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.2012年5月10日；86(5):147, 1-15.
doi:10.1095/biolreprod.111.097535。 2012年5月印刷。

通过SINE B2介导的MA-10 Leydig细胞天然反义转录物对易位蛋白（Tspo）的转录调控

锦江扇 1, 瓦西里奥斯·帕帕佐普洛斯
附属公司

通过SINE B2介导的MA-10 Leydig细胞天然反义转录物对易位蛋白（Tspo）的转录调控

锦江扇等。 生殖生物学. .

摘要

转运蛋白（18kDa；TSPO）是一种线粒体胆固醇和药物结合蛋白，参与胆固醇导入线粒体，这是类固醇生成的速率控制步骤。TSPO在睾丸的Leydig细胞中高水平表达，其表达水平决定了细胞形成雄激素的能力。为了寻找调节Tspo表达的机制，已经确定了一些作用于其启动子区域的转录因子。我们在此报告了通过与天然反义转录物（NAT）互补调节Tspo表达的机制。在Tspo位点，SINE B2家族的短散布重复元件（SINE）具有高转录活性的潜力。SINE B2元件介导的转录物延伸与Tspo基因的外显子3重叠，并在MA-10小鼠肿瘤Leydig细胞中形成Tspo（Tspo-NAT）特异性NAT。在睾丸和肾组织中也发现了已鉴定的Tspo-NAT。Tspo-NAT的过度表达调节了MA-10细胞中Tspo基因的表达及其在类固醇形成中的作用。时间-过程研究表明，Tspo-NAT的表达受cAMP调节，可以调节Tspo水平，以维持MA-10 Leydig细胞最佳类固醇生成。综上所述，这些结果表明了一种新的微转录机制，该机制通过基于内含子的SINE B2驱动的Tspo基因特异性NAT调节Tspo表达，从而调节类固醇生成。

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数字

图1。
图1。
鼠标SINE B2元件位于Tspo公司轨迹。A类)小鼠SINE B2元件的典型结构。由SINE B2 pol II启动子驱动的潜在天然反义转录物显示为SINE B2-NAT。B类)m的基因组组织Tspo公司SINE B2元件Tspo公司和麦卡特基因。绿色，Tspo公司外显子；棕色，麦卡特外显子；红色箭头，SINE B2元件；黑色箭头，潜在SINE B2-NAT的转录方向。C类)七人结构Tspo公司SINE B2元件。PA，聚腺苷化信号。
图2。
图2。
的保守序列结构Tspo公司-SINE B2元件和RT-PCR检测和序列测定Tspo公司-NAT。A类)核苷酸序列比对Tspo公司正弦B2，麦卡特-B2、，拉马3-B2和共有tRNA基因。红色字母表示共识A和B框。对齐中的序列号由星号和数字表示。B类)潜在TATA盒（红盒）和转录起始位点（黑箭头）的比较Tspo公司正弦B2。类E盒保守序列用红色条表示。C类)pol II和pol III启动子的示意图Tspo公司SINE B2及其潜力Tspo公司-NAT。表1中列出了用于RT-PCR的引物Exon23-F和mTSPO1-SINEB-R。D类)SINE B2-exon 3的PCR扩增Tspo公司MA-10细胞、睾丸和肾组织中的融合转录物。PCR扩增子的预期大小显示在右侧，引物位置显示在每个面板下方。M、 1 kb+DNA阶梯。E类)SINE B2-exon 3的巢式PCR扩增Tspo公司融合转录物as inD类.F类)PCR扩增产物的序列测定E类外显子3用红色方框表示。内含子3用蓝线表示。
图3。
图3。
表达的证据Tspo公司-通过454对SINE B2特异性反义转录物进行NAT测序。A类)SINE-B2特异性反义转录物在15号染色体上的染色体定位。箭头指示8650序列映射数据的自定义轨迹。B类)的映射Tspo公司-NAT到Tspo公司轨迹。的部分抄本Tspo公司-NAT在自定义轨迹中显示为红色条。保护Tspo公司尽管相应的B2元素，如人类，也显示了跨物种的基因铝来自其他物种的元素在序列一致性上可能不太保守，并且/或者可能具有不同的进化起源。C类)突出显示的映射Tspo公司-NAT到的内含子3Tspo公司基因。映射数据由UCSC基因组浏览器生成(网址：http://genome.ucsc.edu); 每个跟踪器规范都被省略了。
图4。
图4。
5′端序列的测定Tspo公司-通过引物延伸进行NAT。A类)在55°、58°、61°和63°C的温度下延长底漆50分钟。从假定的TATA盒到转录起始位点的大小为257 bp，突出显示为第一个星号。对照组无RNA负荷（0）和无RT反应（-RT）(B类)还显示了。在每条车道上观察到的背景信号是由于寡核苷酸-DIG标记过程中的残留。M、 DIG标记的DNA分子量标记；0、2.5、1.3和0.6μg，用于引物延伸反应的总RNA量。C类)5′端的二级结构Tspo公司-NAT和底漆延伸的潜在产品，如A类.稳定的干环结构Tspo公司-NAT及其与电势5′端的关系Tspo公司-成绩单显示在右侧。三角形代表RT酶复合物，一旦遇到dsRNA结构就偏离了轨道。虚线表示cDNA合成的方向，粗黑线表示每个cDNA产物。
图5：。
图5：。
Tspo公司-通过DNA酶处理的MA-10细胞总RNA的小RNA Northern杂交评估NAT和SINE B2的表达。A类)来自转染载体或B2-AS-过表达或B2-S-过表达质粒的MA-10细胞的总RNA的北方杂交。用5′-末端DIG标记对电转移后的膜进行了探测Tspo公司-NAT特异性寡核苷酸探针。两个独立样本RNA定量的标准化：单独载体、B2-AS-过度表达和B2-S-过度表达。从两个独立实验获得的每条凝胶带的强度表面图显示在凝胶带强度条形图下方（平均值±SD*对< 0.05). 密度计分析在材料和方法; 在相同大小的区域捕获杂交信号，用于信号密度测量（体积）。B类)用DIG-标记的B2-S RNA探针对同一批RNA样品进行北方杂交。C类)用DIG-标记的B2-AS RNA探针对同一批RNA样品进行北方杂交。D类)显示所用相应探针及其与SINE B2元件和Tspo公司-外显子3。预期的转录Tspo公司-显示NAT，箭头表示转录本的潜在延伸与Tspo公司基因。估计的大小标记在每个面板的右侧，箭头突出显示杂交信号，以显示与此处使用的探针相关的可能RNA片段的存在。加载对照是使用DIG-标记的5S rRNA寡核苷酸探针对相同成员进行再表达。M、 RNA分子量标记，地高辛标记。
图6。
图6。
对的影响Tspo公司MA-10细胞中mRNA、TSPO蛋白水平和类固醇合成Tspo公司-ES和Tspo公司-欧洲广告标准。A类)稳定表达Tspo公司-ES和利用引物Exon3-71bpR RT-PCR检测ES-特异性转录物(Nhe公司一） 和BGHR相反（见表1）。B类)稳定表达Tspo公司-EAS和使用引物Exon3-71bprR通过RT-PCR检测EAS特异转录物(Nhe公司一） 和BGHR相反。EAS，该MA-10细胞系过度表达部分反义部分，与Tspo公司外显子3；ES，该MA-10细胞系过度表达与重叠NAT相对应的部分感觉区；五、 该MA-10细胞系仅用载体转染；C、 以野生型细胞系为对照。C类和D类)绝对量化Tspo公司部分NAT过度表达后与Tspo公司实时PCR检测外显子3。标准曲线Tspo公司(C类)使用cDNA混合物生成Tspo公司(D类)采用相对标准曲线法进行测量**对＜0.01（n＝3）。E类)单独稳定表达载体的MA-10细胞中TSPO和GAPDH的Western blot分析，Tspo公司-ES，或Tspo公司-欧洲广告标准。F类)TSPO蛋白的归一化密度测定E类用Scion Image（Scion Corp）扫描每个带的密度分布。结果显示为带强度平均值±SD*对<0.05（n=3）。G公司)TSPO蛋白和类固醇合成在MA-10细胞中的作用Tspo公司-ES和Tspo公司-欧洲广告标准。单独稳定表达载体的细胞（填充水平排列的短对角线），Tspo公司-ES（黑色条），以及Tspo公司-EAS（填充有对角线）在存在或不存在1 mM dbcAMP（cAMP）和20μM 22R-羟基胆固醇的情况下培养。通过RIA测定孕酮，并将数据归一化为每孔的总蛋白浓度。结果显示为三个独立实验的平均值±SD（n=9）**对<0.01（n=3）。
图7。
图7。
的规定Tspo公司-cAMP表达NAT。A类)的时间相关表达式Tspo公司和Tspo公司-NAT对MA-10细胞中dbcAMP-刺激的反应。褶皱的变化Tspo公司mRNA和Tspo公司-使用小鼠通过实时PCR检测NAT RNA水平Hprt公司作为参考基因，然后在指定的时间点标准化为对照治疗（无dbcAMP）。dbcAMP治疗对Tspo公司-NAT与对照组相比显著(对<0.001）。dbcAMP治疗对Tspo公司意义重大(对<0.01），与相应的对照组相比。结果显示为三个独立实验的平均值±SD（n=3）。星形mRNA表达，作为cAMP治疗的指标，如右y轴以灰色显示的背景。在图表下方，来自两个独立实验的代表性免疫印迹显示每个时间点的18-kDa TSPO和24-kDa-HPRT控制蛋白水平。B类)可能的机制示意图Tspo公司SINE B2介导的NATs的基因调控。SINE B2介导的NAT有可能延伸到Tspo公司并通过成熟的反义机制调节基因表达。Tspo公司SINE B2介导的NAT在体内的基因调节是适度的，有助于启动子和转录因子驱动的基因调节。
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