睾丸间质细胞内胆固醇转运中的非特异性脂质转运蛋白甾醇载体蛋白-2

序列选择、比对和RNA测序（RNA-seq）

小鼠SCPX序列最初从EST克隆（MMM1013-202763426，Dharmacon，Pittsburgh，PA，USA）获得，然后进行亚克隆以制备SCPX和SCP2融合蛋白。直系人类SCPX公司基因与小鼠对齐Scpx公司使用聚类X，从文献中检索可变序列特征。至于RNA-seq，使用Trizol试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）提取MA-10细胞的总RNA，制备Illumina HiSeq 2000配对-end（2×100 bp）文库，然后在麦吉尔大学和魁北克基因组创新中心对细胞的总转录物进行测序[27]. 使用该中心基因组分析工具包中的RNA-Seq分析管道进行数据分析。使用SeqMonk软件包绘制和显示RNA-Seq数据(http://www.bioinformatics.bsrc.ac.uk/projects/seqmonk/；Babraham生物信息学，英国剑桥）和UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu)带有自定义曲目。

冷冻小鼠组织切片和细胞的免疫荧光染色

为了对小鼠组织切片进行免疫荧光染色，将野生型小鼠睾丸嵌入最佳切割温度（OCT）培养基中，并在古德曼癌症研究中心组织学核心设施（加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学）制备6μm冰冻切片。染色方法与前面描述的方法类似[28]. 冷冻切片用SCPX或SCP2特异性抗体孵育，然后用荧光共轭Alexa Fluor^®546头驴抗兔IgG（分子探针，加拿大安大略省伯灵顿市）。在相同条件下，使用奥林巴斯Fluoview FV1000共焦激光扫描显微镜和反向荧光显微镜（奥林巴斯IX5；日本东京奥林巴斯公司）获得图像。本研究中使用的小鼠是从Jackson实验室购买的C57BL/6J(https://www.jax.org)，饲养在麦吉尔大学健康中心（RI-MUHC，魁北克省蒙特利尔）的动物设施中，所有饲养程序均按照标准协议进行。CO处死两个月大的野生型小鼠₂收集窒息患者及相关组织进行冰冻切片。所有动物研究和程序均由麦吉尔大学动物护理和使用委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会指南中的建议进行。

为了准备细胞的免疫荧光染色，MA-10细胞生长在一个35 mm的FluoroDish上^™无菌培养皿（美国佛罗里达州萨拉索塔，世界精密仪器公司）。用1X磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，用4%PFA溶液固定20分钟，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透1分钟，并在PBS内由1%牛血清白蛋白（BSA）组成的封闭溶液中培养1小时。细胞与SCPX或SCP2、PMP70或VDAC1特异性兔抗体在4°C下孵育过夜。第二天，用1X PBS清洗细胞，并用荧光偶联Alexa Fluor 546驴抗兔IgG（分子探针；加拿大安大略省伯灵顿市）和太平洋蓝培养细胞^™山羊抗小鼠IgG在室温下培养1小时。使用UltraCruz对细胞核进行复染^™安装介质（圣克鲁斯生物技术：sc-24941；美国德克萨斯州达拉斯）。细胞在Olympus Fluoview FV1000共聚焦激光扫描显微镜下观察，激发/发射波长如下：红色（DsRed），557/592 nm；蓝色（DAPI），350/460 nm。为了更好地观察同位化，蓝色通道中的图像被涂成了绿色。

亚细胞分离、蛋白质提取、SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹技术

为了进行亚细胞分离，MA-10细胞在150mm的培养皿中生长到70%的汇合处，用PBS洗涤，然后收获用于进一步处理[29]. 简而言之，为了制备粗膜，用玻璃器皿将细胞均质，然后在隔离缓冲液1（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖和30 mM Tris.HCI，pH 7.4）中进行3次冷冻和解冻循环。在4°C下，在800 x g下离心匀浆5分钟。收集的上清液（含细胞溶质蛋白）在4°C下以11000 x g的速度离心两次10分钟，以获得粗线粒体。将这些制剂重新悬浮在隔离缓冲液2中（250mM甘露醇、5mM HEPES[pH7.4]和0.5mM EGTA）。为了确认粗线粒体部分的富集，我们使用抗COX IV、抗VDAC1和抗HSP60抗体作为线粒体负荷控制，抗CAT（过氧化氢酶）抗体作为过氧化物酶体标记，抗GAPDH抗体作为整体蛋白负荷控制，进行免疫印迹分析。

为了提取蛋白质，MA-10细胞在六孔细胞培养集群培养皿（美国纽约州科宁市科宁公司）中生长，每孔使用250μL哺乳动物蛋白提取试剂（M-PER）（加拿大安大略省伯灵顿市赛默飞世尔科学公司）获取细胞总蛋白，然后在4°C下，在14000 x g下离心10分钟。按照制造商的说明，使用Bradford染料分析法（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad Laboratories Inc.）测量蛋白质浓度，并在595 nm处测量吸光度。十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和免疫印迹分析采用类似于前面描述的程序进行[27]. 简言之，25μg总蛋白提取物在4%–20%Tris–glycine梯度凝胶上电泳分离，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，并在4°C的1X TBST缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，0.05%吐温20）中溶解的10%脱脂乳中隔夜封闭。将膜水平切割，以显示GAPDH水平作为负载对照，切割位置由Novex Sharp预染色蛋白标准（Thermo Fisher Scientific，Burlington，ON，Canada）指导。膜与SCPX、SCP2和GAPDH特异的一级抗体孵育，其次是二级抗体，即抗兔IgG辣根过氧化物酶相关抗体（美国马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术公司）。然后使用Amersham ECL Western Blotting检测试剂（GE Healthcare Life Sciences，Mississauga，ON，Canada）对蛋白质进行可视化，并使用FUJI图像读取器LAS4000（Fujifilm，Tokyo，Japan）采集图像。

质粒构建

使用ECFP-Bak（质粒31501；含Bak蛋白的ECFP-N1）载体（Addgene，Cambridge，MA，USA）构建表达N末端标记SCPX和SCP2（pECFP-SCPX和pECFP_SCP2）的质粒，而pECFP-C1载体（Clontech Laboratories，Mountain View，CA，USA用于创建标记为SCPX和SCP2的C末端（pSCPX-ECFP和pSCP2-ECFP）。使用pEGFP-N1载体（加利福尼亚州山景城Clontech实验室）创建SCPX和SCP2假定线粒体靶向序列的荧光融合蛋白（pSCPX-mito-EGFP和pSCP2-mito-EGFP）。表1列出了构建每个质粒过程中使用的正向和反向引物（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，USA）、限制性内切酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA。进行聚合酶链反应（PCR）以扩增SCPX和SCP2序列，并围绕所需序列创建适当的限制性内切酶位点。合适的限制性内切酶(表1)用于消化载体和插入物，并使用快速DNA连接试剂盒（瑞士巴塞尔Hoffman-La Roche有限公司）进行连接。将连接的载体转化为亚克隆效率^™DH5α^™胜任大肠杆菌Cells（生命技术公司；加拿大安大略省伯灵顿市赛默飞世尔科技公司），以及E类.大肠杆菌选择已成功转化的细胞使用合适的抗生素(表1). 进行PCR以验证载体中是否存在所需的DNA序列。使用QIAprep Spin Miniprep Kit（荷兰文洛市齐根）分离质粒，并使用Sanger DNA测序（加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学基因组魁北克创新中心）进行测序，以确认未引入突变。然后通过生长转化扩增质粒E类.大肠杆菌细胞在Luria Broth（LB）中过夜，然后使用HiSpeed Plasmid Maxi Kit或QIAprep Spin Miniprep Kit（荷兰文洛市齐根）分离核酸。

细胞培养和转染

MA-10小鼠Leydig肿瘤细胞（由美国爱荷华州艾姆斯爱荷华大学M Ascoli博士善意提供）在Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）/火腿F12（50:50）（Gibco^®；Thermo Fisher Scientific（加拿大安大略省伯灵顿），补充5%胎牛血清（FBS）和2.5%马血清（HS）。MA-10细胞在37°C和3.7%CO下培养₂根据前面描述的方法，使用Opti-MEM还原血清培养基（Life Technologies；Thermo Fisher Scientific，加拿大安大略省伯灵顿市）和Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo Fisher Screentific（加拿大安大拿州伯灵顿））将4μg质粒转染细胞[30].

活细胞激光共焦显微镜

在35mm FluoroDish上生长的MA-10细胞^™无菌培养皿（美国佛罗里达州萨拉索塔市World Precision Instruments）与丝裂原-DsRed-pero质粒和SCPX或SCP2的N端或C端融合蛋白之一联合转染。此外，为了研究预测的SCPX和SCP2线粒体靶向序列（presequences）的潜在作用，将两个长度分别为66 bp和60 bp的presequence克隆到pEGFP-N1载体中，以产生两种质粒：pSCPX-mito-EGFP和pSCP2-mito-EGFP。将这些质粒共同转染到MA-10细胞中，以ACBD2-mito-DsRed作为线粒体标记。使用Olympus Fluoview FV1000激光共聚焦显微镜（UPLSAP，×100）获得图像，以观察蛋白质的存在和亚细胞位置。

推测的SCPX和SCP2氨基酸序列比对和预测的线粒体靶向序列

从GenBank检索核酸序列及其相应的预测氨基酸序列（登录号：{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M62361”，“term_id”：“200941”，“term_text”：“M6 2361”}}M62361型和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M55421”，“term_id”：“432978”，“term_text”：“M55421“}}M55421号)人的亚型1和2SCP2号机组基因，也适用于小鼠Scp2系列基因(图2). 这个第2页基因编码SCPX和前SCP2蛋白，两者都包含SCP2蛋白质或C末端结构域的序列[25]. 具有pol II启动子的B2元件正好位于编码SCP2蛋白的序列之前[27]. C端序列包含过氧化物酶体靶向PTS1信号[25]而N末端序列包含假定的线粒体靶向序列（mito-seq）(https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) [26]. 一个保守的胆固醇识别/相互作用氨基酸共识（CRAC）序列（CRAC:L/V-X[1–5]-Y-X轴[1–5]-基于与转位蛋白（18-kDa）的CRAC基序的比较，SCPX蛋白中均存在R/K）和一个非融合的CRAC模序，之前称为外周型苯二氮卓受体（PBR）[35].

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图2

小鼠氨基酸预测序列的序列比对与分析Scp2系列人类的基因和亚型1和2Scp2系列基因。

序列比对表明Scp2系列基因编码SCPX和前SCP2蛋白，这两种蛋白都包含SCP2蛋白质或C末端结构域的序列。预测的线粒体靶向序列（有丝分裂或预序列）、过氧化物酶体靶向PTS1信号（PTS1[P]）以及SCPX和SCP2中L/V-（X）1-5-Y-（X。红色向上箭头表示预测的SCP2序列的开始（GenBank ID:｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“M62361”，“term_id”：“200941”，“term_text”：“M62361”｝M62361型用于鼠标和{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M55421”，“term_id”：“432978”，“term_text”：“M55421“}}M55421号对于人类），包含在虚线正方形中突出显示的提议的mito-seq。

低mRNA表达Scp2系列RNA-Seq测定的基因

对MA-10细胞系的整个转录组进行测序，以确定Scp2系列基因。从MA-10细胞收集总RNA，并使用Illumina HiSeq 2000和MiSeq技术（加拿大QC麦吉尔大学魁北克基因组创新中心）进行RNA-Seq。然后使用Galaxy网络服务器（版本15.03.1）、SeqMonk（版本0.29.0）和UCSC基因组浏览器将RNA序列映射到基因组上。RNA-Seq数据表明第2页和Scpx公司转录物在MA-10细胞系中的表达相对较低(图3A). 作为阴性对照，在该基因座未发现转录本Scp2d1号机组基因(图3B). 详细查看导致Scp2系列(图3C)和Scpx公司(图3D)转录本进一步证明了这些转录本的低表达。B2衍生的pol II启动子的存在，可能在Scp2系列，就在Scp2系列基因，也有说明(图3C).

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图3

低转录表达Scp2系列MA-10细胞系中的基因。

（A） RNA-Seq数据表明第2页和Scpx公司转录物在MA-10细胞系中低表达。（B） 在控制基因座没有发现Scp2d1号机组基因，在RNA-seq中用作阴性对照。（C） 详细查看Scp2系列该基因显示该外显子的低表达水平，并说明B2衍生的启动子正好位于该基因之前。（D） 详细查看Scpx公司显示该外显子的低表达水平。

SCPX和SCP2在小鼠睾丸间质组织中的大量表达

采用共焦成像和常规表观荧光显微镜对免疫荧光染色进行评估，以研究SCPX和SCP2在野生型小鼠睾丸冷冻切片中的内源性分布。发现SCPX在小鼠睾丸间质结缔组织中高度表达，该区域富含莱迪格间质细胞，但在生精小管的生殖细胞中几乎不表达(图4A和4B). SCP2在睾丸内的分布与SCPX相同，但表达水平较低(图4C和4D).

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图4

使用SCPX和SCP2特异性抗体对小鼠睾丸组织进行免疫荧光染色冰冻切片。

该分析旨在研究SCPX和SCP2在野生型小鼠睾丸中的内源性分布。（A–B）SCPX在小鼠睾丸间质结缔组织中高度表达，该区域富含莱迪格细胞，但在生精小管的生殖细胞中不表达。（C–D）SCP2与SCPX的分布相同，但表达水平较低。比例尺，50μm。

内源性SCPX和SCP2在MA-10细胞中的分布

免疫荧光染色检测SCPX和SCP2在MA-10细胞系中的内源性分布，DAPI染色染色细胞核。发现内源性SCPX在胞浆中呈颗粒状分布，与线粒体标记蛋白抗VDAC1相比，更可能与过氧化物酶体标记蛋白抗PMP70共同染色(图5A). 然后使用SCPX、COXIV（线粒体对照）和GAPDH（全细胞裂解物负荷对照）特异性抗体对MA-10细胞的总蛋白提取物、细胞溶质部分和线粒体部分进行免疫印迹。SCPX存在于总蛋白提取物和细胞溶质部分，但不存在于线粒体部分(图5B). 然而，发现内源性SCP2在与抗PMP70和抗VDAC1蛋白共染色时具有颗粒分布(图5C). 使用SCP2、VDAC1（线粒体对照）和GAPDH（全细胞裂解物负荷对照）抗体进行免疫印迹。SCP2存在于总蛋白提取物和线粒体部分中，但在细胞溶质部分中较少(图5D). 这些结果表明SCPX是一种过氧化物酶体蛋白，而SCP2可能与线粒体密切相关。此外，我们使用线粒体基质蛋白HSP60抗体通过免疫印迹分析验证了分离的亚细胞组分的纯度(图5E)和过氧化物酶体基质标记蛋白过氧化氢酶（CAT）(图5F). 获得的数据表明，线粒体基质蛋白主要存在于线粒体、“有丝分裂”、亚细胞组分中，过氧化物酶体基质蛋白主要发现于细胞溶质、“细胞”和亚细胞组份中。

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图5

MA-10细胞内源性SCPX和SCP2蛋白的双重免疫荧光染色和免疫印迹分析。

（A） MA-10细胞（红色）、PMP70（过氧化物酶体标记蛋白，绿色）和VDAC1（线粒体标记蛋白，蓝色）内源性SCPX的双重免疫荧光染色。用DAPI（涂成绿色）对细胞核进行复染。比例尺，5μm。（B） MA-10细胞裂解物亚细胞组分中内源性SCPX的免疫印迹分析。COXIV用作线粒体标记蛋白，GAPDH用作全细胞裂解物负荷控制。M、 蛋白质标记，以kDa表示；全细胞裂解液总量；细胞、胞质部分；线粒体富集组分。（C） MA-10细胞（红色）、PMP70（绿色）和VDAC1（绿色）内源性SCP2的双重免疫荧光染色。nNucleus用DAPI（涂成绿色）复染。比例尺，5μm。（D） MA-10细胞裂解物亚细胞组分中内源性SCP2的免疫印迹分析。VDAC1用作线粒体标记蛋白，GAPDH用作全细胞裂解物负载对照。（E–F）对分离的MA-10亚细胞组分进行免疫印迹分析，确定线粒体基质蛋白HSP60（E）和过氧化物酶体基质蛋白过氧化氢酶（CAT）（F）。GAPDH用作加载控制。M、 蛋白质标记，以kDa表示；全细胞裂解液总量；细胞、细胞溶质组分；线粒体富集组分。

ECFP–SCPX/2的过氧化物酶体定位和SCPX/2-ECFP的细胞质定位

根据初步发现，22-NBD-胆固醇没有定位于MA-10细胞系中的过氧化物酶体(图1)鉴于SCPX和SCP2均与过氧化物酶体相关通过它们的PTS1序列，而SCP2也与线粒体密切相关(图5)进行了进一步的研究，以阐明SCPX和SCP2蛋白的亚细胞定位，以及这些蛋白在22-NBD-胆固醇的细胞内定位中的作用。将荧光ECFP标记融合到SCPX和SCP2蛋白的C端或N端，然后使用共焦激光显微镜通过活细胞成像研究这些融合蛋白的亚细胞定位。C端蛋白融合产生SCPX–ECFP和SCP2–ECFP荧光融合蛋白，阻断过氧化物酶体靶向PTS1信号，而N端融合产生ECFP–SCPX和ECFP–SCP2融合蛋白，阻断预测的线粒体靶向序列。用mito-DsRed-pero和前面提到的一种荧光融合蛋白共同转染MA-10细胞，并用共焦激光显微镜观察荧光标记蛋白的细胞内定位。观察到两种SCPX(图6A-6D)和SCP2(图6E-6H)当线粒体靶向序列受阻时，被靶向过氧化物酶体。当过氧化物酶体靶向信号被阻断时，发现SCPX蛋白在细胞质中广泛存在，但在细胞核中不存在(图6I)而SCP2蛋白则成为一种可溶性蛋白，存在于细胞质和细胞核中(图6J). 此外，仅由空载体ECFP-N1制成的荧光蛋白被发现分布在胞浆和细胞核中(图6K)，这似乎还没有定论。然而，SCPX和SCP2这两种内源性蛋白的免疫荧光染色表明SCP2存在核定位(图6L和6M). 如与过氧化物酶体标记物PEX11α共定位所示，丝裂原-DsRed-pero荧光蛋白定位于过氧化物体和线粒体(图6N). 对SCPX和SCP2中发现的信号序列的分子解剖表明，过氧化物酶体靶向PTS1信号足够强，可以确保蛋白质的过氧化物酶定位；然而，N末端线粒体靶向序列的功能不足以将SCPX和SCP2蛋白定位到线粒体。

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图6

通过共焦激光显微镜对MA-10细胞中SCPX、SCP2和mito-DsRed-pero荧光融合蛋白的亚细胞定位进行活体细胞成像。

（A–H）ECFP–SCPX（A–D）和ECFP-SCP2（E–H）融合蛋白与mito-DsRed-pero共转染。过氧化物酶体和线粒体双重标记物。重叠表明ECFP–SCPX和ECFP-SCP2蛋白在过氧化物酶体中的定位（如白色箭头所示）。比例尺，5μm。（I–J）SCPX-ECFP（I）和SCP2-ECFP（J）蛋白与mito-DsRed-pero共转染。当过氧化物酶体靶向信号被阻断时，SCPX–ECFP和SCP2-ECFP在细胞质中广泛分布，SCP2–ECFPs也分布在细胞核中。比例尺，2μm。（K） 使用Hoechst 33342进行核酸染色，单独转染ECFP-N1载体。比例尺，5μm。（L–M）使用SCPX和SCP2特异性抗体对MA-10细胞中的内源性SCPX与SCP2进行免疫荧光染色，其中SCP2的核染色用白色箭头表示。（N） 丝裂原-DsRed-pero荧光融合蛋白与过氧化物酶体膜标记AmCyan-Pex11α的克隆化，除了线粒体定位外，还表明丝裂原DsRed-per的过氧化物酶定位。

假定的线粒体靶向序列缺乏将融合蛋白导向线粒体的能力

以前的几份报告表明或提到pro-SCP2的N末端序列包含一个假定的线粒体靶向序列[14,17,36]. SCPX（SCPX-mito）、SCP2（SCP2-mito）和ACBD2蛋白（ACBD2-mito；用作线粒体靶向序列控制）的预测线粒体靶向顺序的序列比对表明，与已知线粒体蛋白质相比，SCPX-mito和SCP2-mit的一级序列具有相当大的相似性(图7A). 为了进一步表征假定的线粒体靶向序列的功能以及是否能够将SCPX和SCP2靶向线粒体，克隆了每个线粒体靶向顺序，以制备荧光融合蛋白SCPX-mito-EGFP和SCP2-mito-EGFP。然后使用共聚焦激光显微镜研究这些荧光融合蛋白的亚细胞分布，将ACBD2 mito-DsRed（先前显示仅针对线粒体）作为阳性对照。观察到SCPX-mito-EGFP(图7B和7C)也不是SCP2-mito-EGFP(图7D和7E)靶向线粒体，以ACBD2-mito-DsRed标记。这可能是真的，前序列在协助C末端PTS1介导的过氧化物酶体靶向中发挥作用[36].

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图7

SCPX和SCP2的前序列在线粒体靶向中没有显示作用。

（A） SCPX（SCPX-mito）和SCP2（SCP2-mito）的预测线粒体靶向序列与已知线粒体蛋白ACBD2（ACBD2-mito）的序列比对。（B-E）用ACBD2-mito-DsRed作为阳性对照（红色），对SCPX-mito-EGFP（B-C）和SCP2-mito-EGFP（D-E）荧光融合蛋白（绿色）的亚细胞定位进行活细胞成像。白色箭头，表示B和D中未染色的线粒体，C和E中分别用ACBD2-mito-DsRed染色的线粒体。比例尺，5μm。

SCPX和SCP2在小鼠睾丸组织特异性表达及MA-10细胞亚细胞表达

男性睾丸能够将胆固醇转化为Leydig细胞内的类固醇激素，而Leydig起着重要的主导作用。此外，SCP2与类固醇生成有关通过它影响细胞内胆固醇转运[17]. 尽管SCP2被认为是莱迪格细胞特异性蛋白[39]，它也被发现存在于支持细胞中[40]. 因此，我们进行了额外的探索性实验，以研究SCPX和SCP2在小鼠睾丸中的存在和分布。这些发现将有助于确定我们对MA-10小鼠Leydig肿瘤细胞中这些蛋白亚细胞定位的高分辨率观察与动物模型的相关性。此外，Leydig细胞严重参与类固醇生成，因为它们是男性体内唯一能够合成和分泌睾酮的细胞[41]. 慢性黄体生成素（LH）治疗可增加大鼠Leydig细胞的睾酮合成体内，伴随着SCP2的增加，尽管这些观察结果是否相关尚待确定[42]. 此外，急性LH刺激导致SCP2快速短暂增加，有人提出SCP2和过氧化物酶体在胆固醇转运到线粒体之前在睾酮生物合成中发挥作用[43]. 此外，LH缺乏导致Leydig细胞内过氧化物酶体和总SCP2减少，以及睾酮合成和分泌减少[21,43]. 这些发现都指向睾丸间质细胞过氧化物酶体和SCP2在睾丸睾酮生成中起关键作用[21].

免疫荧光染色的SCPX和SCP2均在睾丸间质中高表达，睾丸间质富含莱迪格细胞，但这两种蛋白在生精小管生殖细胞中均低表达。这一发现加强了SCPX和SCP2参与类固醇生成的假设，因为Leydig细胞是已知的类固醇产生细胞。尽管我们认识到正常小鼠Leydig细胞和MA-10小鼠Leyding肿瘤细胞系之间存在巨大差异，选择该细胞系是为了进一步研究SCPX和SCP2的亚细胞分布，因为它是研究激素依赖性Leydig细胞类固醇生成的细胞和分子机制的成熟模型[27,29,44–46]. 虽然关于MA-10细胞系中SCP2的研究还不多，但之前的一项研究已经使用MA-10细胞来研究SCP2在类固醇生成中的作用，除了研究重点是分离的线粒体而不是整个细胞[47]. 根据我们对整个细胞转录组进行的初步RNA-seq数据[27]，我们发现两人的成绩单Scpx公司和第2页MA-10细胞低表达。然而，这两种蛋白质的蛋白质水平似乎很高，足以在免疫印迹分析和免疫荧光染色中检测到，其中发现这些蛋白质与过氧化物酶体以及线粒体密切相关。根据LH治疗或LH剥夺分别导致细胞过氧化物酶体数量增加或减少的观察结果，这些发现与之前的推测一致，即线粒体中睾丸类固醇的合成与过氧化物酶结合[48].

SCPX和SCP2的双重或多重细胞内定位

我们最初假设SCPX和SCP2都将靶向过氧化物酶体和线粒体，并在类固醇生物合成过程中结合胆固醇以协助线粒体胆固醇转运。我们推测，ECFP荧光标记与SCPX和SCP2蛋白的N末端融合将导致它们定位于过氧化物酶体，因为荧光标记将阻断线粒体靶向序列。我们的结果与这一假设一致，因为ECFP–SCPX和ECFP-SCP2被发现与线粒体DsRed-pero在过氧化物酶体共同定位，证明ECFP？SCPX及ECFP！SCP2对该细胞器具有靶向性。这些发现与蛋白C末端存在过氧化物酶体靶向PTS1信号相一致[25]它们表明，PTS1的强度足以将SCPX和SCP2单独靶向过氧化物酶体。先前的研究发现，尽管SCP2的大多数存在于过氧化物酶体中，但在线粒体、内质网和胞浆中也检测到大量SCP2[14–16]. 然而，我们注意到，当N末端序列受阻时，ECFP–SCP2似乎仅定位于过氧化物酶体，这表明SCP2的N末端序列可能在将蛋白质靶向这些其他细胞器方面发挥作用。尽管SCPX在其N末端也包含一个假定的线粒体靶向序列，但先前的研究发现它仅局限于过氧化物酶体[17]，与我们的观察结果一致，即ECFP–SCPX仅在过氧化物酶体中发现。

我们还假设ECFP标签与SCPX和SCP2的C末端融合将导致这些蛋白质定位到线粒体，因为荧光标签会阻断过氧化物酶体靶向信号。这个假设是基于这些蛋白质的N末端表现出线粒体靶向序列的典型特征的观察[26,49]. 虽然线粒体中没有检测到SCPX，但通过线粒体部分的免疫印迹研究，已在线粒体中发现SCP2[50]，免疫金电子显微镜[16]和免疫荧光显微镜[51]. 然而，我们的结果与预期不同，因为SCPX–ECFP和SCP2–ECFP-成为分布在细胞质中的可溶性蛋白质，SCP2-ECFP也分布在细胞核中。对这一观察结果的可能解释是，线粒体靶向序列可能不够强，无法将SCPX和SCP2蛋白仅靶向线粒体，或者可能其他位置的不同信号序列负责蛋白质的线粒体定位。

SCPX有丝分裂EGFP和SCP2有丝分裂EGFP融合蛋白在胞质溶胶和细胞核中的广泛定位，而不是在线粒体中，证实了单独的SCPX和SCP2的线粒体靶向序列不能将这些蛋白靶向线粒体。这些结果与ACBD2-mito-DsRed的阳性对照进行了比较，ACBD2是已知的将ACBD2蛋白靶向线粒体的前序列。因此，SCPX和SCP2的线粒体靶向序列显然不具备将蛋白质靶向线粒体所需的效力。

我们想感谢C Therrien女士的组织冷冻切片。