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.2013年12月；6(6):1624-1630.
doi:10.3892/ol.2013.1605。 Epub 2013年10月7日。

抑癌基因DUSP6参与食管鳞癌的分化和凋亡

马建娟 1, Xiying余, 郭丽萍, 世新路
附属公司

抑癌基因DUSP6参与食管鳞癌的分化和凋亡

马建娟等。 Oncol Lett公司. 2013年12月.

摘要

双特异性磷酸酶6（DUSP6）是磷酸化细胞外信号调节激酶的一种特异性负反馈调节因子，在多种实体瘤中起着重要的抑癌作用。在这项研究中，64.2%（61/95）的食管鳞状细胞癌（ESCC）标本表现出DUSP6蛋白表达减少，而在组织微阵列分析中，91%（81/89）的正常食管标本表现出中等或强烈的DUSP6蛋白表达。总的来说，通过qPCR，36.8%（7/19）的肿瘤活检显示DUSP6与配对正常对照相比至少下调了两倍。免疫印迹分析显示，在EC9706和KYSE150 ESCC细胞系中，DUSP6显著缺失。免疫组化显示，DUSP6蛋白低表达与ESCC病理分级显著相关（P<0.05）。用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理后，两种ESCC细胞系中的DUSP6表达恢复，且表达随药物浓度的变化而变化。甲基化特异性PCR分析显示两个ESCC细胞系中存在甲基化特异产物。通过膜联蛋白/碘化丙啶检测，我们观察到两种ESCC细胞系及其转染物的对照组和实验组之间的早期和总凋亡比例存在显著差异（P<0.001）。免疫印迹法观察到两个pCMV-DUSP6转染细胞中表达的裂解PARP产物（caspase介导的凋亡标记）与亲本和pCMV-转染的EC9706和KYSE150细胞形成显著对比。总之，我们的结果支持DUSP6作为ESCC中一个新的候选抑癌基因的作用，这可能是ESCC的潜在预后标记物。

关键词：细胞凋亡；区别；双特异性磷酸酶6；食管鳞癌；甲基化。

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数字

图1
图1
DUSP6在食管癌中的表达。（A） 用免疫组织化学方法检测DUSP6在正常食管上皮和原发性食管鳞癌中的表达。正常食管上皮显示在面板N中，原发性食管癌显示在面板T1、T2和T3中（放大倍率：左×40；右×100）。（B） qPCR检测DUSP6在同一患者配对正常组织和肿瘤组织中的表达。总的来说，36.8%（7/19）的活检显示DUSP6与相应的正常对照相比至少下调了两倍。虚线表示下调的双重阈值。（C） Western blot分析检测DUSP6在EC9706、空载体转染的EC9706，pCMV-DUSP6（DUSP6）转染的EC 9706，KYSE150，空载体转导的KYSE15和pCMV-DUSP6转染的KYSE250细胞中的表达。（D） Western blot分析检测DUSP6和p-ERK在EC9706、空载体转染EC9706和pCMV-DUSP6（DUSP6）转染的EC9706细胞中的表达。DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞癌；p-ERK，磷酸化细胞外信号调节激酶。
图2
图2
DUSP6启动子和内含子1的甲基化状态。（A） Western blot分析显示，经两种不同浓度（20和50μM）的5-氮杂-2′-脱氧胞苷脱甲基处理后，两种ESCC（EC9706和KYSE150）细胞系中的DUSP6表达恢复。根据5-氮杂-2′-脱氧胞苷浓度的不同，两种ESCC细胞系中恢复的DUSP6表达也不同。（B） 甲基化特异性PCR分析：以甲基化或非甲基化DNA特异性引物为模板，对DUPS6基因内含子1中的+544至+627区域进行PCR扩增。产物在3%琼脂中通过电泳分离，并用溴化乙锭染色。DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞癌；5-氮杂，5-氮杂-2′-脱氧胞苷；U、 非甲基化；M、 甲基化。
图3
图3
DUSP6过表达通过PARP途径增加ESCC细胞凋亡。（A–C）Annexin/PI分析：用EV或pCMV-DUSP6质粒（DUSP6）瞬时转染EC9706和KYSE150细胞，用Annexin V-FITC和PI染色，然后用流式细胞仪进行分析。结果显示每个象限中列出的细胞百分比：左下角，活细胞；右下角，细胞早期凋亡；右上角，细胞处于晚期凋亡状态。（A） 具有代表性的流量直方图。（B） 条形图显示了两种细胞系及其转染剂的早期凋亡细胞百分比。（C） 条形图显示两种细胞系及其转染剂的细胞在总凋亡中的百分比。（D） PARP检测：通过89-kDa PARP裂解产物的免疫印迹检测证实过度表达EC9706和KYSE150的DUSP6转染体的凋亡。DUSP6，双特异性磷酸酶6；食管鳞癌；PI，碘化丙啶；EV，空向量；异硫氰酸荧光素。
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