Down-regulation of DUSP6 expression in lung cancer: its mechanism and potential role in carcinogenesis

doi:10.2353/ajpath.2009.080489

.2009年8月；175（2）：867-81。

doi:10.2353/ajpath.2009.080489。 Epub 2009年7月16日。

肺癌中DUSP6表达下调的机制及其在致癌中的潜在作用

Koji Okudela公司¹, Takuya Yazawa先生, Tetsukan Woo公司, 坂田正树, 石井俊, 三井秀秀, Hiroaki Shimoyamada公司, 佐藤花子, Michihiko Tajiri公司, 小川信夫, Munetaka Masuda公司, 高桥高桥, 杉村春彦, 北村仁

附属公司

PMID： 19608870
预防性维修识别码： PMC2716981型
内政部： 10.2353/ajpath.2009.080489

肺癌中DUSP6表达下调的机制及其在致癌中的潜在作用

Koji Okudela公司等。美国病理学杂志. 2009年8月.

.2009年8月；175(2):867-81.

doi:10.2353/ajpath.2009.080489。 Epub 2009年7月16日。

作者

Koji Okudela公司¹, Takuya Yazawa先生, Tetsukan Woo公司, 坂田正树, 石井君, 三井秀秀, Hiroaki Shimoyamada公司, 佐藤花子, Michihiko Tajiri公司, 小川信夫, Munetaka Masuda公司, 高桥隆, 杉村春彦, 北村仁

附属

¹横滨市立大学医学研究生院病理学系，日本横滨市金泽区福村3-9号，236-0004。

PMID： 19608870
预防性维修识别码： PMC2716981型
内政部： 10.2353/ajpath.2009.080489

摘要

我们的初步研究表明，致癌KRAS（KRAS/V12）显著抑制永生气道上皮细胞（NHBE-T，带有病毒抗原激活的p53和RB蛋白）的生长。这一过程似乎是一个新的事件，不同于由p53或RB诱导的所谓早衰，表明存在一种新的肿瘤抑制因子，其在致癌KRAS的下游发挥作用。在全面寻找表达水平受KRAS/V12调节的基因后，我们将重点放在DUSP6上，RAS-ERK通路的关键负反馈调节器。然而，显性阴性DUSP6突变体未能挽救KRAS/V12诱导的生长抑制，但为KRAS/V2转导的NHBE-T生成的存活细胞亚群赋予了更强的锚定非依赖性生长活性。发现大多数肺癌细胞系中DUSP6的表达水平弱于NHBE-T，DUSP6修复抑制了细胞生长。在原发性肺癌中，DUSP6的表达水平随着肿瘤生长活性和组织学分级的增加而降低。17.7%的病例发现DUSP6基因座杂合性缺失，并与表达水平降低有关。这些结果表明DUSP6是一种生长抑制物，其失活可促进肺癌的进展。我们通过对致癌KRAS下游靶点的全面搜索，确定了致癌过程中的一个重要因素。

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数字

图1
致癌KRAS对NHBE-T细胞的生物学效应。将空载体（pQCXIH；MOCK）、KRAS/G12（G12）或KRAS/V12（V12）逆转录到NHBE-T细胞。经过4天的选择过程，收集并统计存活种群，并计算出1.0×10⁴将细胞重新接种到一个10厘米的培养皿中。14天后，用甲醇固定细胞并用Giemsa染色(一个). 给出了三次重复实验中菌落计数的平均值和标准偏差（误差条）(B类). 通过Western blotting检测选择过程后立即采集的细胞中KRAS和ACTB的表达(C类). 将选定的细胞培养并传代数次。给出了三次试验累积PDL的平均值和标准偏差（误差条）(D类). 电池（2.5×10⁴)选择过程结束后，将其重新放入培养48小时的室载玻片（LAB-TEK，Electron Microscopy Science；Hatfield，PA）上，然后用90%乙醇固定，并用巴氏染色法染色(E类; ×400).

图2
DUSP6在永生化细胞和癌细胞系中的表达。通过定量逆转录-PCR测定DUSP6和ACTB mRNA的拷贝数。给出了DUSP6 mRNA表达的平均值和标准偏差（误差条），并将其归一化为从三次实验中获得的ACTB mRNA表达(一个). 永生细胞中DUSP6和ACTB蛋白的表达(**B、上部面板**)和肺癌细胞(**C、上部面板**)Western blotting分析。显示了具有代表性的结果。用密度计对DUSP6和ACTB蛋白水平进行半定量（NIH图像；马里兰州贝塞斯达国家心理健康研究所）。DUSP6的蛋白表达标准化为ACTB的蛋白表达。相对于MOCK中的表达式级别(**B、下部面板**)至NHBE-T(**C、下部面板**)显示单元格。永生化气道细胞；MOCK，空载体转导的NHBE-T；G12、KRAS/G12-转导NHBE-T；V12、KRAS/V12转导NHBE-T；腺癌；鳞状细胞癌；大细胞癌；小细胞癌。

图3
DUSP6对NHBE-T细胞的生物学效应。将空载体（pQCXIP；MOCK）、DUSP6或DUSP6/C293S（C293S）逆转录到NHBE-T细胞。用嘌呤霉素筛选3天后，收集存活细胞并计数，1.0×10⁴将细胞重新放置在一个10厘米的培养皿中。14天后，用甲醇固定细胞并用Giemsa染色(一个). 给出了三次重复实验中菌落计数的平均值和标准偏差（误差条）(B类). 选择过程结束后立即采集的细胞通过Western blotting检测DUSP6和ACTB的表达(C类). 选择过程结束后，细胞生长并传代数次。给出了三次试验累积PDL的平均值和标准偏差（误差条）(D类). 用KRAS/V12（V12）连续转导嘌呤霉素选择的MOCK和DUSP6/C293（C293）转导细胞。用潮霉素B筛选3天后，收集细胞并计数，细胞数为5.0×10⁴将细胞重新放置在一个10厘米的培养皿中。14天后，用甲醇固定细胞并用Giemsa染色(E类). 给出了三份实验扫描照片中可见菌落计数的平均值和标准偏差（误差条）(F类). 通过Western blotting检测MOCK/V12-或C293S/V12-串联转导NHBE-T细胞和空pQCXIP/pQCXIH转导NHBE-T细胞（MOCK/MOCK）产生的亚群磷酸化ERK1/2（pERK1/2）、ERK1/2、KRAS和ACTB的表达。显示了具有代表性的结果(**G公司**). 亚群在有序培养条件下生长并传代数次。给出了三次实验累积PDL的平均值和标准偏差（误差条）(**H（H）**). 电池（1.25×10⁴)将其中的亚群培养并在0.3%软琼脂中培养5周，然后用4%多聚甲醛缓冲溶液固定(我). 给出了三次重复实验的菌落计数平均值和标准偏差（误差条）(J型).

图4
DUSP6对A549肺癌细胞的生物学效应。将空载体（pQCXIP；MOCK）或DUSP6逆转录到A549细胞。选择过程三天后，收集并计数细胞，1.0×10⁴将细胞重新放置在一个10厘米的培养皿中。12天后，用甲醇固定细胞并用Giemsa染色(一个). 给出了三次重复实验中菌落计数的平均值和标准偏差（误差条）(B类). 选择过程结束后立即采集的细胞通过Western blotting检测DUSP6和ACTB的表达。显示了具有代表性的结果(C类). 对所选细胞进行培养、生长和传代。给出了三次试验累积PDL的平均值和标准偏差（误差条）(D类). 电池（2.5×10⁴)将其接种到培养箱载玻片（LAB-TEK 2孔培养箱，电子显微镜科学）上并培养48小时，然后用BrdU脉冲标记，固定并对BrdU进行免疫染色，以确定标记指数(E类，**上部面板**; LI，BrdU标记指数）。电池（2.5×10⁵)选择过程结束后，将种子接种到10厘米的培养皿中，培养5天，然后收获并用70%乙醇固定，然后进行RNase a处理。细胞用碘化丙啶染色，用流式细胞仪分析细胞周期分数(**E、下部面板**).

图5
DUSP6启动子和内含子1的甲基化状态。用定量逆转录-PCR检测载体（Vcl）、AZA、TSA或AZA和TSA联合处理的细胞是否恢复DUSP6 mRNA表达。将DUSP6 mRNA的拷贝数归一化为β-肌动蛋白的拷贝数，作为每个细胞样本中DUSP6的表达水平。然后，将从三次重复实验中获得的每个细胞系中的相对表达归一化为未处理对照（Ctl）的水平，绘制出图(年轴）(一个). 将荧光素酶报告子构建物、空载体、−511至+24、−1030至+24和−1539至+24（起始密码子的第一个碱基的位置被确定为+1）转染到NHBE-T中。按照材料和方法中的描述测量并归一化荧光素酶活性。给出了重复实验中活度与空向量活度比（vector）的平均值和标准偏差（误差条）(B类). 使用硫酸氢钠修饰的基因组DNA作为模板，对DUSP6基因座中从−960到−266的区域进行PCR扩增。通过DNA测序分析八个PCR产物亚克隆的甲基化状态。打开(○) 和填充（•）圆圈分别表示CpG位点的非甲基化和甲基化胞嘧啶(C类). 以硫酸氢钠修饰的基因组DNA为模板，用甲基或非甲基DNA特异性引物对DUPS6基因内含子1中+544至+627的区域进行PCR扩增。产物在3%琼脂中通过电泳分离并用溴化乙锭染色(D类).

图6
DUSP6和Ki-67在原发性肺癌中的表达。DUSP6的表达(左边面板）和Ki-67（MIB1，**正确的**用免疫组织化学方法检测正常支气管上皮和原发性肺癌。DUSP6表达水平分为四类；阴性（等级0，**左下面板**)，微弱（1级，**左侧第四个面板**)，中等（2级，**左第三个面板**)和强大（3级，**左侧第二个面板**). 微弱表达被定义为与支气管上皮细胞相似的水平(左上面板）。强表达被明确定义为信号强度大于支气管上皮细胞(**左侧第二个面板**)适度表达被定义为介于微弱和强烈之间的水平(**左侧第四个面板**). Ki-67表达细胞的比例被确定为MIB1的标记指数（MIB1指数），如材料和方法所述。ADC、腺癌；WEL，分化良好；MOD，中度分化；支气管肺泡癌；腺泡癌；SOL，粘液性实体癌。每个放大倍数为×400。

图7
LOH分析。覆盖外显子1多态性区域的168-bp片段（340（t/g））；114（亮氨酸/缬氨酸）经PCR-扩增，随后用BsiHAKI消化，然后在5%琼脂中通过电泳溶解。亮氨酸等位基因（Lu）被切割成135（和33）个−bp的片段（更快的迁移带）。缬氨酸等位基因对BsiHAKI消化具有抗性（迁移带较慢）。显示了一个具有代表性的结果。**上部面板**，无BsiHAKI消化；**下部面板**，用BsiHAKI消化。NIN，非信息性（纯合子）；RTN，等位基因被保留；LOH，半等位基因缺失；N、非肿瘤部分；T、肿瘤部分。

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