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.2011;6（8）：e22822。
doi:10.1371/journal.pone.0022822。 Epub 2011年8月1日。

类固醇生成性急性调节蛋白天然反义转录物在MA-10小鼠肿瘤Leydig细胞中的激素依赖性表达

安娜·费尔南达·卡斯蒂略 1, 锦江扇, 瓦西里奥斯·帕帕佐普洛斯, 埃内斯托·波德斯塔
附属公司

类固醇生成性急性调节蛋白天然反义转录物在MA-10小鼠肿瘤Leydig细胞中的激素依赖性表达

安娜·费尔南达·卡斯蒂略等。 公共科学图书馆一号. 2011.

摘要

胆固醇转运对许多生理过程至关重要，包括类固醇生成。在类固醇生成细胞中，激素诱导的胆固醇转运由包含类固醇形成急性调节蛋白（StAR）的蛋白质复合物控制。Star表达为3.5kb、2.8kb和1.6kb转录本，仅在其3'非翻译区域存在差异。由于这些转录物共享相同的启动子，mRNA的稳定性可能参与其差异调节和表达。最近，天然反义转录物（NAT）的鉴定为真核基因表达增加了另一个水平的调控。在这里，我们发现了一个新的NAT，它是对拼接的Star mRNA序列的补充。使用5'和3'RACE、链特异性RT-PCR和核糖核酸酶保护试验，我们证明Star NAT在MA-10 Leydig细胞和类固醇生成小鼠组织中表达。此外，我们确定人类绒毛膜促性腺激素通过cAMP刺激Star NAT的表达。我们的结果表明，正反义Star RNA可能受到协调调控，因为它们在MA-10细胞中共同表达。Star NAT的过度表达对cAMP刺激后不同Star感觉转录物的表达有不同的影响。同时，在StAR NAT存在下，StAR蛋白和孕酮的生成水平被下调。我们的数据确定反义转录是参与类固醇生物合成调节的另一种机制。

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数字

图1
图1。星形MA-10细胞天然反义转录物筛选。
从MA-10细胞中提取总RNA并用DNase I处理。使用三组不同的三种序列特异性引物进行RT、PCR和巢式PCR，进行5′RACE。琼脂糖凝胶电泳后，洗脱条带，并克隆到pGEM®-T Easy载体中进行测序。通过BLAST和Vector NTITM Suite 8软件对结果进行分析。A类.上部面板。示意图显示了所用三组引物（G1、G2和G3）的相对位置。下部面板。用每个引物组（第2道）扩增产生的巢式PCR产物的代表性图像。第一道显示了DNA分子量阶梯。箭头表示洗脱带的表观大小（以碱基对或bp为单位）。B类.显示合成产品代表序列的示意图。尺寸以bp表示。这些序列与星形显示转录序列。
图2
图2。星形NAT在MA-10细胞中的表达。
从MA-10细胞中提取总RNA，在序列特异性逆转录之前用DNase或RNase处理，然后进行PCR/巢式PCR和测序。A类显示在这些实验中使用的RT引物（G3.1）、PCR引物（Fw.1和G3.2）和嵌套PCR引物（Fw.2和G3.3）的示意图。完整的示意图星形显示PCR产物测序后获得的NAT序列。B类RT-nested PCR产物的代表性图像，其身份通过测序确认+R、 RNase处理的RNA控制-RT，无逆转录酶RT-PCR对照-p、 无底漆的RT反应；pi，在非特异性引物存在下的RT反应；MW，DNA分子量阶梯。箭头表示以bp为单位的外观尺寸。C类.聚乙烯（A）+使用寡聚（dT）纤维素色谱法从MA-10细胞总RNA中纯化RNA。DNase I处理后，按照上述方法进行特异性RT、PCR和巢式PCR。PCR产物的代表性图像如图所示。
图3
图3。星形NAT 3′端特征。
A类从MA-10细胞中分离出总RNA并用DNase I处理。使用两个序列特异性引物进行PCR和巢式PCR扩增，进行3′RACE。琼脂糖凝胶电泳后，洗脱条带，并克隆到pGEM®-T Easy载体中进行测序。结果通过BLAST和Vector NTITM Suite 8软件进行分析。左侧面板。显示所使用的序列特异性引物的相对位置的示意图。右侧面板。生成的嵌套PCR产物的代表性图像。MW，DNA分子量阶梯：-RT，无逆转录酶RT-PCR控制。箭头表示表观尺寸（单位：bp）。B类从MA-10细胞中提取的总RNA在序列特异性反转录之前用DNase或RNase处理，然后进行PCR/巢式PCR和测序。上部面板。示意图显示了这些实验中使用的RT引物（Rv.RT）、PCR引物（Fw.1和Rv.1）和嵌套PCR引物。完整的示意图星形显示PCR产物测序后获得的NAT序列。下部面板。RT-nested PCR产物的代表性图像+R、 RNase处理的RNA控制-RT，无逆转录酶RT-PCR对照-p、 无底漆的RT反应；pi，在非特异性引物存在下的RT反应；MW，DNA分子量阶梯。箭头表示以bp为单位的外观尺寸。
图4
图4。星形NAT在小鼠组织中的表达。
A类从不同的小鼠组织中提取总RNA并用DNase I处理。如图1所示执行5′RACE。图中显示了使用G1和G3引物生成的RT-nested PCR产物的代表性图像。MW，DNA分子量阶梯。B类.星形使用DNase I处理的不同小鼠组织总RNA进行NAT序列特异性逆转录，然后进行PCR/嵌套PCR，如图2所示。第19层mRNA是一种管家核糖体蛋白，用作负荷控制。图中显示了RT-nested PCR产物的代表性图像。测序证实了扩增产物的一致性。
图5
图5。激素刺激分析星形通过RT-PCR表达NAT。
用hCG（20 ng/ml）培养MA-10细胞(A类)或8Br cAMP（1mM）(B类)在指定的时间内。提取总RNA并用DNase I处理。进行半定量序列特异性RT-PCR以评估星形NAT表达式。第19层mRNA表达作为负荷对照。显示了具有代表性的琼脂糖凝胶的图像。扩增产物的大小以bp表示。对于每个时间点星形NAT表达被量化并标准化为相应的第19层mRNA水平。图显示了星形NAT。数据表示为四个独立实验的平均±SD*对<0.05和**对<0.01与。非刺激细胞-RT，无逆转录酶RT-PCR对照-p、 无底漆的RT反应；pi、RT反应。
图6
图6。激素调节分析星形通过核糖核酸酶保护试验（RPA）检测NAT表达。
A类MA-10细胞与8Br-cAMP（1 mM）孵育指定时间。提取总RNA，然后用DNase I单链处理星形感觉和星形通过体外转录合成NAT RNA探针，并用[32P] UTP公司。示意图说明了所使用的核糖探针及其与相应转录物的互补性。B类.RPA同时使用两个探针进行：-星形RNA探针（Sense probe）与感观转录物编码区的566 bp互补-星形RNA探针（NAT探针1），与719 bp的星形NAT。显示有代表性的自动射线照片。阴性对照（tRNA（+）RNase）由酵母tRNA而非MA-10 RNA组成。tRNA（−）RNase对照由未经RNase处理的酵母tRNA组成，用于观察全长探针。C类。使用另一个星形合成的NAT探针（NAT探针2）与590 bp的星形与（B）中使用的探针不同的区域中的NAT序列。图中显示了具有代表性的放射自显影。D类图表显示了星形以任意单位表示的每个时间点的意义和NAT表达级别。数据表示为三个独立实验的平均±SD*对<0.05和**对<0.01与。非刺激细胞。
图7
图7。评估星形NAT过度表达水平星形RT-PCR检测转录本。
用pcDNA3.1（+）载体瞬时转染MA-10细胞，表达星形NAT（NAT）或空向量（模拟）作为控件。转染后24小时，用8Br-cAMP刺激细胞达到指定时间。提取总RNA并对其进行半定量RT-PCR星形进行感官记录。A类。示意图显示了针对鼠标内不同区域的三对引物星形这些实验中使用的mRNA。Sense 1引物靶向最长3.5kb mRNA的3′-UTR。Sense 2引物靶向2.8kb和3.5kb共有的区域星形mRNA。Sense 3引物以所有三个感官转录物共享的编码区为目标。AAUAA，聚腺苷酸化信号。B类图中显示了具有代表性的琼脂糖凝胶。箭头表示放大产物的大小，单位为bp。第19层mRNA表达作为负荷对照。C类.对于每个波段星形感官转录被量化并标准化为相应的第19层mRNA水平。图显示了星形感官记录。数据表示为三个独立实验的平均±SD。数据表示为三个独立实验的平均±SD*对<0.05, **对<0.01和***对<0.001与。模拟转染的细胞在相应的时间内受到刺激。
图8
图8。评估星形NAT过度表达水平星形通过Northern印迹分析的有义转录物。
用pcDNA3.1（+）载体瞬时转染MA-10细胞，表达星形NAT（NAT）或空向量（模拟）作为控件。转染后24小时，用8Br-cAMP刺激细胞达到指定时间。提取总RNA并进行northern印迹。A类图中显示了一个具有代表性的北方斑点。单链星形本试验使用了sense核糖探针。18S rRNA用作负荷对照。B类.对于每个带，每个带的表达水平的OD星形转录物被量化并归一化为相应的18S RNA水平。图表显示了星形感官记录。数据表示为三个独立实验的平均±SD*对<0.05和**对<0.01与。模拟转染细胞在相应时间内受到刺激。
图9
图9。的影响星形NAT在StAR蛋白水平和孕酮生成上的过度表达。
用pcDNA3.1（+）载体瞬时转染MA-10细胞，表达星形NAT（NAT）或空向量（模拟）作为控件。转染后24小时，用8Br-cAMP刺激细胞达到指定时间。从转染细胞中分离线粒体并进行western印迹。A类图中显示了一个具有代表性的western blot图像。用抗StAR和抗OxPhos复合物III核心2亚单位（III复合物）抗体依次印迹膜。显示了StAR蛋白表达的两个暴露时间。B类对于每个带，StAR蛋白表达水平的OD被量化并归一化为相应的III复合物蛋白。显示了StAR蛋白的相对水平。数据表示为三个独立实验的平均±SD。插入.0和1小时时间点的比例放大**P（P）<0.01与。模拟转染细胞在相应时间内受到刺激。C类用放射免疫分析法测定培养基中的孕酮浓度。结果显示为四个独立实验的平均±SD*对<0.05和***对<0.001与。模拟转染的细胞在相应的时间内受到刺激。
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