核心集群的LEM2阶段分离后期,当NE包围染色质盘时,LEM2集中在纺锤体微管近端的NE核心。这与非核心标记Lamin B2的定位模式和LEM2在间期在NE周围的均匀分布形成对比(,)18,19为了确定LEM2如何在核心内聚集,我们使用活细胞成像监测突变的LEM2-mChr结构以及GFP-微管蛋白。因为,正如预期的那样,我们发现LEM2的LEM域与BAF具有很高的亲和力(–),我们测试了在LEM结构域(LEM2)中含有四个氨基酸取代的LEM2结构21米)禁用BAF绑定20这种突变足以破坏NE内LEM2的积累和后期细胞中随后的核心富集,这与BAF作为早期NE重组因子和核心区组成部分的作用一致5(). 意外地,移除了相邻的低复杂度域(LCD)(LEM2ΔLCD; ΔAA:43–202)也损害了东北富集度,尽管存在完整的LEM域,这表明LEM域和LCD对于正确定位来说都是必要的,但都不足够(). 相比之下,LEM2的C末端WH域(LEM2)中的大量缺失ΔWH; ΔAA:415–485)不影响LEM2核心定位().
LEM2在后期染色质盘靶向NE核依赖于BAF结合和能够形成液滴的LCD。一上图,LEM2序列主题和细胞定位的卡通。跨膜(TM)。GFP-tubulin与LEM2-mChr构建物的底部活细胞成像。时间0是完全解理沟进入(CFI)的时间。代表3个生物复制的结果,但ΔLCD图像代表2个生物复制。b条、光漂白后的部分和整个液滴荧光恢复(FRAP)。的平均+/-标准偏差(SD)n个=3个独立样本。c(c)、LEM2实时荧光成像NTD公司-液滴熔化。代表2个独立实验的图像。d日,纯化LEM2的浓度依赖于液滴形成NTD公司三个独立实验的代表。e(电子)、顶部,LEM2示意指示位置NTD公司两个结构体(Mim1,Mim2)中的拟磷酸突变。底部,LEM2免疫印迹评估荧光标记SDS-PAGE分离后全长LEM2-mChr的迁移模式;如图所示,用lambda磷酸酶(λ-PP)处理的裂解物。代表2个生物复制,每个生物复制1个和3个技术复制。有关免疫印迹源数据,请参见补充图1右,纯化LEM2的荧光成像NTD公司-磷酸化结构体(Mim1,Mim2)。代表2个技术复制品的图像。刻度2μm(a-e公司).
液晶显示器的相分离或生物分子凝聚物的形成是一种通过创建无膜、生物化学专用隔间来组织动态过程的机制21–23为了表征LEM2液晶在核心定位中的特性和作用,我们纯化了LEM2的N末端结构域(NTD),其中包含LEM和LCD结构域(LEM2NTD公司; AA:1–208)。LCD以其基本序列(pI=11.8)而著名,这是因为精氨酸(R)、脯氨酸(P)和其他残基的过度表达(). 纯化后,我们观察到LEM2NTD公司在生理条件下自发形成具有液体性质的球形液滴。这些LEM2NTD公司液滴可以在秒的时间尺度上进行完全融合以及液滴间和液滴内扩散(–,补充视频1).
接下来,我们试图解决细胞是否以及如何利用LEM2在哺乳动物开放性有丝分裂中的相分离能力。磷酸化调节细胞周期和相变24,25,LEM2在其LCD中有几个带注释的磷点26为了测试LEM2的磷酸化是否可能是一种调节机制,我们将G1/S细胞与有丝分裂细胞进行对比,并探讨LEM2磷酸化状态。正如预期的那样,我们发现与G1/S相比,LEM2-mChr在有丝分裂中表现出强烈的磷酸化,与磷酸酶处理可逆().
LCD的两个亚区缺失的构建体,每个亚区都含有注释的磷酸位点(一个富含SY和一个富含PR的区域,LEM2ΔSY-mChrΔAA:75–123和LEM2Δ压力-mChrΔAA:145–213),显示较少的磷酸-LEM2物种,表明有丝分裂磷酸位点位于这些亚序列中(). 重要的是,跨越任一亚区的拟磷酸突变阻止了纯化的LEM2NTD公司在生理状态附近形成水滴()-表明细胞周期依赖性磷酸化控制LEM2的浓缩能力。值得注意的是,来自富含SY序列的合成肽也相分离,尽管其浓度明显高于LCD(). 最后,与DNA和RNA等多阴离子的复合凝聚也促进了LEM2的单分散NTD公司浓缩成球形液滴,这是与其他富含PR的蛋白质共有的特性27(). 因此,LEM2的LCD可促进细胞内后期核心冷凝,并在体外表现出自发液相分离和复杂凝聚特性。
LEM2在MT上形成类似液体的涂层
免疫染色HeLa细胞的超分辨率STED成像显示,内源性LEM2在染色质表面纺锤形MT周围特异性地富集为环状(,). 为了探讨LEM2是否直接与MT结合,我们在体外测试了与荧光标记蛋白的结合,并观察到洗涤剂溶解的全长LEM2(LEM2佛罗里达州)生理条件下稳定和捆绑的MT(). 重组成蛋白脂质体后,膜包埋LEM2佛罗里达州保留MT稳定和捆绑活动(). 最后,我们发现分离的LEM2NTD公司足以捆绑MT(–;–). 我们用光散射定量了MT-结合,并用负染电子显微镜(EM)证实了该分析。LEM2级NTD公司,包含LCD,以浓度相关和可饱和的方式捆绑MT,具有一半最大散射浓度或K显然的值,1.3μM(,). EM显示,LEM2结合的MT失去了特有的微管蛋白晶格精细结构,明显被非晶态LEM2涂层遮挡(). 此外,LEM2NTD公司加入GTP和MgCl后,液滴可以与未聚合的微管蛋白形成凝聚,并形成MT-束2(). 这些数据表明,LEM2的LCD直接结合MT,导致体外捆绑。
LEM2集中在纺锤形MT周围,其LCD在微管周围形成类似液体的涂层。一后期内源性LEM2的STED成像。刻度150 nm。代表来自4个单元格的数据。b条、全长LEM2(LEM2)的荧光成像佛罗里达州)和MTs.代表2个技术副本。LEM2的荧光成像NTD公司和MTs.代表10个技术复制品。c(c)LEM2的FRAP分析佛罗里达州-和LEM2NTD公司-涂层MT束。绘制的数据为平均+/-SEMn个=5个独立样本(LEM2佛罗里达州)或n个=17个独立样本(LEM2NTD公司).d日LEM2的FRAP分析NTD公司-涂层MT束。代表2个独立示例的图像。e(电子),MT单独或与纯化LEM2指示部分的电子显微照片。LEM2-PR型A类AA:145–165,LEM2-PRB类AA:188-213。代表3个技术复制品。刻度25 nm。(f)顶部,LEM2的架构示意图,突出了SY和PR丰富的地区。显示的LEM2-mChr缺失结构和GFP-tubulin的底部活细胞成像。时间0表示完成CFI的时间。3个生物复制品的代表。刻度2μm(b、 d、f).
考虑到LEM2液晶的液相分离和复合凝聚特性,我们探索了MT-bound LEM2在体外的状态。使用视频荧光显微镜,我们观察到LEM2佛罗里达州和LEM2NTD公司动态结合MT束,在光漂白后以相似的速率恢复荧光,而微管晶格中的微管蛋白没有恢复(,). 值得注意的是,LEM2的光漂白区域NTD公司MT束通过同轴流或液相梯度恢复荧光,而不是以均匀的恢复模式穿过漂白区。(,和补充视频2). 因此,LEM2的LCD以类液相的方式将MT包裹起来。
我们进一步鉴定了PR富集区内的两个肽,它们足以在体外诱导MT捆绑(,–). 在体内,一个LEM2缺失突变体跨越了这个富含Pro和Arg的序列,LEM2Δ压力-与LEM2相比,mChr最初针对的是新生的NEΔSY-mChr未能在含MT核心富集(,). 因此,该区域的直接MT-binding是后期核心放大LEM2冷凝所必需的。最后,与磷调节一致,跨越MT相互作用的PR-丰富基序及其侧翼区域的磷模拟突变在体外破坏了MT捆绑(,).
用于早期NE密封的分子O型环根据LEM2(LEM2)的WH结构域之间的直接结合预测白色; AA:395–503)和CHMP74,LEM2ΔWH-mChr无法向NE招募GFP-CHMP7(). 此外,内源性LEM2缺失后,siRNA-resistance LEM2过度表达ΔWH-mChr未能挽救IST1的募集,IST1是LEM2和CHMP7下游的一种ESCRT-III蛋白,是募集纺锤体MT-覆盖酶SPASTIN所必需的()2siRNA-resistant LEM2-mChr的过度表达导致内源性IST1过早地向新生的NE募集并增强()-表明LEM2引导CHMP7-依赖性ESCRT激活的空间和时间模式。
LEM2与CHMP7共同组装,形成一个便于早期核密封的O型环。一GFP-CHMP7和LEM2-mChr与LEM2的活细胞成像ΔWH-mChr(左)。通过4个生物复制品(LEM2-mChr:n个=14;LEM2级ΔWH-百万立方英尺:n个=12). 绘制的数据是通过双尾非配对t检验确定的平均+/-SD和p值。b条,顶部,CHMP7域示意图。所示部件的底部EM。代表3个技术复制品。c(c),XL-MS。BS3交联富集超过4倍,映射到一级结构:单体CHMP7(红色)或LEM2白色-CHMP7聚合物(蓝色)。MB,膜结合。d日左,全长CHMP聚合环EM,5个技术复制品的图像代表,聚合CHMP7的2D级平均值。对,聚合物CHMP7的同源模型。e(电子),LEM2介导的CHMP7激活动画。(f),左:用siRNA处理并表达LEM2-mChr的细胞中NLS-3GFP定位的代表性图像。DNA标记为NucBlue。时间0表示完成CFI的时间。右:整个后期核/细胞质NLS-3GFP的平均比率。绘制的数据是至少3个生物重复的平均+/-SD(siCon LEM2-LEM2-mChr:n个=26; siLEM2–2 LEM2-mChr:n个=44; 单LEM2–2 LEM2Δ压力-百万立方英尺:n个=20; 单LEM2–2 LEM2ΔWH-百万立方英尺:n个=16个单元格)。在每个时间点通过双尾非配对t检验确定的P值,将全长与每个突变结构进行比较*P(P)< 0.05; **P(P)< 0.005. 没有多重比较。精确的p值.克指示组件的EM。刻度25 nm。代表2个技术复制品。小时,型号:LEM2-CHMP7高分子O型圈。
用LEM2培养单体全长CHMP7白色,但不适用于LEM2NTD公司,触发了内径为50至100纳米的环状蛋白质聚合物的组装(;). 探讨LEM2对CHMP7自身抑制和释放的机制白色,我们使用定量交联质谱(XL-MS),同位素区分单体和LEM2白色-诱导聚合物(,补充表1). 我们鉴定了24个单体CHMP7特有的交联。杂交肽图谱显示CHMP7的N端和C端区域折叠在一起,使CHMP7 ESCRT-III结构域的α1-α3螺旋与其N端WH结构域接近(,,补充表2). 单分散CHMP7样品中的这些相互作用在LEM2中显著减少或缺失白色-诱导CHMP7聚合物(,补充表1,2)与EM观察到的开放聚合状态的构象变化一致(). 总的来说,LEM2中富集了19个交联白色-诱导聚合物样品,映射到LEM2之间的相互作用白色CHMP7的α1-α3螺旋。相邻CHMP7分子N端胺之间以及相邻LEM2之间的聚合物特异性交联白色亚基与这两种蛋白质的共聚作用一致(,). 以1:1的化学计量比验证XL-MS、CHMP7和LEM2WH共颗粒,并突变CHMP7α1–3螺旋内杂交肽建议的保守残基,从而削弱LEM2白色-CHMP7共聚合(–).
模型膜也足以引发全长CHMP7的聚合(). 膜诱导CHMP7聚合物的二维排列和图像平均显示出一个重复单元,该单元由一个连续的聚合物链组成,链上布满重复的垂直尖峰(,). 该聚合物的周期尺寸与“开放”人类CHMP1B和酵母Snf7的同源结构相匹配,表明这些结构包含一个ESCRT-III纤维,其上装饰有突出的ESCRT-II样串联WH-结构域28–30(,,,,,). 与该模型一致,截断的CHMP7片段仅包含ESCRT-III域(CHMP7ESCRT-III公司; AA:229–453)在纯化过程中自发聚合成没有垂直尖峰的环,但具有其他类似尺寸(). CHMP7的自发聚合ESCRT-III公司进一步支持CHMP7的N端WH域的自动禁用功能。总之,我们发现LEM2的WH结构域通过结构域重定位机制激活了自身抑制的CHMP7单体,这触发了它们的组装。
为了研究LEM2-CHMP7伙伴关系在纺锤体-染色质界面上的作用,我们在进口货物(NLS-3GFP)旁边表达了LEM2缺失突变体,以评估后期的核分隔。在LEM2核心定位后不久,表达siRNA-resistant LEM2-mChr的细胞在重整细胞核中首次可测量到NLS-3GFP的富集,此时纺锤体MT仍然存在封闭核膜的屏障(,,,,). 表达LEM2的细胞ΔSY-mChr通常集中在堆芯内,在分区中显示出轻微缺陷(,,). 相比之下,LEM2的表达Δ压力-mChr未能在堆芯内集中,大大减弱了NLS-3GFP的积累,这表明LEM2在纺锤MT周围特别浓缩的能力很重要(,,,). 最后,LEM2的表达ΔWH-mChr还显著损害了NLS-3GFP的及时积累,表明WH结构域在划分中起着关键作用,可能是因为它能够招募CHMP7和随后的ESCRT通路蛋白(,,,,). 因此,LEM2或CHMP7的耗竭在较长时间内损害了核分隔,在完全解理沟进入后,缺陷至少持续30分钟().
siRNA-介导的LEM2过度缺失会导致核畸形,最终导致死亡19为了确定核形态缺陷是否是由有丝分裂退出过程中的错误引起的,我们在LEM2耗竭后同步了细胞,并对其从晚期到晚期的进展进行了成像。当LEM2-depleted细胞发展到晚期,没有明显的核缺陷时,在后期开始出现强大的核和微管形态表型,并持续到末期(,补充视频3). LEM2缺失细胞的正交视图显示,异常MT束在NE排列的通道内穿过细胞核(). LEM2缺失的末期U2OS细胞DNA损伤的出现强调了这些核完整性表型的重要性().
最后,为了验证LEM2的LCD和WH活性与CHMP7协同围绕纺锤体MT进行自组装的中心假设,我们设计了一个简化的LEM2结构,该结构包含LEM2通过柔性连接子LEM2连接的泛型外结构域NTD-链接-WH.LEM2级NTD连接蛋白-WH触发CHMP7共聚反应,可以看到生成的环在小MT束上和周围循环(,). 一贯地,并强调其功能协调的重要性,破坏LEM2的MT相互作用或CHMP7结合域导致细胞持续的间期核形态表型(–).
我们的结果得出以下模型:LEM2通过直接MT结合在NE核内浓缩,其液晶冷凝成液相,润湿纺锤MT的表面。LEM2的WH结构域和CHMP7随后共聚,完成大分子“O形圈”的形成在新核质和细胞质之间建立临时屏障的密封,然后触发纺锤体完全解体和膜融合(,补充讨论).
方法
细胞骨架蛋白
猪脑微管蛋白试剂购自Cytosketon,Inc.,包括未聚合的微管蛋白(T238P)、未聚合的、HiLyte-647标记的微管毒素(TL670M)和预先形成的微管(MT002)。
他的净化6-SUMO标记蛋白
本研究中除全长LEM2外的所有纯化蛋白均在BL21-(DE3)-RIPL中的pCA528载体(WISP08-174;DNASU质粒库)中表达大肠杆菌使用N末端His的细胞6-如前所述的SUMO关联标记4全长LEM2在C43(DE3)的pCA528载体中表达大肠杆菌使用N末端His的细胞6-SUMO关联标记。所有质粒均列于补充表3表达培养物(3-4升)在含有卡那霉素的富含ZY-5052的自诱导培养基中生长,在37°C下摇晃(220 rpm)3小时,然后在19°C下过夜。通过离心法收集细胞。
LEM2蛋白的纯化
源自人类LEMD2蛋白(Uniprot ID{“type”:“entrez protein”,“attrs”:{“text”:“Q8NC56”,“term_id”:“74751184”,“term_text”:“Q8NC56”}Q8NC56问题),包括LEM21–72,LEM2级NTD(1–208),第2列Mim1(S82D、S90D、S96D、Y98D、T100D、Y104D),LEM2级Mim2(Y122D、S134D、S138D、S139D、T147D、S166D、S174D、S175D),LEM2WH(395–503)和LEM2NTD(1–208)-链接-WH(395–503)(连接子序列SAAGTGAGSGSAAS),纯化如下。将收集的细胞重新悬浮在含有5%甘油、10 mM咪唑、pH 8.0、2μg/mL DNase1、溶菌酶和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(每克细胞颗粒5 mL)中,并对每个LEM2蛋白结构分别优化HEPES和KCl浓度(20 mM HEPES、pH 7.0、500 mM KCl用于LEM21–72和LEM2NTD-链接-WH和40 mM HEPES,pH 8.0,LEM2为350 mM KCl白色,LEM2米1和LEM2百万平方米). 细胞在冰上超声溶解,并澄清(10000g,30min,4°C)。澄清的裂解液用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)孵育(4 mL床体积,1.5 h,4°C),用裂解缓冲液广泛洗涤,用5个柱体积的裂解缓冲液(补充350 mM咪唑,pH 8.0)洗脱蛋白质。将洗脱液自旋浓缩(Vivaspin 20,3KDa MWCO,PES)至5 mL,并在4°C下通宵透析至存储缓冲液(20–40 mM HEPES,pH 7.0–8.0,5%甘油)中,每个构建物的KCl浓度单独优化(LEM2为300 mM1–72,LEM2为500 mMNTD-链接-WH,LEM2为350 mM白色和LEM2米1,110 mM用于LEM2百万平方米). 他的6-SUMO标签被与他的6-透析期间的Ulp1蛋白酶。在储存缓冲液中使用Superdex 75 16/60柱(GE Life Sciences)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化LEM2蛋白,并合并含有LEM2的级分,旋转浓缩(Vivaspin 6 3KDa MWCO,PES),并等分。
LEM2级NTD公司进行了类似的提纯,包括额外的制备相分离步骤。除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。将采集的细胞重新悬浮在裂解缓冲液中(30 mM HEPES,pH 7.4,500 mM KCl,5%甘油,10 mM咪唑,pH 8.0,2μg/mL DNase1,溶菌酶和蛋白酶抑制剂),并通过超声波和冰上间歇冷却进行裂解。通过离心(10000g,30 min)澄清裂解液,用Ni-NTA琼脂糖树脂培养(4 mL床体积,1.5 h,室温),并用裂解缓冲液广泛洗涤。用补充有350mM咪唑的裂解缓冲液(pH 8.0)洗脱蛋白质。诱导液滴形成,以富集His6-SUMO-LEM2系列NTD公司:用冰镇缓冲液(40 mM HEPES,pH 7.4,5%甘油)稀释咪唑洗脱液,使KCl浓度降至50 mM。在冰上培养20 min后,通过离心(10000g,10 min,0°C)将蛋白滴制成颗粒,用2个柱体积的冰镇低盐缓冲液(40mM HEPE,pH 7.4,50mM KCl,5%丙三醇)洗涤,并再次造粒。将颗粒重新悬浮在5 mL高盐缓冲液中(40 mM HEPES,pH 7.4,500 mM KCl,5%甘油),以溶解蛋白质滴用于其余纯化步骤,并与His培养6-Ulp1蛋白酶(2小时)。用Ni-NTA树脂培养混合物(2 mL,1 h)。在4°C的高盐缓冲液中使用Superdex 75 16/60柱,通过尺寸排除色谱进一步纯化含自旋的流通蛋白。将混合的、含自旋浓度的、含LEM2的组分透析过夜至存储缓冲液(40 mM HEPES,pH 7.4,350 mM KCl,5%甘油)中,并进行自旋浓度和校准。
浓缩蛋白等分样品在液氮中进行snap冷冻,并储存在−80°C下,以备将来的实验。等分样品解冻后只使用一次。最终蛋白质浓度为260μM LEM21–72,~110μM LEM2NTD公司,30μM LEM2NTD-链接-WH,14μM LEM2白色和190μM His6-SUMO-LEM2系列白色,100μM LEM2米1和110μM LEM2百万平方米注意LEM2的浓度白色没有标签是有限的,LEM2白色和他的更稳定6-SUMO标签。
人类,全长LEM2(LEM2佛罗里达州)纯化如下。将收集的细胞(6升表达培养物)重新悬浮在含有25mM HEPES、pH 7.4、500mM KCl、1mM DTT、5%甘油、溶菌酶、2μg/mL DNase1和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(5mL/g细胞颗粒)中。细胞在冰上超声溶解并澄清(10000g,30min,4°C)。通过超速离心(100000g,1小时,4°C)从澄清的裂解物中收集膜。LEM2级佛罗里达州用1%(w/v)n-十二烷基-B-D-麦芽吡喃糖苷(DDM,Anatrace D310)搅拌(1小时,4°C)从膜中提取,并在离心(35000克,30分钟,4°C)后收集在上清液中。用10mM咪唑补充DDM提取的上清液,并用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)培养(4 mL床体积,1小时,4°C),用含有0.1%DDM的裂解缓冲液广泛洗涤,用含有0.1%DDM的5柱体积裂解缓冲液洗脱蛋白质,并补充500mM咪唑,pH 8.0。LEM2级佛罗里达州-将富洗脱馏分混合,并在4°C下透析过夜,以除去咪唑。他的6-SUMO标签被与他的6-Ulp1蛋白酶(30分钟,室温)并通过反向Ni-NTA色谱去除。开裂的DDM-可溶性LEM2佛罗里达州使用非浓缩或自旋柱浓缩(Vivaspin20,100kDa MWCO,PES),无需冻融。
CHMP7蛋白的纯化
全长人CHMP7(Uniprot ID)的纯化程序{“类型”:“entrez-protein”,“属性”:{“文本”:“Q8WUX9”,“term_id”:“73917782”,“term_text”:“QUOX9”}}问题8WUX9)和点突变型CHMP7R270E+I312E,CHMP7R270E+V339D和CHMP7I312E+V339D改编自之前发布的净化4.截断CHMP7ESCRT-III(229–453)纯化如下。将采集的细胞重新悬浮在每克细胞颗粒的5 mL冰冷裂解缓冲液中(40 mM HEPES,pH 8.0,800 mM KCl,5%甘油,10 mM咪唑,2μg/mL DNase1,5 mM BME,蛋白酶抑制剂和溶菌酶)。细胞在冰上通过超声波溶解,并澄清(10000g,30min,室温)。澄清CHMP7ESCRT-III公司裂解液与Ni-NTA琼脂糖树脂孵育,自发形成由蛋白质聚合成环状组成的凝胶,并用阴性染色EM进行分析6-相扑7ESCRT-III公司环用咪唑(350 mM)洗脱,洗脱液以低速旋转(1000 g)作为凝胶相收集在树脂顶部。挖出凝胶,用缓冲液(40mM HEPES,pH 8.0,800mM KCl,5%甘油,1mM DTT)洗涤三次,每次通过离心(5000g)收集聚合物。他的6-SUMO标签被与他的6-Ulp1蛋白酶(2小时,4°C)。劈开的CHMP7ESCRT-III公司用缓冲液清洗三次,每次离心收集,溶解His6-SUMO和他的6-Ulp1被丢弃在含水上清液中。用缓冲液稀释分离洗脱液,使最终蛋白质浓度达到~60μM。
分析尺寸排除色谱法
第2列1–72用凝胶过滤色谱法测定与BAF或BAF-dsDNA复合物的结合。如前所述制备DNA双链32.纯化LEM2的组合1–72BAF二聚体和DNA双体以1:1:2摩尔比结合。在室温下培养30分钟后,将50μL反应混合物应用于Superose 6 3.2/300色谱柱(GE Life Sciences)中,缓冲液(20 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl,5 mM DTT和10%甘油)在4°C下平衡。所有实验的流速均为40μL/min。记录280 nm(A280)处主要吸收峰的保留体积。用SDS-PAGE分析各峰组分的蛋白质含量。
LEM2低复杂性结构域肽
含N-末端FITC-Ahx修饰的化学合成肽()从GenScript(新泽西州皮斯卡塔韦市)购买,肽储备溶液以毫微克H2O制备,LEM2除外75–122储存在DMSO中。LEM2的相分离75–122通过在毫夸脱H2O或缓冲液(25 mM HEPES,pH 7.4,150 mM KCl)中稀释至0.2 mg/mL储备液诱导。
浊度测定法
通过浊度(340 nm处的吸光度)(Tecan Spark 10M分光光度计)对LEM2的微管捆绑进行量化33.纯化LEM2的反应(总体积10μL)(1-72、NTD、WH、Mim1或Mim2)蛋白质或化学合成的LEM2肽、聚合成MT的1μMαβ-管蛋白异二聚体、KCl(LEM2蛋白质反应为75 mM,LEM2肽类反应为0.9 mM)、25 mM HEPES、pH 7.4、0.5 mM MgCl2,10μM紫杉醇(Sigma-Aldrich),在室温下在384孔非结合板中制备(Grendier Bio-One,#781906)。在每次读取之前摇晃三次,测量反应的浊度,并平均每种条件下的浊度。将LEM2蛋白/肽与微管反应的浊度值校正为单独LEM2蛋白/肽的浊度,归一化为单独微管的浊度,并对照[LEM2]绘制(浊度a.u.)。使用GraphPad Prism软件计算了乙状曲线拟合和LEM2半最大浓度。LEM2的浊度米1和LEM2百万平方米标准化为饱和浊度值等于1.0,以便在图中比较半最大值。浊度数据通过互补负染色电子显微镜得到证实。未对肽LEM2进行浊度测定75–122(LEM2SY公司)或LEM2145–165(LEM2-PRA类)因为这些肽在没有MT的情况下已经浑浊。
荧光成像中的蛋白质标记
使用Thermo Scientific公司的微型蛋白质标签试剂盒对蛋白质进行荧光标记,以用于显微镜检查:Alexa Fluor™488(A30006)、Alexa Fluor™555(A30007)和Alexa Fluor™647(A30009)。在成像实验中,未标记的蛋白质补充了少量荧光标记的蛋白质。LEM2级NTD公司含有单个赖氨酸残基,无法用伯胺反应探针有效标记。相反,他的6-SUMO-LEM2系列NTD公司用Alexa-488™标记以进行荧光显微镜检查,并用少量补充未标记LEM2的指示浓度NTD公司用于成像。
荧光显微镜相分离、凝聚和微管捆绑分析
在384孔板(Greiner Bio-One#7781892)中,用旋转圆盘共焦显微镜对荧光标记蛋白进行相分离、凝聚和MT-结合分析。共焦显微镜的反应在试管中制备,并转移到平板上进行成像。LEM2级NTD公司,LEM2米1,LEM2百万平方米和LEM275–122在成像之前,让液滴沉淀15分钟。LEM2级NTD公司将盐浓度降至150 mM KCl,保持其他缓冲成分的浓度不变,从而在室温下诱导液滴形成;在成像前60分钟,允许液滴生长。第2列NTD公司液滴(8至24μM)或洗涤剂固溶LEM2佛罗里达州通过添加荧光标记的MT(1μMαβ-管蛋白聚合成MT)测试(8μM)与MT的结合。按照Cytosketon,Inc.方案,在G-PEM缓冲液(Cytosclear Inc.BST01)中以1:7 HiLyte647-Tubulin:未标记Tubulin的摩尔比制备MT。未聚合微管蛋白,1:7标记:未标记摩尔比,Alexa555标记LEM2白色检测与LEM2的相关性NTD公司每个液滴的浓度为8μM。注意,在缺乏稳定蛋白的情况下,150 mM KCl促进MT解聚。测定凝聚形成,LEM2NTD公司降低LEM2的盐浓度后,直接对(8μM)进行荧光成像NTD公司单独或存在1μM未聚合的αβ-管蛋白、30碱基RNA(5'-GGGCCUCCCCCCCAGGGGGCGCCCGGCCCCCC-3')或50碱基DNA(5'-AATGTGTGGGCCTGCTCGGGTGCGCGCGCCCGTGGATCGCGCCCTTGGATTGC-3’)。
具有光漂白后荧光恢复的旋转盘共聚焦显微镜(FRAP)
测定LEM2NTD公司FRAP和熔滴融合实验中的熔滴动力学,根据已发布的协议,使用聚乙二醇硅烷(LAYSAN BIO,MPEG-SIL-5000)对384孔玻璃底板进行聚乙二醇化,然后用BSA钝化,以防止熔滴与二氧化硅表面结合34在配备Rapp光电UGA-40(Rapp Optoelectronic)的尼康Eclipse Ti显微镜(尼康仪器公司)上,使用带有Borealis升级(Andor)和ILE激光发射(激光线405nm、488nm、561nm、647nm;Andor)的W1-CSU进行了带有FRAP的旋转盘共焦显微镜光漂白装置,使用MicroManager 2.0beta(Open Imaging)操作。使用Andor Zyla 4.2 cMOS相机(牛津仪器公司)采集荧光图像。使用CFI Plan Apochro VC 100X Oil NA 1.4物镜(尼康仪器公司)对样品进行成像。激发波长为:Alex488TM或FITC为488nm;Alex555TM为561 nm;Alex-647为640 nm。FRAP实验用473nm激光(Vortran)进行光漂白,每次漂白200 ms。以1 Hz的频率记录图像,从至少一张漂白前(包括漂白事件)和240 s漂白后的图像开始。用ImageJ计算每个时间点漂白感兴趣区域内的强度与背景的比值,并将其归一化为漂白时的强度。复制品与漂白时间对齐,平均并绘制±标准偏差。
负染电子显微镜
对连续碳格栅(200–400目铜,Quantifoil)进行辉光放电(PELCO EasiGlow,15 mA,0.39 mBar,30 s)。如前所述,用0.75%甲酸铀酰对样品(3-5μL)进行染色29使用Tecnai T12显微镜(美国希尔斯堡FEI公司)收集图像,该显微镜采用LaB6灯丝,工作电压为120 kV,使用Gatan Ultrascan CCD相机(美国普莱森顿Gatan公司)采集数据。对于MT-结合分析,在网格上制备反应并培养2分钟。在预先形成的MTs中使用浓度为1μMαβ-管蛋白的MTs。使用MTs对LEM2构建物进行成像(),浓度如下:6μM LEM2佛罗里达州,4μM LEM2NTD公司,200μM LEM2145–165(LEM2-PRA类),80μM LEM2188–212(LEM2-PRB类). MT与LEM2的反应NTD公司或LEM2188–212,以证实比浊法,按上述方法制备。拟磷酸结构体,LEM2Mim1型和LEM2百万平方米,在8μM下进行了MT-结合测试。
LEM2诱导的CHMP7聚合
LEM2和CHMP7蛋白以4-8μM的浓度混合,总体积为50μL。第2列白色或LEM2NTD-Linker-WH公司除非另有说明,否则CHMP7蛋白存在两倍摩尔过量。将缓冲液调节至600至800 mM KCl之间。使用Slide-A-Lyzer MINI透析设备10K MWCO(Thermo Fisher Scientific)将反应透析至低盐缓冲液(30 mM HEPES,pH 8.0,25 mM KCl和1 mM DTT)中9–12小时。对于包括MT在内的实验,在缓冲液中制备3倍预先形成的冻干MT储备(30 mM HEPES,pH 8.0,800 mM KCl,1 mM DTT,60 uM紫杉醇和3 mM MgCl2),透析缓冲液中添加10μM紫杉醇和1 mM MgCl2透析后,通过低速离心(5000 g,5 min)浓缩聚合物组件,并将其重新悬浮在30μL缓冲液中,以进行阴性染色EM、SDS-PAGE或交联质谱分析。测定CHMP7-LEM2的化学计量比白色用LEM2滴定聚合物CHMP7(4μM白色通过低速离心收集(0、0.08、1和4μM)、透析液和聚合物。收集上清液,使其留下10μL作为颗粒部分。通过考马斯染色SDS-PAGE测定每个LEM2条件下聚合和未聚合CHMP7的数量,其中加载等量的颗粒和上清液部分。通过ImageJ量化强度。将数据归一化为含有0和等摩尔量LEM2的样品白色.
脂质体制剂
将脂质溶液(Avanti Polar Lipids)重新悬浮在氯仿中,并按照前面所述制备脂质体29简单地说,在玻璃瓶中干燥脂质(总计2 mg),得到30%鸡蛋磷脂酰丝氨酸(PS)、30%鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)和40%磷脂酰乙醇胺(PE)的最终比例(摩尔%)。将脂质膜分散在缓冲液(40 mM HEPES,pH 8.0,150 mM KCl)中,以产生最终浓度为1 mg/mL的脂质体,并将其储存在−80°C下。
在模型膜存在下对全长LEM2进行微管捆绑试验。
将玻璃瓶中的干燥脂质膜分散在缓冲液中(40 mM HEPES,pH 8.0,800 mM KCl,5%甘油,0.1%DDM)并在30°C下超声10分钟,以产生浓度为1 mg/mL的洗涤剂溶解脂质。等体积洗涤剂溶解脂类、活性Bio-Beads™SM-2树脂(BioRad)和浓缩LEM2佛罗里达州(1 mg/mL)或LEM2佛罗里达州混合缓冲液并在4°C下培养过夜。从树脂中分离洗涤剂缺失反应,并与荧光标记的MT和G-PEM缓冲液(Cytosketon Inc.BST01)混合,使最终KCl浓度达到150 mM和1μM Tubulin。在成像之前,反应在RT培养1小时。
膜诱导CHMP7聚合
透析或稀释CHMP7以将盐浓度从800 mM降至150 mM KCl(补充5%甘油、40 mM HEPES、pH 8.0、1 mM DTT),得到0.1 mg/ml的最终蛋白质浓度。脂质体和CHMP7混合40:1(w/w),并立即制备阴性染色EM网格。
电子显微镜数据采集和二维分类
制备膜诱导CHMP7聚合物用于负染EM,并使用Tecnai T20显微镜(FEI)和LaB6灯丝在200 kV下成像。使用SerialEM软件使用TemCam-F816 8k×8k相机(TVIPS)采集227张显微照片35,标称像素大小为1.57º。散焦为0.7−1.7μm,总剂量为20 e-/Å2含有重复聚合单元的颗粒是沿着聚合蛋白链手动拾取的,产生6094个颗粒。具体地说,颗粒是从从膜上分离出来的聚合物中挑选出来的,这些聚合物的取向对后续的分类是有利的。在RELION 2.0版软件中,使用默认参数拾取粒子并进行二维分类。
交联质谱法
用等摩尔His聚合全长CHMP7(60μg6-相扑2白色按照所述聚合分析,并用2 mM光交联剂(H12-BS3,创造性分子)在30°C下保持30分钟。伊斯6-SUMO-LEM2系列白色用于实现更高的蛋白质浓度。用2 mM重交联剂(D)交联全长单体CHMP7(60μg)12-BS3,创造性分子)。对反应进行猝灭(10 mM碳酸氢铵,10 min,室温),如前所述,对轻交联反应混合物和重交联反应混合物进行组合和处理以进行质谱分析36,37如前所述,通过尺寸排除色谱法(Superdex肽,GE Healthcare Life Sciences)富集交联产品36将0.9至1.4 mL之间洗脱的部分干燥,再悬浮在0.1%甲酸中进行MS分析。在蒸发之前,将0.9 ml和1.3 ml开始的组分合并,得到四个总SEC组分。
使用Q-Exactive Plus质谱仪(Thermo Scientific)、纳米电喷雾离子源(Easy-Spray、Thermo)和NanoAcquity UPLC系统(Waters)进行LC-MS分析。富集部分在15 cm×75μm ID PepMap C18柱(Thermo)上分离,使用5–28%溶剂B(a:0.1%甲酸溶于水,B:0.1%甲酸存于乙腈)的60分钟梯度。在Orbitrap扫描中从350–1500 m/z(质量分辨率:70000)测量前驱体MS扫描。十种最强烈的三重带电或更高的前体在四极杆(隔离窗:4 m/z)中分离,用HCD解离(归一化碰撞能量:24),产物离子光谱在Orbitrap中测量(质量分辨率:17500)。应用20秒的动态排除窗口,并将自动增益控制目标设置为3e6(前驱扫描)和5e4(产品扫描)。
使用Proteome Discoverer 2.2(Thermo)生成峰值,并使用Protein Prospector 5.20.23搜索交联肽38根据包含His的数据库搜索每个产品离子光谱的.85个最强烈的峰6-SUMO-LEM2系列白色与其他10个包含CHMP亚基和Tubulin的蛋白质序列一起,与这些序列中每个序列的10个随机诱饵版本串联(总共121个序列)。搜索参数为:20ppm(前体)和30ppm(产品)的质量容限;半胱氨酸上氨基甲酰化的固定修饰;肽N-末端谷氨酰胺转化为焦谷氨酸的可变修饰,蛋氨酸的氧化,以及半水解重BS3和轻BS3对赖氨酸和蛋白质N-末端的“无活性”修饰;胰蛋白酶特异性用于2个缺失的裂解,每个肽允许三个可变修饰。在1.5%FDR阈值下报告了独特的交联残基对,对应于分数差截止值为15。
对于定量分析,天际线4.1中的前体离子过滤39用于提取轻:重交联前体离子信号。Skyline不直接支持交联分析,因此如前所述,交联肽被线性化并作为光谱库导出40。在Protein Prospector搜索中发现的每个轻或重交联肽物种都会生成转换,并与其相应的重或轻对应物配对。在所有四个LC-MS馏分中提取与前三个同位素匹配的前体离子跃迁。手动检查每个提取的离子色谱图,并调整起点和终点,以确保检测到正确的峰,并且没有干扰信号。同位素点产物要求超过0.85。将峰面积重新输入R中,并在每种轻交联和重交联的交联残基水平上进行总结。求出与给定交联度匹配的所有肽的峰面积。最后,测定了重峰面积和轻峰面积的对数2比值。使用xiNET将过滤的交联映射到主要蛋白质结构41.
同源建模和交联映射
使用Phyre2创建人类CHMP7和LEM2结构域的同源模型42(补充表2). 参考结构是根据置信度评分和与参考结构的同源性来选择的。通过使用UCSF Chimera将交联数据映射到模型来验证模型43与Xlink分析仪一起使用44.
荧光显微镜免疫染色
细胞在室温下于2%多聚甲醛中固定25分钟。用于免疫检测的主要抗体是兔α-IST145、兔α-管蛋白(ab18251;abcam)、大鼠α-管蛋白质(YL1/2;精准化学与科学)、α-拉明B2(abcam;ab8983)、α-SUN2(Brian Burke赠送)和小鼠α−53BP1(MAB3802;Millipore)。用荧光标记的二级抗体(α-兔子488、α-小鼠488、β-兔子647和α-兔子568;Thermo Fisher)孵育后,用DAPI ProLong Gold(Thermo Fisher)安装盖玻片,并通过宽视野显微镜(Zeiss Axioskop 2;Axiovision软件)、旋转圆盘共焦显微镜(Nikon Eclipse T我; 变形软件)或受激发射损耗显微镜(见下文)。用于定量IST1定位:α-兔子488对抗兔子α-IST1;用于评估末期细胞的DNA损伤:α-小鼠488对抗小鼠α−53BP1,α-兔568对抗兔α-管蛋白;用于定量和成像末期细胞中的微管蛋白和核膜表型:α-小鼠488对抗小鼠α-SUN2(INM正交成像标记)或α-拉明B2(INM定量实验标记),α-兔568对抗兔α-微管蛋白;间期表型:α-兔488抗兔α-管蛋白;对于STED:α-小鼠568对抗小鼠α-Tubulin,α-兔647对抗兔α-LEM2。
受激发射损耗(STED)显微镜
STED显微镜在配备HC-PL APO CS2 100x/1.40 OIL物镜的徕卡TCS SP8 STED 3X共焦激光扫描显微镜上进行。使用徕卡LAS X Core软件对共焦切片进行成像,并使用惠更斯软件套件(SVI)进行处理。使用1.4%激光功率下的405 nm激光线记录图像以成像DAPI,使用5.6%激光功率的572 nm激光线在共焦探测器模式下成像Tubulin。LEM2是在STED脉冲探测器模式下,用2.5%激光功率的653nm激光线进行成像的(门开始为0.3 ns,门结束为6.5 ns),惠更斯饱和因子为5.7。去卷积图像在ImageJ(NIH)中增强对比度,原始数据可根据要求提供。
荧光显微镜定量
为了举例说明,后期A和B细胞的图像通过100X宽视野显微镜获得,并进行调整,以便DNA、IST1和LEM2-mChr通道中的背景荧光在样品之间具有可比性。使用100X宽视野显微镜获得的原始图像对后期A(早期)和后期B(晚期)的IST1表型进行评分。IST1对后期染色质肿块的定位在三个独立实验中进行评估,其中图像由三个独立的计分员进行编码、随机分组和盲目评分。对图像进行解码并量化盲分。每个染色质盘(每个细胞两个)被评分为IST1具有额外强健、强健、弱或无招募。强健募集的特征是在染色质团的核心组织有独特的病灶,而弱募集的特征则是染色质表面组织较少、强度较小的病灶,这与之前的研究结果一致4超强健的特征是显著强烈的IST1荧光,通常伴随着大部分染色质盘的募集。为了清晰起见,稳健和超稳健类别被绘制在一起作为一个单独的类别。大多数分数用于三个分数不同的情况。
对于追踪GFP-CHMP7的延时共定位实验,通过延时光学显微镜(如下所述)获取后期细胞图像,并选择在LEM2-mCherry或LEM2峰值时进行评分ΔWH-m樱桃在后期染色质盘的核心区域富集。在FIJI中,对每个细胞进行LEM2 mCherry或LEM2的阈值处理ΔWH-m樱桃浓缩。测量GFP-CHMP7通道中每个感兴趣区域的平均荧光(任意单位)。从整个细胞的面积中减去感兴趣的区域,以测量每个后期细胞的细胞质GFP-CHMP7的平均荧光。绘制的值是通过外源LEM2富集测定的感兴趣区域的平均GFP-CHMP7荧光,并归一化为细胞质GFP-CHMP7的平均荧光。
NLS-3GFP在后期或末期的核积累是通过在整个后期以1分钟的间隔(在以15s的间隔成像后)或在末期完全卵裂沟进入后30分钟测量细胞核与细胞质NLS-3GFP的比率来确定的(延时显微镜描述如下)。在FIJI中,染色质区域被定义为NucBlue™通道中的感兴趣区域,并用于测量后期核NLS-3GFP的平均荧光(任意单位)或末期细胞的积分密度(面积与平均灰度值的乘积)。NLS-3GFP的细胞质水平通过选择整个细胞,然后取消选择染色质区域来测定。对于后期细胞,每个圆盘的核NLS-3GFP的平均荧光除以同一细胞的细胞质NLS-3GPP的平均荧光。对于末期,积分密度用于解释因去凝作用导致的核大小变化。
为了便于说明,通过宽视野和延时显微镜获得间期和末期细胞,并进行调整,以使样品之间的背景荧光具有可比性。使用60X旋转圆盘共焦显微镜获取用于正投影的z堆栈。在60倍宽视野显微镜下获得用于对末期核膜和微管蛋白表型进行评分的原始图像。为了对末期的DNA损伤进行评分,在60倍宽视野显微镜下采集图像,并在FIJI中均匀阈值化。使用FIJI中的find maxima函数检测核病灶,并在所有条件下保持噪声容限不变。为了对相间核的圆度进行评分,在60倍的广角显微镜下采集图像。DNA通道在FIJI中被阈值化,每个核被定义为一个感兴趣的区域。然后评估核的圆度(圆度=4pi(面积/周长^2)如其他人所述46.
时间间隔光显微镜分析
使用玻璃底Mat-Tek皿,通过旋转盘共焦显微镜在60倍下对所有现场成像实验进行成像。对于跟踪染色质的实验,按照制造商的说明,在成像前1小时用NucBlue™(Thermo Fisher)处理细胞。本研究中使用的稳定细胞系和瞬时转染质粒描述如下补充表3。稳定表达GFP-Lamin B2和LEM2-mCherry的细胞培养48小时,并在成像前1小时用200nM SiR-Tubulin(CY-SC006;Cytoskelton,Inc.)处理。稳定表达GFP-BAF和LEM2-mCherry的细胞也被异步培养。所有其他实验均进行细胞周期同步,如下所述。为了追踪细胞核完整性,细胞单独或结合稳定表达NLS-3GFP(PL19)或稳定表达抗siRNA的LEM2-mCherry(PL13)、LEM2ΔSY-mChr(PL16),LEM2Δ压力-mChr(PL17)或LEM2ΔWH-mCherry(PL18)在卵裂沟完全进入后至少30分钟内以15秒或3分钟的间隔成像(以评估后期的分隔)。在后一个实验中,在成像前1小时添加100 nM SiR-Tubulin(CY-SC006;Cytoskelton,Inc.)。用siRNA寡核苷酸处理稳定表达H2B-mCherry和GFP-Tubulin的HeLa细胞,如下所述。对于瞬时表达实验,使用Lipofectamine LTX Plus(Thermo Fisher)将质粒转染细胞24小时,然后重新镀膜并进行细胞周期同步。稳定表达GFP微管蛋白的细胞47瞬时转染抗siRNA的pCMV(Δ5)-LEM2-mCherry(PL13)、pCMVΔLCD-m樱桃(PL15),pCMV(Δ5)-LEM2ΔSY-m樱桃(PL16),pCMV(Δ5)-LEM2ΔPR-mCherry(PL17)或pCMV(Δ5)-LEM2ΔWH-m樱桃(PL18)。对于延时共定位实验,稳定表达GFP-CHMP7的HeLa细胞瞬时转染siRNA抗性pCMV(Δ5)-LEM2-mCherry(PL13)或siRNA抗性的pCMVΔWH-m樱桃(PL17)。
siRNA-介导的消耗和细胞周期同步
HeLa细胞是Maureen Powers(埃默里大学医学院)送的礼物,U2OS是Don Ayer(犹他大学医学院;两种细胞系均通过STR谱鉴定。所有HeLa细胞系均由同一亲代HeLa电池产生,支原体污染检测为阴性。U2OS细胞未检测支原体污染。HeLa和U2OS细胞在含有10 nM siRNA寡核苷酸(由Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher)递送)的情况下,被涂布在纤连蛋白涂层盖玻片上。使用的特定序列为:siControl[siScr-1]47,48,siLEM2–1[反义序列靶向核苷酸78–98:UUGCGUAGACAUCCGGGdTdT19],siLEM2–2[靶向核苷酸1297–1317:UACAUAUGGAUAGCUCCdTdT的反义序列19],和siCHMP7[靶向核苷酸650–669的反义序列:CCCUCUACUCAAdTdT]49在测试外源LEM2在内源性LEM2耗竭后是否能够拯救功能的实验中,使用siLEM2-2耗竭内源性LEM2,因为外源LEM2-构建物具有沉默突变,从而产生对siLEM2–2寡核苷酸的抗性。对于细胞周期同步实验,在电镀后6-8小时,添加2 mM胸腺嘧啶核苷24小时,以将细胞阻滞在G1/S。然后用PBS彻底冲洗细胞,然后添加培养基。释放后12小时,对细胞进行活体成像或显微镜下固定。在追踪间期表型的实验中,细胞在释放后16小时固定进行免疫染色。为了评估外源性LEM2在细胞周期不同阶段的磷酸化状态,用2 mM胸腺嘧啶核苷处理细胞24小时,将细胞阻滞在G1/S。然后,在添加含有100ng/mL诺卡唑的培养基之前,采集G1/S阻滞的细胞或用PBS彻底冲洗。诺康唑处理16小时后,通过摇晃收集有丝分裂细胞。细胞颗粒在TBS中冲洗,然后通过Phos-Tag™丙烯酰胺SDS-PAGE进行裂解和分离50和随后的免疫印迹(如下所述)。
免疫印迹
为了验证siRNA治疗的有效性和siRNA-resistant构建物的表达,将细胞置于六孔培养皿中,并置于与生成成像数据相同的实验条件下。一级抗体[α-LEM2(HPA017340;Sigma-Aldrich)、α-mCherry(Novus Biologicals,NBP2-25157)、α-Tubulin(ab18251;abcam)]用HRP-偶联二级抗体(Thermo Fisher)和化学发光检测。为了通过迁移率转移评估外源性LEM2的磷酸化,在缺乏EDTA和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液中制备全细胞裂解物。然后,按照制造商的说明(P0753S;NEB)对每种裂解液的等分样品进行lambda蛋白磷酸酶处理,或仅包含PMP缓冲液和MnCl的对照反应处理2按照制造商的说明,在用Phos-Tag™丙烯酰胺试剂(AAL-107;Waco)制备的8%和10%SDS-PAGE凝胶上运行样品。如上所述,通过免疫印迹检测LEM2。