Onco针对Ther。 2020; 13: 5479–5491.
TRIM37基因敲除通过ERK1/2通路失活促进胃癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长 , # 1 , # 1 , 1 , 1 , 1 , 1 和 1
朱宏毅 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
陈元文 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
张杰（音译） 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
钱长林 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
邱伟庆 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
霍建申 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
沈志勇 1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
1 上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科， 2011年12月，中华人民共和国
# 贡献均等。
通信：霍建深； 中华人民共和国上海市闵行区江岳路2000号上海交通大学医学院仁济医院南校区普通外科沈志勇，邮编：201112，电话：+8621-58752345，电子邮件 2643500550@qq.com ； 医生_szy7089@163.com
* 这些作者对这项工作贡献均等
2019年10月8日收到； 2020年5月20日验收。
摘要 目标 胃癌（GC）是一种胃黏膜恶性肿瘤，是全球癌症死亡的第二大原因。 尽管胃癌的发病率和死亡率在美国和其他地方有所降低，但它仍然是一个主要的公共卫生问题。 在本研究中，我们试图研究三部分基序包含蛋白37（TRIM37）在GC细胞系中的功能，以提出一种新的GC治疗方法。
方法 采用免疫组织化学、实时PCR和Western blotting分析检测TRIM37在胃癌患者和细胞株中的表达。 在TRIM37敲除或过度表达后，检测细胞周期、增殖和凋亡以及相关蛋白的表达。 此外，还对裸鼠进行了体内实验。
结果 我们发现，TRIM37在GC患者的肿瘤组织和GC细胞系中的表达显著升高，并且TRIM37高表达的患者预后较差。 敲除GC细胞中的TRIM37显著抑制细胞增殖和细胞周期进程，促进凋亡，增加裂解caspase 3，降低c-myc和蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）磷酸化。 TRIM37过度表达的效果与TRIM37敲除的效果相反，并且可以被ERK1/2抑制剂有效减弱。 此外，ERK1/2激动剂以剂量依赖性的方式增加TRIM37和p-ERK1/2，TRIM37敲除能有效减弱EGF诱导的细胞增殖和TRIM37及p-ERK1/2的表达。 有趣的是，我们发现TRIM37过表达不会影响双特异性磷酸酶6（DUSP6）的mRNA水平，但会降低其在GC细胞中的蛋白水平。 共免疫沉淀（Co-IP）分析表明，TRIM37与DUSP6相互作用，且TRIM37过度表达增强了GC细胞中DUSP6的泛素化。 裸鼠体内实验显示TRIM37基因敲除对肿瘤生长的抑制作用。
结论 这些发现表明，TRIM37可能在GC细胞的生长中起到癌基因的作用，并说明其作为GC治疗靶点的潜在功能。
关键词： TRIM37、胃癌、ERK1/2途径、裂解caspase 3、C-myc
介绍 胃癌是胃粘膜的恶性肿瘤，是全球第二大癌症死亡原因。 1 – 三 数据表明，与南方地区相比，中国西北和东部沿海地区GC的发病率要高得多。 4 GC不仅会对消化系统造成损害，而且转移会影响肝脏、肾脏和呼吸功能。 5 在严重的病例中，GC可能导致恶病质，并最终危及生命。 目前，纤维内镜，辅以X线钡餐检查、腹部B超、肿瘤标志物、常规血液检查和胃液分析是诊断胃癌最有效的方法。 近年来，诊断技术的进步提高了胃癌的早期发现率，从而降低了死亡率，但复发性疾病经常发生在晚期患者身上，尽管经过积极治疗，但其生存率极低。 6
三部分基序包含蛋白37（TRIM37），也称为MUL，包含环指结构域，被鉴定为E3泛素连接酶。 7 TRIM37位于17q23染色体上，据报道在多达40%的乳腺癌中扩增。 8 作为一种致癌H2A泛素连接酶，TRIM37在乳腺癌中过度表达，可以通过沉默肿瘤抑制因子和其他基因来促进转化。 9 此外，研究表明，TRIM37和多种癌症的生长、迁移和转移有关，如胰腺癌、胶质瘤、肝细胞癌和结直肠癌。 10 – 14 此外，敲除TRIM37可以通过激活PI3K/AKT通路抑制人脑胶质瘤细胞的增殖和转移，而在肝癌中，TRIM37的过度表达可以通过激活Wnt/β-catenin通路促进细胞迁移和转移。 11 , 12 在本研究中，我们试图探索TRIM37在人类GC细胞中的功能和潜在机制，为GC治疗提供新的治疗靶点。
双特异性磷酸酶6（DUSP6）是一种细胞溶质磷酸酶，是细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的负反馈调节因子。 15 研究表明，DUSP6在肺癌中起到抑癌作用。 16 , 17 DUSP6通过抑制神经干细胞中ERK1/2的激活，对aβ诱导的细胞毒性具有神经保护作用，而DUSP6的下调有助于食管鳞癌（ESCC）的进展和分化。 18 , 19 此外，据报道，TRIM7通过DUSP6/p38途径促进肝细胞癌细胞增殖，TRIM11下调抑制了D-54多形性胶质母细胞瘤（GBM）细胞中的DUSP6蛋白。 20 , 21 然而，TRIM37和DUSP6在GC细胞中的相互作用尚未阐明。
在GC肿瘤组织和细胞系中观察到TRIM37表达升高，患者中TRIM37的表达升高与预后不良相关。 敲除GC细胞中的TRIM37显著抑制细胞增殖和周期进展，促进凋亡，增加裂解caspase 3，降低c-myc和磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）。 TRIM37过度表达的影响与TRIM37敲除相反，并被ERK1/2抑制剂U0126有效减弱。 此外，ERK1/2激活剂EGF以剂量依赖的方式增加了TRIM37和p-ERK1/2的水平，而TRIM37敲除能有效减弱EGF诱导的细胞增殖和TRIM37及p-ERK1/2的表达。 共免疫沉淀（Co-IP）分析表明，TRIM37与DUSP6相互作用，并且TRIM37过度表达增强了GC细胞中DUSP6的泛素化。 体内实验表明TRIM37基因敲除对肿瘤生长具有抑制作用。 这些发现表明，TRIM37可能作为GC中的癌基因，调节c-myc、裂解的caspase 3和ERK1/2通路。
患者和方法 患者和组织 本研究纳入了95名40至60岁的GC患者，他们在上海交通大学（中国上海）医学院仁济医院接受治疗。 在获得知情同意后，收集30名GC患者的30对癌和癌旁组织，检测TRIM37的表达。 80个月后，中位随访时间，对65例GC患者的样本进行Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验。 本研究按照赫尔辛基宣言的规定进行，并经上海交通大学医学院仁济医院伦理委员会批准。
细胞培养 5株人类GC细胞株AGS、HGC27、MKN28、MKN45、SNU719和1株胃粘膜细胞株GES-1购自中国科学院细胞库（中国上海）。 上述细胞用含有10%胎牛血清（FBS；16000-044，GIBCO）和1%青霉素和链霉素（P1400-100，Solarbio）的RPMI-1640培养基（SH30809.01B，HyClone）在37°C和5%CO中培养 2 孵化器。
慢病毒的构建 针对TRIM37的三个不同位点（如 )合成干扰序列（T1300-100，Solarbio），通过双链退火构建shRNA。 随后，将每个shRNAs插入pLKO.1-puro载体的AgeI/EcoRI位点，构建pLKO.1-puro-shTRIM37-1、−2和−3。 对于TRIM37过表达质粒，TRIM37全长2895 bp编码DNA序列（CDS）区域( {“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC036012.1”，“term_id”：“23271191” BC036012.1号 )由Genewiz公司（中国上海）合成。 然后，在EcoR I/BamH I位点将TRIM37 CDS插入pLVX puro载体中。 序列确认后，（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Inc.，USA）、pLKO.1-puro-shTRIM37（1000 ng）或pLVX-puro-TRIM37（1000 ng TM（TM） 变成293T细胞。 转染48小时后，通过超速离心获得上清液中的病毒颗粒。
表1 姓名 序列 TRIM37目标站点1（1799–1817） GGAGATTCAGAAATGAA公司 TRIM37目标站点2（2119–2137） CCAGTAGTTACGACAT公司 TRIM37目标站点3（2730–2748） GCCTTGATACATGGCAGTA公司
细胞增殖试验 GC细胞（HGC27、MKN45和AGS）生长至对数期，胰蛋白酶化（T1300-100，Solarbio），显微镜下计数，制备3×10的细胞悬液 4 细胞/mL。然后，取100µL细胞悬浮液在96周的平板中播种并培养过夜。 在0、24、48和72小时处理后，将Cell Count Kit-8（CCK-8；CP002，SAB）和无血清培养基以1:10的体积比混合，然后向每组中添加100µL，并在37°C下培养1小时。 在微孔板阅读器上评估450 nm处的吸光度值（OD）。
细胞周期检测 GC细胞（HGC27、MKN45和AGS）生长至对数期，胰蛋白酶化（T1300-100，Solarbio），然后接种于3×10 5 细胞/孔放入6孔板中进行过夜培养。 治疗48小时后，收集细胞进行细胞周期检测。 简而言之，将细胞胰酶化并在1000 g下离心5 min。然后用预冷却PBS清洗细胞，然后在300µL含FBS的PBS（16000–044，GIBCO）中重新悬浮，然后在700µL预冷却4°C无水乙醇中固定24 h。 用1 mg/mL RNase a溶液（100µL；R8020-25，Solarbio）在37°C黑暗中去除RNA 30分钟后，将细胞在400µL碘化丙锭（PI，50µg/mL；C001-200，7Seabiotech，Shanghai，China）黑暗中染色10分钟。24小时内，用流式细胞仪（Accuri C6，BD Biosciences）检测每个细胞周期的DNA 在激发波长的488nm的波长处。 然后使用FLOWJO软件进行细胞周期分析。
细胞凋亡检测 GC细胞（HGC27、MKN45和AGS）生长至对数期，胰蛋白酶化（T1300-100，Solarbio），在3×10的6孔板中培养过夜 5 细胞/孔。 治疗48小时后，将细胞胰酶化，收集在离心管中进行凋亡检测（Annexin V-FITC apoptosis detection Kit，C1063，Beyotime）。 约1×10 5 再悬浮细胞用195μL Annexin V-FITC结合液培养，然后用5µL Annessin V-FITC4在黑暗中4°C培养15分钟。然后，在黑暗中的4°C，细胞在5µLPI染色液中培养5分钟。 使用不含Annexin V-FITC和PI的试管作为阴性对照。 随后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡（FCM；Accuri C6，BD Biosciences）。
实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 在处理或不处理后，收集GC组织或细胞，用Trizol试剂（1596–026，Invitrogen）分离总RNA。 在对RNA完整性和纯度进行量化和确认后，使用逆转录试剂盒（#K1622，Fermentas，USA）将约1µg RNA逆转录成互补DNA（cDNA）。 使用SYBRGreen PCR试剂盒，以cDNA为模板，在实时检测器（ABI-7300，Applied Biosystems，USA）的7300 SDS软件上进行RT-PCR反应，程序如下：95°C，10min； （95°C，15秒；60°C，45秒）×40。 然后，使用2 -ΔΔCq 方法。 22 引物如下所示：TRIM37，正向：5-TGGACTTACTCGCAAATG-3，反向：5-ATCTGGTGGTGACAAATC-3； GAPDH，正向：5ʹ-AATCCATCACCATCTTC-3 \697]，反向：5ɕ-AGGCTGTTGTCATACTTC-3 \697'。
Western印迹分析 处理或不处理后，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液（P0013B，Beyotime）中裂解GC细胞，然后在12000 g下离心15 min，收集上清液中的蛋白质。 在使用15%PAGE-SDS凝胶电泳分离之前，使用BCA试剂盒（PICPI23223，Thermo Fisher Scientific，Inc.，USA）对蛋白质进行定量，然后使用半干转移将其转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。 然后在脱脂奶（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）中在室温下将膜封闭1小时，然后在4°C下与TRIM37（1:1000；Ab95997，Abcam）、C-myc（1:1000，Ab32072，Abcan）、裂解半胱天冬酶3（1:500；Ab2302，Abcam）、ERK1/2（1:1000、#9102，细胞信号技术[CST]）、， p-ERK1/2（1:1000，#9101，CST）和GAPDH（1:2000，#5174，CST。 此后，用TBST清洗膜3次，并在37°C下用HRP-结合的山羊抗兔次级培养液培养1小时（1:1000；A0208，中国海门Beyotime）。 清洗后，使用化学发光试剂（WBKLS0100，EMD Millipore）来显影膜。 然后将膜暴露在ECL成像系统上（Tanon-5200，Tanon，中国上海）。 将TRIM37、c-myc、裂解caspase 3、ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白质水平归一化为GAPDH，然后使用版本1.47的ImageJ进行分析（美国马里兰州贝塞斯达）。
苏木精-伊红（HE）染色 收集裸鼠约0.3 cm的肿瘤组织，固定，包埋，并用石蜡切片机切割成4µm的切片。 然后，对切片进行苏木精-伊红染色（BASO）。 简而言之，将载玻片在65°C的烘箱中烘烤30分钟，然后在二甲苯I和II（10023418，国药）中轮流脱蜡15分钟。 在100%、95%、85%和75%乙醇（10092680，国药）中依次进行复水5分钟，然后用自来水冲洗10分钟。然后用苏木精（714094，BASO）对切片染色5分钟，再在氨基水中（10002118，国药公司）分色2秒，用自来水冲洗15分钟。 然后将切片依次在70%和90%乙醇中脱水10分钟，然后用曙红（BA4099，BASO）染色2分钟，然后再用无水乙醇脱水。 将3个切片在二甲苯中玻璃化3 min，两次，用中性胶（G8590，Solarbio）密封，并放置在65°C的烘箱中15 min。随后，使用显微图像分析系统（DS-Ri2，NIKON）对切片进行成像，并收集和分析样品的相关部分。
TUNEL荧光 收集裸鼠约0.3 cm的肿瘤组织，固定，包埋，并用石蜡切片机切割成4µm的切片。 随后，按照制造商的说明，使用TUNEL凋亡检测试剂盒（FY600017-20T，福源生物）检测肿瘤组织的细胞凋亡。 最后，在荧光显微镜上对载玻片进行成像。
免疫组织化学（IHC）检测 收集约0.3 cm GC患者的癌组织和癌旁组织，固定、包埋并用石蜡切片机切割成4µm的切片。 切片在65°C的烘箱中烘烤30分钟后，依次在二甲苯I和二甲苯II（上海国药）中脱蜡15分钟，然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇的梯度浓度下复水5分钟，然后用自来水冲洗10分钟。 之后，在0.01 M柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中进行抗原回收15分钟，然后将切片封闭在含0.3%H的湿箱中 2 O（运行） 2 在室温下用Rb-TRIM37抗体孵育1小时后，用HRP-结合二级抗体孵养切片。 然后对切片进行DAB染色，用1%盐酸对苏木精和乙醇进行3分钟染色。 用自来水冲洗10分钟后，将切片在二甲苯中透明化3分钟×2次，用中性胶（G8590，Solarbio）密封，并放置在65°C的烘箱中15分钟。随后，使用显微图像分析系统（DS-Ri2，NIKON）拍摄照片，并收集和分析样品的相关部分。 根据阳性区域，将标本分为两组：TRIM37低表达组：<25%的肿瘤细胞显示TRIM37阳性； TRIM37高表达：>25%的肿瘤细胞显示TRIM37阳性。 有关IHC结果的评估标准，请参阅Chen等人的报告。 23
联合免疫沉淀（Co-IP） 简言之，在感染载体或oeTRIM37慢病毒后分离出全细胞提取物。 然后，将所有样本与适当的抗体和蛋白质A/G珠（美国圣克鲁斯生物技术公司）一起培养过夜。 珠子清洗五次，并用SDS-PAGE分离。 如上所示进行蛋白质印迹。
泛素化测定 将感染载体或oeTRIM37慢病毒的AGS细胞置于冰上1%含SDS的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中进行超声裂解。 接下来，用蛋白A/G PLUS琼脂（sc-2003，Santa Cruz Biotechnology，USA）处理裂解物1小时。然后，将样品与IgG（sc-2027，Santa Cruz Biotechnology，USA）在4°C下孵育过夜。 在4°C下以3000 rpm离心5分钟后，收集核颗粒并用蛋白A/G Plus-琼脂糖珠洗涤四次。 纯化的蛋白质在4–20%梯度SDS-PAGE上运行。 使用抗-DUSP6抗体（ab76310，Abcam，UK）和抗泛素抗体（ab7780，Abcam，UK”）进行免疫印迹。
体内实验 BALB/c裸鼠分为两组：HGC27-shTRIM37和HGC27-shNC（正常对照）。 0.1 mL PBS悬浮于1×10 6 裸鼠（BALB/c，雄性，4周龄）皮下注射细胞。 每三天测量一次肿瘤体积。 4周后对小鼠实施安乐死。 HE染色和TUNEL荧光检测肿瘤生长和凋亡。 所有动物实验方案均按照《实验动物护理和使用指南》（中国科学技术部）执行，并由上海交通大学医学院仁济医院动物伦理护理和使用委员会授权。
统计分析 本研究中的统计分析是在GraphPad棱镜7.0软件（美国GraphPadSoftware）上进行的。 通过三次重复实验，所有图表结果均显示为平均值±标准偏差。配对学生 t吨 -试验用于确定两组之间的显著性，而多组通过Tukey事后检验的单因素方差分析（ANOVA）确定。 值为 第页 <0.05被认为具有统计学意义。
结果 TRIM37在胃癌患者肿瘤组织和胃癌细胞系中高表达 对TCGA数据库中正常和肿瘤样本的分析表明，TRIM37在GC肿瘤中的表达远高于正常组织( ). 在我们的研究中，收集了30例胃癌患者的配对癌和癌旁组织来分析TRIM37的表达。 如所示 与癌旁组织相比，胃癌患者癌组织中TRIM37的mRNA表达显著增加。 65例GC患者的IHC染色也显示TRIM37在癌组织中高蛋白表达。 在GC组织中，TRIM37的染色强度显著高于相应的邻近组织，并且在细胞质和细胞核中都有TRIM37的表达。 80个月后，65例患者中有37例死于GC。 Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验表明，TRIM37的表达与总生存率显著相关，且TRIM37高表达的患者预后较差( ). TRIM37表达与胃癌临床病理特征的关系 与上述观察一致，我们发现TRIM37在GC细胞系（AGS、HGC27、MKN28、MKN45和SNU719）中的表达显著高于胃粘膜细胞系GES-1( 和E）。 此外，与其他细胞系相比，TRIM37在HGC27和MKN45中相对较高，而在AGS中相对较低。 这些发现表明TRIM37可能在GC中起癌基因的作用。
表2 临床病理特征 修剪37 P（P） 价值 低（n=32） 高（n=33） 性别 0.1648 男性（n=42） 18 24 女性（n=23） 14 9 年龄（岁） 0.1698 ≤ 60（n=40） 17 23 > 60（n=25） 15 10 位置 0.7824 卡迪亚（n=32） 15 17 语料库（n=21） 10 11 Antrum（n=12） 7 5 肿瘤大小（cm） 0.1072 ≤ 3（n=29） 17 11 > 3（n=36） 15 22 肿瘤分化 0.9379 井（n=17） 9 8 中等（n=21） 10 11 差（n=27） 13 14 淋巴结转移 0.0178 否（n=29） 18 9 是（n=36） 14 24 TNM阶段 0.0194 I（n=20） 15 5 II（n=14） 6 8 III（n=31） 11 20
TRIM37在GC患者肿瘤组织和GC细胞系中高表达。
笔记： ( A类 )TCGA数据库中正常和肿瘤样本中TRIM37表达的分析。 从GC患者中收集30对癌和癌旁组织。 ( B类 )采用RT-PCR检测TRIM37在癌组织和癌旁组织中的mRNA表达。 ( C类 )通过IHC检测TRIM37的表达，并对65例GC患者进行Kaplan-Meier生存分析和对数秩检验（TRIM37低表达：32；TRIM37高表达：33）。 通过IHC检测TRIM37在癌组织和癌旁组织中的表达。 ( D、 E类 )用RT-PCR检测TRIM37在GC细胞AGS、HGC27、MKN28、MKN45、SNU719和胃粘膜细胞GES-1中的mRNA和蛋白表达** 第页 < 0.01, *** 第页 <0.001与正常、副癌、癌旁低TRIM37或GES-1相比。
慢病毒感染GC细胞后TRIM37的敲除和过表达 在体外，两个GC细胞系HGC27和MKN45感染了shTRIM37慢病毒（shTRIM37-1、−2和−3），而AGS细胞感染了oeTRIM37慢病毒。 通过RT-PCR和Western blotting分析，结果表明，三种shTRIM37慢病毒均显著下调HGC27中TRIM37 mRNA的表达( 和D）以及MKN45( 而oeTRIM37慢病毒显著上调AGS细胞中TRIM37的表达( 和F）。 此外，与shTRIM37-3相比，shTRIM27-1和−2慢病毒的作用更为深远。 因此，由于敲除或过度表达的有效性，shTRIM37-1、−2和oeTRIM37慢病毒被用于后续实验。
通过慢病毒感染在GC细胞中敲除和过度表达TRIM37。
笔记： 在体外，GC细胞（HGC27、MKN45和AGS）感染shTRIM37或oeTRIM37慢病毒。 ( A类 – C类 )通过RT-PCR测定shTRIM37或oeTRIM37在GC细胞中的敲除或过表达效率。 ( D类 – F类 )Western blotting检测shTRIM37或oeTRIM37在GC细胞中的敲除或过表达效率*** 第页 <0.001 vs shNC或Vector。
敲除GC细胞中TRIM37抑制细胞增殖、细胞周期进展和促进细胞凋亡 为了了解TRIM37在GC细胞中的作用，在TRIM37基因敲除后评估其增殖、细胞周期和凋亡。 中的结果 结果表明，TRIM37的敲除通过阻止细胞进入G1期，从而显著阻止细胞周期进展，从而减少细胞进入S/G2期。 此外，在TRIM37沉默的HGC27和MKN45细胞中，细胞增殖显著降低( )而凋亡增加( )同时，裂解caspase 3增加，c-myc减少，ERK1/2磷酸化降低，而ERK1/2保持不变( ). 这些结果表明，TRIM37的敲除可能通过阻断细胞周期进程和促进凋亡来抑制GC癌细胞的增殖。
敲除GC细胞中的TRIM37可抑制细胞增殖、细胞周期进展并促进凋亡。
笔记： GC细胞HGC27和MKN45感染shTRIM37-1和shTRIM27-2慢病毒。 ( A类 )感染后48小时用流式细胞仪检测细胞周期比例。 ( B类 )用CCK-8法计算感染后0、24、48和72小时的细胞增殖。 ( C类 )感染后48小时用流式细胞仪检测细胞凋亡。 ( D类 )Western blotting分析相关蛋白TRIM37、c-myc、裂解caspase 3、p-ERK1/2和ERK1/2的表达水平* 第页 < 0.05, ** 第页 < 0.01, *** 第页 <0.001 vs shNC。
TRIM37对GC细胞增殖、细胞周期进程和凋亡的调控可能由ERK1/2信号通路介导 我们还研究了TRIM37调节GC细胞的潜在机制。 如所示 ，TRIM37在AGS细胞中的过表达显著促进了细胞周期从G1期向S期的进展。 同时，TRIM37的过度表达显著增加了AGS中的细胞增殖( )而凋亡减少( ). 伴随着裂解caspase 3减少，c-myc增加，ERK1/2磷酸化，而ERK1/2保持不变( ). 此外，ERK1/2抑制剂U0126可以有效减弱TRIM37过度表达的诱导。 综上所述，我们推测TRIM37的过度表达可能通过激活ERK1/2信号通路促进GC进展。
TRIM37对GC细胞增殖、细胞周期进展和凋亡的调节可能由ERK1/2信号通路介导。
笔记： 用oeTRIM37慢病毒和ERK1/2抑制剂U0126处理AGS细胞。 ( A类 )感染后48小时用流式细胞仪计算细胞周期比例。 ( B类 )在感染后0、24、48和72小时通过CCK-8分析评估细胞增殖。 ( C类 )感染后48小时用流式细胞仪检测细胞凋亡。 ( D类 )Western blotting分析相关蛋白TRIM37、c-myc、裂解caspase 3、p-ERK1/2和ERK1/2的表达水平* 第页 < 0.05, ** 第页 < 0.01, *** 第页 <0.001 vs车辆+矢量； # p<0.05， ## p<0.01， ### p<0.001 vs车辆+oeTRIM37。
TRIM37对EGF诱导的GC细胞增殖的抑制作用 用一系列浓度的EGF重组蛋白（ERK1/2激动剂）治疗AGS细胞。 如所示 和B，EGF重组蛋白以剂量依赖的方式显著增加TRIM37表达和ERK1/2磷酸化。 此外，通过TRIM37敲除，EGF诱导的（10 ng/mL）GC细胞增殖被有效减弱( ). 同样，EGF诱导的TRIM37表达和ERK1/2磷酸化被TRIM37敲除后显著降低，而ERK1/2表达不变( ). 这些数据进一步证明ERK1/2信号通路参与了TRIM37对GC细胞的调节。
TRIM37的敲除能有效减弱EGF诱导的GC细胞增殖。
笔记： 用一系列浓度的EGF重组蛋白（ERK1/2激动剂；0、5、10和20 ng/mL EGF）处理AGS细胞。 ( A类 )RT-PCR检测TRIM37 mRNA的表达。 ( B类 )通过Western blotting分析TRIM37、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平。 用10 ng/mL EGF和shTRIM37慢病毒处理AGS细胞。 ( C类 )在治疗后0、24、48和72小时通过CCK-8测定法评估细胞增殖。 ( D类 )通过Western blotting分析TRIM37、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白水平** 第页 < 0.01, *** 第页 <0.001 vs 0 ng/mL EGF或Vehicle； # 第页 < 0.05, ## 第页 < 0.01, ### 第页 <0.001 vs 5 ng/mL EGF或EGF+shNC。
TRIM37与DUSP6相互作用并增强其在GC细胞中的泛素化 接下来，我们检测了感染oeTRIM37的GC细胞中DUSP6的mRNA和蛋白水平。 有趣的是，相对DUSP6 mRNA没有显著变化( )然而，DUSP6蛋白在oeTRIM37感染的GC细胞中显著下调( ). 这表明TRIM37的过度表达并不影响DUSP6的转录，而是抑制了其在GC细胞中的翻译。 此外，Co-IP分析显示，TRIM37和DUSP6在GC细胞中相互作用( ). TRIM37过表达显著增强了GC细胞中DUSP6的泛素化，表明TRIM37可能通过增强其在GC细胞中的泛素化来抑制DUSP6的翻译( ).
TRIM37与DUSP6相互作用，增强其泛素化。
笔记： AGS细胞被载体或oeTRIM37慢病毒感染。 ( A、 B类 )检测DUSP6的相对mRNA和蛋白水平。 ( C类 )分析了TRIM37和DUSP6在GC细胞中的相互作用。 ( D类 )检测了泛素介导的DUSP6的降解** 第页 <0.01 vs矢量。
TRIM37在裸鼠体内的敲除显著抑制肿瘤生长 裸鼠也进行了体内实验。 我们发现TRIM37的敲除显著抑制肿瘤重量( )和体积( )裸鼠。 高等教育( )和TUNEL( )肿瘤组织染色显示细胞凋亡明显增加。 此外，Western blotting显示，在TRIM37沉默的肿瘤组织中，裂解caspase 3的蛋白水平显著升高，c-myc和磷酸化ERK1/2降低，而ERK1/2不变( ). 这些结果表明，TRIM37在裸鼠体内的敲低显著抑制肿瘤生长，这进一步表明TRIM37敲低和ERK 1/2信号通路在GC进展中的抑制作用。
在裸鼠体内敲除TRIM37显著抑制肿瘤生长。
笔记： shTRIM37慢病毒和空白对照HGC27细胞用于裸鼠皮下肿瘤。 ( A类 和 B类 )测量皮下肿瘤的重量和体积。 ( C类 和 D类 )收集裸鼠肿瘤进行HE和TUNEL染色。 ( E类 )通过Western blotting分析TRIM37、c-myc、裂解caspase 3、p-ERK1/2和ERK1/2的蛋白水平* 第页 < 0.05, *** 第页 <0.001 vs矢量。
讨论 尽管胃癌的发病率和死亡率在美国和其他地方有所下降，但它仍然是一个主要的公共卫生问题。 近年来，越来越多的研究表明TRIM蛋白参与多种人类癌症，包括胃癌。 例如，TRIM29、TRIM44和TRIM26的表达与癌症患者的不良预后和总生存率相关。 24 – 26 研究发现，TRIM59和TRIM31在GC中上调， 27 , 28 TRIM29是GC中的癌基因，是淋巴结转移的新标志物。 29 , 30 此外，下调TRIM25可以抑制GC细胞的迁移和侵袭。 31 在本研究中，我们发现TRIM37在GC患者的肿瘤组织和GC细胞系中的表达显著增加，并且TRIM37高表达的患者预后较差。 敲除TRIM37显著抑制细胞增殖，阻止G1期细胞周期进展并促进凋亡，而TRIM37过度表达则有相反的作用。 我们的结果与之前的报告一致，即TRIM37基因敲除可以抑制乳腺癌细胞增殖和肿瘤生长。 9 这些发现提示TRIM37可能在GC中起癌基因的作用，TRIM37的敲除可能被考虑用于GC治疗。
此外，我们还探讨了TRIM37在调节GC细胞增殖、细胞周期和凋亡方面的潜在机制。 我们发现在TRIM37沉默的GC细胞中，裂解的caspase 3表达增加，而c-myc表达降低。 C-myc是一种调节细胞增殖、促进细胞分裂和参与细胞凋亡的原癌基因，与多种肿瘤的发生发展有关。 32 , 33 半胱天冬酶3是一种调节细胞凋亡或程序性细胞死亡的半胱氨酸蛋白酶。 34 因此，我们推测TRIM37对细胞增殖、细胞周期进展和凋亡的调节可能通过调控裂解的caspase 3和c-myc介导。 先前的研究报道，β-catenin信号在GC中经常被激活，这与GC患者的生存有关。 35 , 36 TCF-β信号通路参与了TRIM25在GC细胞迁移和侵袭中的调节。 31 在我们的研究中，敲低TRIM37显著降低了ERK1/2磷酸化，而过表达TRIM37则具有相反的效果。 此外，TRIM37诱导的ERK1/2和c-myc磷酸化被ERK1/2抑制剂U0126有效降低，而裂解的caspase 3增加。 TRIM37敲除可有效降低ERK1/2激动剂EGF重组蛋白诱导的细胞增殖和ERK1/2磷酸化。 此外，我们发现TRIM37的过度表达并不影响DUSP6的转录，但抑制了其在GC细胞中的翻译。 进一步分析表明TRIM37和DUSP6之间的相互作用，TRIM37过度表达增强了GC细胞中DUSP6的泛素化。 因此，TRIM37过表达可能通过增强DUSP6在GC细胞中的泛素化和降解来抑制其蛋白水平。 裸鼠体内实验进一步显示，TRIM37敲除对肿瘤生长的抑制作用，伴随着裂解caspase 3增加，c-myc和磷酸化ERK1/2降低。 综上所述，我们推断TRIM37可能通过调控裂解的caspase 3和c-myc激活ERK1/2通路来调节GC细胞增殖、细胞周期和凋亡，这与ERK1/2信号通路参与GC的报道一致。 37 , 38 然而，TRIM37-ERK1/2在调控GC中caspase 3和c-myc方面缺乏具体机制是本研究的局限之一。 如果可能，未来将进行进一步的实验来探索这一方面。 总之，本研究表明TRIM37可能在GC中作为癌基因发挥作用。 敲除TRIM37可以显著抑制GC细胞增殖，阻止G1期细胞周期进展，并促进凋亡，这可能是通过调节裂解的caspase 3和c-myc激活ERK1/2信号通路介导的。 因此，靶向TRIM37可能成为GC治疗的潜在新疗法。
资金报表 本研究得到上海市卫生委员会资助（201940433）。
数据共享声明 本研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。
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