除导致自噬小泡（红色和绿色阳性小泡）数量增加，自溶小体（红色阳性/绿色阴性）数量减少，但在BafA1存在的情况下（由于自噬体形成受损）导致自噬小体数量减少（约30%）(). 正如我们所看到的，使用该试验，敲除AP2也减少了自噬体的形成，而敲除AP1没有影响(补充信息，图S1G).
在自噬诱导条件下（海藻糖处理18或饥饿(补充信息，图S2A、S2B、S2C))，其中这些敲除都将新的自噬体的形成减少了约30%(补充信息，图S2A、S2B、S2C). 与我们的LC3-western-blot数据一致，我们还观察到，在饥饿条件下，当氯氰菊酯重链或AP2被击倒时，含有>50个内源性LC3小泡的细胞比例下降(). 同样，我们还发现，在海藻糖处理的具有氯氰菊酯重链或epsin敲除的细胞中，或在AP2敲除的未处理细胞中，转染含有>50个LC3小泡的tomato-LC3的细胞比例下降(补充信息，图S3A、S3B、S3C).
网格蛋白重链、epsin或AP2敲低阻断自噬流量也与具有74个聚谷氨酰胺重复序列的模型聚集倾向蛋白亨廷顿蛋白外显子-1的聚集增加有关（Q74）19-21，这是一种强大的自噬底物18,22,23(补充信息，图S3D、S3E显示了epsin 1和AP2数据以及之前发布的网格蛋白数据11)–由于聚集是一种浓度依赖性现象，因此具有这些聚集物的细胞比例随着各种自噬抑制剂的使用而增加，随着自噬诱导剂的使用而减少18,22-24我们还发现，氯氰菊酯或AP2敲除增加了内源性p62的水平，这是另一种自噬底物(补充信息，图S3F、S3G). Clathrin敲除也显著增加了具有内源性p62聚集体的细胞比例(补充信息，图S3G). 然而，如果自噬小体形成受损和/或自噬体向溶酶体的递送减少，则自噬底物会积累，因此这些底物积累分析无法区分这些情况。
网格蛋白介导的内吞作用对Atg16L1阳性自噬体前体的影响
由于击倒了网格蛋白重链、epsin或AP2抑制了新自噬体的形成，我们接下来检查了它们对自噬前体形成的影响，如Atg16L1阳性结构所示6,8内源性Atg16L1在自噬诱导（例如饥饿、雷帕霉素或海藻糖处理）时显示点状染色模式，对应于前体结构形成的增加(,补充信息，图S4A、S4B和数据未显示）。此外，BafA1不增加内源性Atg16L1囊泡数量(补充信息，图S4C)这表明该读数不受干扰的影响，干扰会损害成熟自噬体的溶酶体降解。我们观察到，在饥饿条件下，击倒克拉荷叶素重链、epsin或AP2（但不是AP1）导致Atg16L1囊泡形成减少约30%，表明自噬前结构的形成受阻(,补充信息，图S4A、S4B). 击倒克拉通重链、epsin或AP2也降低了与过表达Atg16L1相关的Atg16L2结构的数量（数据未显示；请注意，我们发现低水平的Atg16 L1过表达（每6孔400-750ng）并不抑制自噬体的形成，正如已报道的高水平病毒过表达8). 我们发现，Atg16L1（232-607）的N端缺失突变，与能结合氯氰菊酯的野生型蛋白或C端缺失突变相比，不与氯氰菊酯相互作用，形成的小泡明显较少（2-275）().
网格蛋白介导的内吞作用对Atg16L1阳性自噬体前体的影响A、 B、C、D。转染对照、epsin 1、clathrin重链、AP2或AP1 siRNA的HeLa细胞72 h后，用Hanks平衡盐溶液处理6 h（诱导自噬），然后固定并免疫染色内源性Atg16L1。定量了含有Atg16L1囊泡的HeLa细胞的百分比p<0.0001。比例尺–10μm。（请注意，我们在所有实验中都使用了单一的siRNA，并且通过两个独立的网格蛋白重链序列证实了其效果）。n=600个电池。E。F。将转染Flag标记野生型Atg16L1或Atg16L2缺失突变体-2-275或232-607 Atg16L的HeLa细胞固定24小时，并用抗Flag抗体进行模拟，定量并在图中表示带有Flag-Atg16L1囊泡的细胞比例。顶部面板显示了具有不同突变结构的Atg16L1囊泡的代表性图像。NS–不显著，***-p<0.0001。n＝100个细胞。G、 H，I。用GFP-Atg16L1和tomato-LC3进一步转染转染对照组、epsin 1、clathrin重链、AP2或AP1 siRNA的HeLa细胞24小时，然后固定细胞。GFP-Atg16L1（绿色）与tomato-LC3小泡（红色）共定位（黄色，用箭头标记）的百分比如图所示进行量化。n=21个单元格。***-p<0.0001。比例尺–10μm。图中的所有误差条代表SEM。
在自噬体形成过程中，LC3-II被招募到Atg16L1阳性的自噬前体结构上，这些结构最终融合形成自噬小体，此时Atg16L2复合物被移除并再循环。接下来，我们用GFP-Atg16L1和tomato-LC3小泡进行了共定位实验，以评估自噬体形成从早期自噬前结构（Atg16L1-阳性/LC3-阴性）到成熟自噬小体（Atg16 L1-阳性/LC3阳性）的进展。我们发现，网格蛋白重链、epsin或AP2敲除降低了GFP-Atg16L1小泡与tomato-LC3小泡的共定位()这可能表明这些蛋白质在该途径的早期阶段调控自噬体的形成。
质膜参与自噬体前体
在我们分析自噬前体结构形成的过程中，我们经常发现Atg16L1小泡靠近质膜(). 这一观察得到了TIRF显微镜（TIRFM）的支持，该显微镜能够选择性地观察薄区域，如质膜（及其正下方的细胞质区域）。带有GFP-Atg16L1和mRFP-标记的GPi（糖磷脂酰肌醇）蛋白（发现于质膜的小微区）的TIRFM显示了许多Atg16L小泡()也与mRFP-GPi结构显著共存()表明GFP-Atg16L1小泡位于或非常靠近质膜。事实上，GFP-Atg16L1转染细胞的免疫金电子显微镜（immuno-gold electronic microscopy，immuno-EM）分析显示，Atg16L2标记在靠近质膜的网格蛋白包衣囊泡上(). 这些数据，再加上我们早先的观察，即在极早期内吞运输受到抑制后，自噬体的形成受到损害，表明质膜可能是自噬前结构的膜来源。
Atg16L1小泡靠近质膜答：。转染GFP-Atg16L1 24小时的HeLa细胞被固定，以显示Atg16L2小泡（绿色）。比例尺–10μm。B。瞬时转染GFP-Atg16L1和mRFP-GPi的HeLa细胞在饥饿培养基中培养20 h，再培养2 h。显示带有GFP-Atg 16L1（绿色）和mRFP-GPi（红色）的TIRF图像。箭头表示Atg16L1和GPi之间的共同定位。GFP-Atg16L1与mRFP-GPi共定位的百分比如图所示。n=2。比例尺–5μm。C、。用GFP-Atg16L1转染24小时的HeLa细胞，未经处理或用50μM dynasole（Sigma）处理4小时，并用抗GFP（15nm金颗粒）和抗网格蛋白（10nm金颗粒）抗体处理免疫金EM。在装箱区域可以看到协同放大。与Atg16L1/1000μM相关的氯氰菊酯涂层结构（CCS）的定量2如图所示。***-p<0.0001。比例尺–100 nm。图中的所有误差条代表SEM。
接下来，我们使用不同的实验来评估质膜作为自噬体启动的膜促发剂的作用。我们使用霍乱毒素B亚单位内化分析25通过活细胞或固定细胞显微镜和双标记免疫电镜观察，评估质膜是否与GFP-Atg16L1囊泡融合。该分析依赖于霍乱毒素与质膜外部的结合及其随后的内化，以追踪质膜是否有助于早期前体结构的形成。霍乱毒素在HeLa细胞内的内化通过抑制氯氰菊酯介导的内吞作用而显著减弱15,26在很早的时间点，在与霍乱毒素孵育后，我们立即观察到质膜上有清晰的标记，并且立即从质膜内化的小泡通常与靠近质膜的GFP-Atg16L1小泡融合(,补充信息，图S5A、S5B、电影S1). 我们观察到许多靠近细胞表面的GFP-Atg16L1小泡与霍乱毒素阳性小泡共存(,补充信息，图S5A、S5B). 我们注意到许多靠近质膜的小GFP-Atg16L1小泡是LC3-阴性的()，表明它们是非常早期的前体，后来当它们也是LC3阳性时获得了吞噬体的特征(). 3-甲基腺嘌呤阻断自噬体形成后，GFP-Atg16L1小泡数量减少(补充信息，图S5C). GFP-Atg16L1囊泡与其他早期自噬标记物（如Atg5和Atg12）共定位（但没有与ER（BiP）或Golgi（GM130）标记物共定位(补充信息，图S5D、S6A、S6B、S6C)也没有与早期内吞标记EEA1共定位(). 这表明GFP-Atg16L1阳性结构是非常早期的自噬体前体，与最近从质膜上萌发的内吞小泡有关。这些内吞小泡很可能不是早期的内胚体（EEA1阳性），但更类似于内胚体之前的内吞小囊前体27。当我们使用内源性Atg16L1进行霍乱毒素内化试验时，我们观察到类似的结果()，GFP-Atg16L1稳定细胞(补充信息，图S7A、S7B)，内源性()或过度表达(补充信息，图S7C)Atg5或内源性Atg12(). 我们发现含有2-275 Atg16L1（结合甲氰菊酯）的囊泡与霍乱毒素囊泡共定位，类似于野生型Atg16L2，而232-607 Atg16L1（不能结合甲氰胺）的情况并非如此（尽管霍乱毒素-EEA1共定位在所有三个Atg16L结构体中都相似）(,补充信息，图S7D). 免疫电镜还显示，内化的小泡靠近质膜，标记有霍乱毒素和GFP-Atg16L1(,补充信息，图S7E)支持免疫荧光数据。当我们使用另外两种质膜标记物，即缓慢内化染料CellMask Orange时，观察到与霍乱毒素内化试验类似的结果()或快速内化的FM4-64(补充信息，图S7F)这两种结果都表明，来自质膜的小泡通常与靠近质膜的GFP-Atg16L1小泡融合。
Atg16L1囊泡与霍乱毒素亚单位B标记囊泡共定位答：。转染GFP-Atg16L1（绿色）和CFP-LC3（蓝色）的HeLa细胞在4°C下与Alexa fluor-555结合的霍乱毒素亚基B（红色）孵育15分钟（允许毒素与质膜结合）。然后将细胞在37°C（允许霍乱毒素内化）下培养10分钟，并固定以进行共聚焦分析。Atg16L1和霍乱毒素阳性的水泡呈黄色（也可参见高倍图像）。请注意，与霍乱毒素共定位的小Atg16L1囊泡对LC3为阴性（用黄色箭头标记），与霍毒毒素和LC3共定位的Atg16L1囊泡（用蓝色箭头标记）显示在右侧放大的面板中。比例尺–10μm。B。将转染GFP-Atg16L1（绿色）的HeLa细胞与Alexa fluor-555结合的霍乱毒素亚基B（红色）孵育24小时，如A类固定后，对其进行内源性EEA1（蓝色）免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。Atg16L1和霍乱毒素B阳性的囊泡为黄色（白色箭头），EEA1和霍乱毒阳性的囊胞为紫色（蓝色箭头），并在高倍图像中显示。图表显示了共同本地化的百分比。n=20个电池。比例尺–10μm。C、。用HBSS处理HeLa细胞6小时后，将Alexa fluor-555标记的霍乱毒素亚基B（红色）培养为A类然后固定细胞，并对内源性Atg16L1（绿色）和内源性EEA1（蓝色）进行免疫染色。细胞分析如下B类图中显示了定量。比例尺–10μm。箭头显示Atg16L1-cholera毒素共同定位。三角图显示EEA1-cholera毒素共同定位。n=20个电池。D。用HBSS处理HeLa细胞6小时后，与Alexa fluor-555标记的霍乱毒素亚基B（红色）一起孵育，如A类然后固定细胞，并对内源性Atg5（绿色）或内源性Atg 12（绿色）进行免疫染色。Atg5（n=18个细胞）或Atg12囊泡（n=39个细胞）与霍乱毒素的共定标以黄色（箭头）显示并在图表中量化。比例尺–10μm。图中的所有误差条代表SEM。
Atg16L1野生型和缺失突变体的分析答：。在共聚焦分析之前，用Flag标记的野生型Atg16L1或Atg16L1缺失突变体2-275或232-607 Atg16L1以及GFP-Atg5和CFP-LC3转染24小时的HeLa细胞被固定并用抗Flag抗体鉴定。插图中的箭头标记了野生型或2-275 Atg16L1（红色）与GFP-Atg5（绿色）的协同缩放。比例尺–10μm。B。将转染GFP-Atg16L1的HeLa细胞与HRP-结合的霍乱毒素亚基B在4°C下孵育15分钟。然后将细胞在37°C下培养10分钟，然后用EM.PM质膜的抗HRP抗体（15 nm金颗粒）和抗GFP抗体（10 nm金粒子）对其进行双重免疫金标记。比例尺–100 nm。在装箱区域可以看到协同放大。n=49个字段。图中的所有误差条代表SEM。
质膜参与Atg16L1阳性自噬体前体答：。转染GFP-Atg16L1（绿色）24小时的HeLa细胞在37°C下用CellMask橙色质膜染色培养5分钟，然后立即成像（在37°C的培养室中）。图中显示了CellMask橙色囊泡（红色）与GFP-Atg16L1囊泡（绿色）融合后的时间序列。比例尺–5μm。顶部和底部面板中还显示了一幅放大倍率较高的图像，显示GFP-Atg16L1囊泡（绿色）与CellMask橙色阳性囊泡（红色）的共定位（黄色），并用箭头标记。B、 C、。随后将转染对照、氯氰菊酯重链、AP1或AP2 siRNA 72 h的HeLa细胞转染GFP-Atg16L1（绿色）和siRNA 24 h。然后将细胞与Alexa fluor-555结合的霍乱毒素亚基B（红色）在4℃孵育15分钟，然后在37°C下进一步培养10分钟，然后固定细胞进行共聚焦分析。图中显示了GFP-Atg16L1（绿色）与霍乱毒素（红色）在对照组或氯氰菊酯重链敲除中的共定位（黄色），这在图中进行了量化C.n=25个单元格。***-网格蛋白重链KD的p=0.0002，AP2 KD的p=0.0001。图中的所有误差条代表SEM。比例尺–5μm。
重要的是，网格蛋白重链或AP2敲除显著降低了Atg16L1阳性囊泡与霍乱毒素标记囊泡的共定位()，这与我们早期的数据一致，即击倒克拉蓟素重链或AP2抑制了自噬体的形成。（我们通过转铁蛋白内部化分析测试了系统中氯氰菊酯介导的内吞作用，发现我们使用的氯氰菊酯重链和AP2敲除条件显著损害了氯氰依赖性内吞作用(补充信息，图S8A)). 由于非网格蛋白介导的内吞途径也有助于霍乱毒素的摄取，因此，网格蛋白重链或AP2敲除的效果可能不会比我们观察到的效果更强，并且这些途径也可能调节自噬体的形成。此外，很难用这些蛋白质获得强大的功能性敲除15.
在这里，我们首次确定了质膜通过网格蛋白介导的来自质膜的小泡内化对自噬前结构形成的直接贡献。我们的数据表明，这是通过Atg16L1和网格蛋白重链的相互作用介导的。因为AP2也与Atg16L1交互()，我们对含有氯氰菊酯重链或AP2敲除的细胞进行免疫沉淀分析。我们观察到Atg16L1-clathrin与AP2敲除的相互作用减少（但Atg16L1-AP2与clathrin重链敲除的交互作用没有改变），这表明AP2可能介导Atg16L2-clathrine相互作用(). 这并不奇怪，因为AP2将网格蛋白连接到膜上，并调节其与其他关键内吞蛋白的相互作用。Atg16L1是如何特异性靶向氯氰菊酯包被囊泡的，尚待明确。由于AP2敲除并没有完全消除Atg16L1-clathrin相互作用，因此可能有其他衔接蛋白/辅助蛋白参与介导Atg16L 1-lathrin交互作用，但其鉴定超出了本文的范围。
内吞小泡断裂对吞噬细胞形成的影响答：。收集转染两轮对照、氯氰菊酯重链或AP2 siRNA的Hela细胞4d，用抗Atg16L1抗体（IP）进行免疫沉淀。使用抗Atg16L1和抗网格蛋白抗体对总裂解物（底部）和IP（顶部）进行Western blot。注意到Atg16L1氯氰菊酯与AP2敲低的相互作用减少。图中显示了Atg16L1-板球蛋白或Atg16L2-AP2的定量，以及两个独立实验中的对照、氯氰菊酯重链或AP2敲除。B。用Flag标记的野生型Atg16L1、GFP-PLC（PH）和空载体（Control）或显性负性dynamin-II突变体（K44A dynamin；DN-Dyn）转染HeLa细胞24小时后，用共聚焦显微镜进行固定和分析。注意Atg16L1与PLC（PH）在质膜上的共定位，这在图中进行了量化。*-p<0.01。比例尺–5μm。n=20个电池。C、。收集单独用HBSS处理的Hela细胞或用80μM dynasore处理的HBSS处理5h的Hela淋巴细胞，用抗Atg16L1抗体（IP）进行免疫沉淀。使用抗Atg16L1和抗网格蛋白抗体对总裂解物（TL）和IP进行Western blot分析。注意Atg16L1-Clathrin与dynasore治疗的强相互作用。图表显示了两个独立实验的定量结果。图中的所有误差条代表SEM。D。质膜对自噬体前体形成的贡献。霍乱毒素通过依赖于氯氰菊酯和不依赖氯氰菊酯的内吞作用被内化。氯菊酯击倒显著降低霍乱毒素摄入15,26.从质膜（EEA1-阴性）立即萌芽的氯菊酯包被囊泡（CCV）是早期内体（EE）的前体27（EEA1阳性）。以前的研究表明，将完全形成的自噬体输送到溶酶体需要将这种自噬小体与早期或晚期内体/多泡小体（LE/MVB）融合形成两性体，它们是Atg16L1-阴性、LC3-阳性和内体标记阳性11,12（红色箭头）。我们在此表明，抑制网格蛋白依赖性内化抑制早期Atg16L1阳性前体的形成，这些前体成熟后形成吞噬细胞和后期的自噬体（蓝色箭头）。这些Atg16L1-vesicles对其他早期自噬标记物（Atg5和Atg12）呈阳性，但对早期内吞标记物（EEA1）无阳性反应。AP2是质膜上的网格蛋白适配器，而AP1定位于TGN和内体。
内吞小泡断裂对吞噬细胞形成的影响
为了进一步说明内吞在吞噬细胞形成中的重要性，我们用显性负性（DN）dynamin-II（K44A dynamin-II）抑制内吞囊泡的断裂，并观察到Atg16L1囊泡的数量减少，类似于网格蛋白重链或AP2 KD(补充信息，图S8B). 霍乱毒素分析细胞的DN-dynamin处理-Atg16L1囊泡共定位导致与霍乱毒素形成管状形态，与之前的发现一致，并且在这些结构上可以看到Atg16L1(补充信息，图S8C). 根据显著增强的Atg16L1-PtdIns（4,5）P判断，DN-dynamin II也在靠近质膜内表面的位置重新分配Atg16L22共焦显微镜共定位(,补充信息，图S8D). 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PtdIns（4,5）P2)是一种公认的质膜脂质，经常用作质膜标志物28与GFP融合的磷脂酶Cδ的PH域（PLC（PH）-GFP）通常用于识别PtdIns（4,5）P2关于这点29与这些观察结果一致，细胞渗透性动力蛋白抑制剂dynashore导致Atg16L1-clathrin相互作用显著增加()这与Atg16L1在靠近EM水平的质膜的氯菊酯涂层结构中的显著积累有关(). 因此，Atg16L1很可能定位于断裂前靠近质膜的包被网格蛋白的内吞小泡，我们的数据符合小泡断裂对吞噬细胞成熟的要求。
材料和方法
动物细胞培养
HeLa细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM，Sigma）中生长，培养温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。稳定表达GFP-mRFP-LC3的HeLa细胞在含有10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/链霉素和500μg/ml G418（Sigma）的DMEM中培养17细胞接种于1–2×105使用LipofectAMINE（用于DNA）或Lipofeectamine 2000（用于siRNA以及DNA和siRNA的双重转染）试剂（Invitrogen），按照制造商的方案，在6孔板中每孔进行转染。预先设计的单个siRNA从Applied Biosystems公司订购（siRNA ID：氯菊酯重链-107565，s223262，epsin 1–s26714，AP2-A1–16708，AP1μ1-138606）。
免疫细胞化学
对用4%多聚甲醛或甲醇固定的HeLa细胞进行免疫细胞化学（内源性Atg16L1、内源性Atg5和内源性Atg 12染色）。主要抗体：抗HA（Covance）、抗EEA1（Abcam，Cell Signaling）、抗Atg12（Cell Si信令）、抗Attg5（Sigma）、抗Atg16L1（MBL International，CosmoBio）、抗gm130（BD biosciences）、抗grp78（BiP，Abcam）和抗Flag M2（Sigma-Aldrich）。使用Image J RG2B插件对共聚焦图像进行共聚焦分析。每个实验分析15-20个细胞。使用Thermo Scientific Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader和Spot Detector Bioapplication protocole version 3对稳定表达GFP-mRFP-LC3的HeLa细胞中的LC3小泡进行自动计数17.
质粒构建
无起始密码子的全长人类Atg16L1（NM_030803）先前被克隆到改良的pCMV-HA载体（BD Bioscience）中，即HA-tag已被使用ApaI和EcoRI的3xFlag-tag取代（Rioux等人，2007）。通过PCR克隆全长结构（2-77（5′-GAC AAG CGA ATT CTT TCG TCG-3′，5′-TAA TGC GGC CGC TCA CCA TGT TCC ATC-3′）、2-275（5′-GAC AAG CGA-ATT CTT-TCG TCG 3′，5'-TAA TGC-GGC CGC-TCA AAG GCC AGC-3′，232-607（5′-CGA ATT CTT CTA CCA GTC GAA-3′，5′-TAA TGC GGC CGC TCA GTA CTG T-3′），用EcoRI和NotI（均为NEB）消化，最后用Flag-tag亚克隆到框架中的原始矢量中。T300A突变体是以野生型构建物为模板，通过定点突变（Stratagene QuikChange定点突变试剂盒）和以下引物产生的：5′-GAC AAT GTG GAT GCT CAT CCT GGT TCT G-3′，5′-C AGA ACC AGG ATG ATC CAC ATT GTC-3′。
活细胞成像
对于活细胞成像，HeLa细胞以约1.5×10的密度接种在42mm玻璃盖玻片（德国PeCon公司）上5每个盖玻片的单元格。用GFP-Atg16L1转染细胞24小时，然后将盖玻片安装在POC室（PeCon GmbH）中，用冰镇HBSS冲洗一次，并用2.5μg/ml Alexa Fluor-555标记的霍乱毒素亚单位B（分子探针）在4°C下染色15分钟，或用5μg/ml FM4-64（分子探针，或在37°C下使用2.5μg/ml CellMask橙色（Invitrogen）10分钟，然后立即在37°C.下成像。在蔡司Axiovert 200M显微镜上使用LSM 510共焦附件，使用x63 1.4 NA平面Apochro油浸透镜进行成像。使用488 nm（GFP-Atg16L1）和543 nm（FM4-64，Alexa Fluor-555标记霍乱毒素，B亚单位，CellMask橙色）的激光线。使用带通（505-530nm）和长通（560nm）滤波器分离波长。将激光功率保持在最低水平，以尽量减少光漂白和光细胞毒性。
TIRF显微镜
HeLa细胞接种在35mm MatTek玻璃底培养皿（美国）上，每个盖玻片的密度约为1.5×105个细胞。用mRFP-GPi和GFP-Atg16L1转染细胞20小时，然后在Hank’s平衡盐溶液中再培养2小时。在AxioVision软件的控制下，使用αPlan FLuAR 100x/1.45 Oil在Zeiss TIRF（全内反射荧光）3系统上进行成像。488 nm和561 nm激光线分别用于GFP-Atg16L1和mRFP-GPi激发。
Western Blot分析
使用ECL检测试剂盒（GE Healthcare）的标准技术或使用奥德赛红外成像系统上的直接红外荧光检测进行Western blot分析。使用的主要抗体包括抗Epsin（Santa Cruz Biotechnology）、抗氯氰菊酯（BD Bioscience）、抗Atg16L1（MBL International Corporation）、抗肌动蛋白（Sigma Aldrich）、抗Tublin（Sigma-Aldrich和抗LC3（Novus Biologicals）。使用标准方案进行免疫沉淀实验。在收集细胞进行免疫沉淀之前，用80μM dynasore（Sigma）处理实验细胞5小时。
免疫金电子显微镜
将转染GFP-Atg16L1的HeLa细胞与2.5μg/ml HRP-霍乱毒素B亚单位（分子探针）在4°C下孵育15分钟，然后在37°C下培养10分钟。对于dynasore实验细胞，在固定前用50μM dynasoer（Sigma）处理4h。然后在室温下用2%多聚甲醛和0.2%戊二醛的混合物将细胞固定在PBS中2h。然后制备细胞进行超薄冷冻切片，并根据之前描述的方案标记免疫金31简单地说，将固定细胞在PBS/0.02M甘氨酸中清洗一次，然后将细胞刮到PBS中12%的明胶中，并嵌入相同的溶液中。将细胞胶切割成1mm的块，在4°C下渗透2.3 M蔗糖，安装在铝制针上，并在液氮中冷冻。在50%蔗糖和50%甲基纤维素的混合物中采集超薄冰冻切片，并与抗HRP或抗氯氰菊酯和抗GFP孵育，并与10nm和15nm蛋白a金（乌得勒支）孵育。
转铁蛋白摄取测定
收集细胞并将其重新悬浮在冰镇无血清CO中2-含有10 mg/ml BSA的独立培养基（SFM），在4°C下1200g离心2分钟，然后将其重新悬浮在含有Alexa-488转铁蛋白（分子探针）的300μl SFM/BSA中，并在冰上培养5分钟以进行预结合。然后将其在37°下培养5分钟，以进行内化。将细胞冷冻在冰上，旋转，并用700μl SFM/BSA清洗一次。然后将颗粒重新悬浮在300μl酸洗溶液（0.1M Gly，150mM NaCl，pH 3）中，在冰上培养4分钟，离心，然后再次重复。然后将颗粒重新悬浮在冷却的PBS/BSA中，并通过FACS进行分析。
统计
使用STATVIEW软件4.53版（Abacus Concepts，Berkeley，CA），通过T检验、重复测量或析因方差分析确定组间比较的显著性水平。
