Defective peroxisomal catabolism of branched fatty acyl coenzyme A in mice lacking the sterol carrier protein-2/sterol carrier protein-x gene function

doi:10.1101/gad.12.8.1189

.1998年4月15日；12(8):1189-201.

doi:10.1101/gad.12.8.1189。

缺乏固醇载体蛋白-2/固醇载体蛋白质-x基因功能的小鼠支链脂肪酰辅酶A的过氧化物酶体分解代谢缺陷

U西多夫¹, M Raabe先生, P埃林豪斯, F Kannenberg公司, M福克, T恩格尔, S丹尼斯, F伤口, K W Wirtz公司, R J流浪者, N Maeda公司, G阿斯曼

附属公司

PMID： 9553048
预防性维修识别码：项目经理316706
内政部： 10.1101/gad.12.8.1189

缺乏固醇载体蛋白-2/固醇载体蛋白质-x基因功能的小鼠支链脂肪酰辅酶A的过氧化物酶体分解代谢缺陷

U西多夫等。基因开发. 1998.

.1998年4月15日；12(8):1189-201.

doi:10.1101/gad.12.8.1189。

作者

U西多夫¹, M Raabe公司, P埃林豪斯, F Kannenberg先生, M福克, T恩格尔, S丹尼斯, F伤口, K W Wirtz公司, R J流浪者, N Maeda公司, G阿斯曼

附属

¹威斯特法利安威廉大学动脉硬化研究所，D-48129 M-unster，德国。seedorf@ear002.uni-muenster.de

PMID： 9553048
预防性维修识别码：项目经理316706
内政部： 10.1101/gad.12.8.1189

摘要

采用小鼠基因打靶研究Scp2的未知功能，编码固醇载体蛋白-2（Scp2；过氧化物酶体脂质载体）和固醇载体蛋白质-x（SCPx；Scp2和过氧化物酶之间的融合蛋白）。SCP2和SCPx的完全缺乏与基因表达、过氧化物酶体增殖、低血脂、体重控制受损和神经病变的显著改变有关。伴随着这些异常，甲基支链脂肪酰基辅酶A的分解代谢受损。Scp2（-/-）小鼠体内四甲基支链脂肪酸植酸的累积量达到10倍时，缺陷变得明显。进一步的鉴定表明，该基因的破坏导致植酸基辅酶A导入过氧化物酶体的效率低下，并导致3-酮质醇辅酶A的硫裂解缺陷。这些结果与植酸-CoA与重组大鼠SCP2蛋白的高亲和力结合以及重组大鼠SCPx蛋白的高3-酮基-CoA硫酶活性相一致。

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数字

图1
靶向性破坏小鼠*Scp2系列*基因同源重组。(一个)的结构*Scp2系列*基因(顶部)，该位点的外显子14区域*Scp2系列*靶向载体，以及靶向*Scp2系列*同源重组后的位点(底部). 仅显示相关限制位点：（H3）欣dIII；（R1）生态RI；（R5）生态RV；（S）*斯佩。*这个*Sal公司*I位点（S1），如外显子14所示，在最初分离的基因组克隆中不存在，但通过定点突变引入，以便能够引入新基因盒（详见材料和方法）。这个新基因和*HSV-tk型*基因盒用方框表示。矢量pPNT的位置通过折弯线示意性地显示。该尺度由基因结构和外显子14区域上方的横线表示。相关探针的位置由打开的盒子标记。(B类)正确靶向ES细胞株消化ES细胞基因组DNA的Southern blot分析(*左侧，*克隆110）和亲本细胞系E14（对照），*正确的。*与探针I杂交后获得的正确靶向和原始等位基因的DNA片段大小（kb）显示在两侧。(C类)小鼠肝脏RNA的Northern blot分析。野生型（+/+）和*Scp2系列*使用（−/−）小鼠，并将其与标记的*Scp2系列*cDNA探针。四个正常人*Scp2系列*2700个核苷酸的转录物（scpx），主要的1500个核苷酸*SCP2号机组*转录本（scp2）和两个次要的交替多聚腺苷化转录本（scp2*，900核苷酸；scpx*，2200核苷酸）。纯合子样本*Scp2系列*（−/−）小鼠提供了～2550核苷酸（scpxko）转录物的低强度信号。作为加载相同样本的对照，用大鼠GADPH cDNA探针重新进行相同的Northern blot分析(底部). (D类)直接DNA测序*Scp2系列*（−/−）小鼠肝脏转录物。序列与翻译的氨基酸序列一起显示。正常的蛋白质序列是黑体字。由外显子13-15的直接连接引起的正常阅读框的移位由箭头指示。密码子数(左边)指正常小鼠SCP2和SCPx cDNA。（***）提前终止密码子的位置。(E类)小鼠肝脏蛋白质的Western blot分析。用针对重组大鼠SCP2、抗SCP2产生的多克隆抗体或针对SCPx的重组383个氨基酸的氨基末端肽（抗SCPx）产生的抗体开发印迹。箭头表示对应于SCP2（13.5 kD）、SCPx（60 kD）和44-kD硫酶样肽（44-kD-肽）的条带。（−/−）小鼠样品未获得特异性反应。

图2
过氧化物酶体增殖和β-氧化诱导*Scp2系列*（−/−）小鼠。(一个)肝切片二氨基联苯胺染色。条形图表示刻度(底部); 所选图像代表了每个菌株的五种动物。(B类)显示了过氧化氢酶、线粒体丁酰辅酶A脱氢酶（but-CoADH）、ACO和3-酮辛酰基辅酶A硫醇化酶/（SCPx-硫醇）的酶活性（单位/克湿重）。用针对蛋白质氨基端383氨基酸的抗体进行免疫沉淀后，测定SCPx硫酶的活性。这些列表示之间的比率*第2页*（−/−）样品和对照±标准差。; （***）配对t吨-测试；(*P（P）*) < 0.005之间。

图3
基因表达改变*Scp2系列*（−/−）小鼠。肝脏RNA的Northern印迹与来自PEPCK、ACO、L-FABP、CYP7α、CYP27α、pTHIOL和mTHIOL的探针杂交。作为相同样品装载量的对照，用大鼠GADPH cDNA探针重制Northern印迹。所选图像代表了每个菌株中至少五只动物。相对信号强度通过激光密度计进行评估，并在文中给出。

图4
植物酸水平和肝脏过氧化氢酶活性*Scp2系列*（−/−）小鼠(▪) 和控件（•）。给6至8周龄雄性小鼠喂食添加了2.5 mg/g植物醇的标准日粮4天，然后喂食不添加植物醇的常规日粮。血清中植酸浓度(n个 = 3）以μmoles/l为单位(顶部); 测定肝脏中过氧化氢酶的活性，并用任意单位/克湿重表示(底部).

图5
植物醇分解代谢缺陷*Scp2系列*（−/−）小鼠。(一个)TOF-SIMS分析法检测肝脏中植酸及其分解代谢产物。(顶部)植酸酶标准品的质谱（1 pg）。该化合物在311.5亩土地上被检测为负离子，代表[M-H⁺]⁻离子。(中部)脂质提取物是从*Scp2系列*（−/−）小鼠，并使用与标准相同的条件进行TOF-SIMS分析。箭头指向植酸（311.5亩），以及Δ2,3-肉豆蔻酸（295.5亩）、原始酸（297.5亩）和3-羟基-正戊酸（313.5亩）的预期信号。还标记了18个碳原子直链脂肪酸C18:0、C18:1和C18:2的信号。(底部)对来自*Scp2系列*（+/+）鼠标。这些图像代表了每种基因型和两性的五只小鼠。(B类)监测与硫酶介导的3-酮质子碱-CoA裂解预测产物相对应的离子（255.5 mu，TMTDA；253.5 mu，Δ2,3-TMTDA）。(C类)基于每种品系和性别的五只小鼠对信号强度进行定量评估。这些列表示（−/−）小鼠或对照组之间折叠差异的平均值；±s.e.m.公司。黑色条（−/−）；阴影条（+/+）。

图6
植酸CoA羟化酶在*Scp2系列*（−/−）小鼠。肝脏RNA的Northern印迹与标记的*PYHH公司*cDNA探针(一个). 重组大鼠SCP2的特异性植酸-CoA结合活性(B类). 列表示1的平均值/*K（K）*_d日 ± 标准差。五项独立决定。

图7
中的表型异常*第2页*（−/−）小鼠在饮食中添加植物醇后。(一个)6至8周龄雄性小鼠(n个 = 每组5只），喂食标准日粮（对照组）或添加2.5或5毫克/克植物醇的相同日粮，持续6周。体重(顶部)和食物摄入(*底部，*每天监测4天内摄入的食物克数）。在体重下降最大的前4天获得结果。什么时候？*Scp2系列*（−/−）小鼠被喂食含有5毫克/克植物醇的饮食，它们继续活动身体，直到达到接近其初始体重的60%。在第三周，他们出现了神经病变，减少了食物摄入量，最终死亡。(B类)六个实验组的血清甘油三酯浓度。这些列表示方法 ± 标准差。(C类)腹部组织（+/+）(左边)和（−/−）小鼠(*正确的*)在5毫克/克植物醇饮食10天后。注意肾脏的正常外观，但肾上腺的增生和深色结构。此外，几乎没有任何脂肪组织，这在（+/+）小鼠中很明显，在（−/−）小鼠中也很明显。这些异常是在食物摄入量没有显著减少的情况下发生的。

图8
哺乳动物植物醇代谢示意图。植酸（3,7,11,15-四甲基十六酸）要么直接来自饮食，要么来自饮食中植物醇的氧化。请注意，植酸在进入过氧化物酶体β-氧化之前必须脱羧成为质控酸，因为β-碳原子被3-甲基阻断。假定的α-氧化中间体是2-OH-植物酰基-CoA和普里斯塔纳尔，但确切的辅因子要求目前尚不清楚。烯醇-CoA水合酶/3-OH-酰基-CoA脱氢酶：过氧化物酶体双功能酶（PBE）。

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1. Zilversmit DB B区。能够转移磷脂酰乙醇胺的大鼠肝脏蛋白质。其他磷脂和胆固醇的纯化和转移活性。生物化学杂志。1977;252:1613–1619.-公共医学
1. Bult CJ、White O、Olsen GJ、Zhou L、Fleischmann RD、Sutton GG、Blake JA、Fitzgerald LM、Clayton RA、Gocayne JD、Kerlavage AR、Dougherty BA、Tomb JF、Adams MD、Reich CI、Overbeek R、Kirkness EF、Weinstock KG、Merrick JM、Glodek A、Scott JL、Geoghagen NSM、Weidman JF、Fuhrmann JL、Venter JC等。产甲烷古菌jannaschii的完整基因组序列。科学。1996;273:1058–1073.-公共医学
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1. Chanderbhan R、Noland BJ、Scallen TJ、Vahouny GV。类固醇载体蛋白-2将胆固醇从肾上腺脂滴输送到线粒体以合成孕烯醇酮。生物化学杂志。1982;257:8928–8934.-公共医学

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[1] Baum CL、Reschly EJ、Gayen AK、Groh ME、Schadick K.甾醇载体蛋白-2过度表达可增强固醇循环并抑制胆固醇酯合成和高密度脂蛋白胆固醇分泌。生物化学杂志。1997;272:6490–6498.-公共医学

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[10] Chanderbhan R、Noland BJ、Scallen TJ、Vahouny GV。类固醇载体蛋白-2将胆固醇从肾上腺脂滴输送到线粒体以合成孕烯醇酮。生物化学杂志。1982;257:8928–8934.-公共医学

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