在末期,聚集的NE在去致密染色体周围瞬时形成两个域1,8,9“核心”NE蛋白(例如膜蛋白emerin)聚集在染色体周围,然后集中在纺锤体附近的区域。同时,核孔复合体蛋白(NPC)和其他“非核心”蛋白(例如,拉明B受体,LBR)聚集在远离纺锤体的染色体外围,暂时排除在核心结构域之外(–)8,9在有丝分裂退出后,这些结构域相互交织,额外的NPC通过间期组装途径缓慢组装10.
为了了解微核的NE缺陷,我们询问了延迟染色体上的NE组装是否发生在相同的时空模式中。在三种细胞系中,同步细胞通过两种独立的方法产生了滞后染色体(参见方法). 尽管核心蛋白以与主染色体质量相同或更高的水平被招募到滞后染色体,但NPC和其他非核心蛋白几乎完全无法组装(,–). 子细胞之间延伸的染色质桥显示出类似缺陷的NE蛋白组成(,).因此,与最近的研究一致11,只有一部分NE蛋白正常聚集在染色质上,染色质仍位于末期中央纺锤体内。
滞后染色体上的NE组装缺陷。a。滞后染色体上的非核心NE组装缺陷。上图:实验方案。底部:带有滞后染色体的RPE-1细胞图像(箭头,3个实验)。红色:核心NE蛋白;绿色:非核心蛋白质。b、 c、,微核核导入受损。b、,RPE-1细胞的Kymograph(顶图方框区域)显示RFP输入受损,RFP与新形成的微核(箭头)中的核定位信号(RFP-NLS)融合。同步为中一(t=0为后期发作,AO)。底部:合并图像。9个单元格的代表性图像,下一个面板中的“B”类。c、,顶部:总结微核导入模式的卡通(摘自b条,请参阅进口缺陷的代表性量化)。底部:与上述类别相对应的微核百分比(n=24,来自11个RPE-1实验,n=17,来自9个U2OS实验)。比例尺,10μm。
来自滞后染色体的微核也减少了NPC/非核心蛋白组装(–). 因此,微核具有一些可变性,具有显著的核导入缺陷(,,,,补充视频1和2)并且在积累核蛋白方面存在缺陷,例如复制蛋白A(RPA),这是DNA复制和修复的关键剂量敏感调节因子12和B型层粘连蛋白,已知需要维持NE完整性(–,–)6,13对于单个细胞,RPA的范围与重要的β依赖性报告基因相关(),这表明至少对于importin beta客户端来说,存在一般的导入缺陷。因此,核对不同的先前报告6,11,14–16微核经历异常的NE和NPC组装,导致导入缺陷和核蛋白积累。
我们认为,滞后染色体上的NPC/非核心装配缺陷可能是由于先前提出的“染色体分离检查点”15在该模型下,纺锤体中央区中心的Aurora B磷酸化梯度17提供了一个空间线索,阻止NE组装,直到无膜滞后染色体可以并入主染色体团形成单个细胞核。然而,一些观察结果与该模型不一致。首先是核心膜蛋白,之前没有检测过15,组装在滞后染色体和染色体桥上,与它们相对于纺锤体中区的位置无关()这表明NE确实在滞后染色体上形成,尽管NPC的NE耗尽。第二,非核心蛋白质的染色体桥均匀耗尽,没有显示明显的梯度(,). 第三,在晚期末期,滞后染色体失去Aurora B介导的组蛋白3丝氨酸10磷酸化(pH3S10),但不组装NPC或其他非核心蛋白(,). 最后,在siRNA介导的转运马达MKLP2敲除后中区极光B梯度丢失的细胞中17,非核心NE组装在滞后染色体上仍然受到抑制().
检查点模型要求Aurora B在有丝分裂退出的整个过程中持续监测滞后染色体的位置。为了验证这一点,细胞从有丝分裂停滞中释放出来,以高时间分辨率成像,在后期/末期用Aurora B抑制剂(ZM447439,12分钟)处理,然后固定并标记以评估NE组装(). 因为细胞从有丝分裂阻滞中释放出来时只有部分同步性,所以我们可以确定Aurora B在中期和末期的每个阶段都受到抑制的细胞。令人惊讶的是,Aurora B抑制只有在发病早期、发病后期或发病后不久发生,而不是在发病后期~6–8分钟后才恢复非核心蛋白组装到滞后染色体(). 晚期极光B抑制的不可逆性不能用药物抑制的部分效果来解释:在抑制剂治疗后的3分钟内,观察到极光B活性几乎完全丧失,并且使用高10倍剂量的抑制剂获得了难以区分的结果(,). 因此,Aurora B的全局激活可以在后期早期抑制非核心NE组装,但在后期需要操作染色体分离检查点时没有影响。相反,在中后期左右,滞后染色体在非核心NE补充中变得不可逆缺陷。
滞后染色体上NE组装缺陷的不可逆性。a、,晚中期后极光B抑制未能将非核心(LBR)组装恢复到滞后染色体(箭头)。左栏:添加ZM447439或DMSO时的细胞(AO后的最小值)。右栏:标记有DNA(蓝色)、磷酸-T232极光B(红色)和LBR(绿色)的细胞。在对照组中,即使位于远离活跃极光B(pT232)的位置(白色箭头),滞后染色体也无法招募LBR。比例尺,10μm。右上:实验方案。右下:在指定时间暴露于ZM的细胞中LBR的MN/PN(初生核)FI比率(95%CI的平均值,n=40、29、31、31、43、43、34每个时间点,来自5个实验。为简短起见,滞后染色体被指定为“MN”)。***P<0.0001,NS:P=0.0816,双尾Mann-Whitney检验。b条CLEM显示所有染色体上均同步形成NE。左上角:具有滞后染色体的RPE-1细胞沟纹进入的时间进程(黑线:平均值,灰线:±1 SD)。红色和蓝色圆盘表示CLEM分析的10个细胞的阶段:在细胞分裂的早期阶段,CLEM没有检测到NE(红色);在后期(蓝色),PN和MN均存在双膜NE。MN周围的核周间隙(红色括号)较宽。NPC(箭头)仅出现在PN上。LM图像:DNA为灰度,动粒(CenpA-GFP)和中心体(centrin1-GFP)为红色。比例尺,0.5μm。
先前的研究表明,以pH3S10或凝集素丢失为标志的染色体凝集丢失可能是NPC/NE组装所必需的15,18,19因此,持久性有丝分裂凝聚蛋白被建议阻断滞后染色体上的NPC/NE组装15为了进一步研究这一点,我们使用了高时间分辨率成像来关联NPC/非核心组装的时间与凝聚素水平。出乎意料的是,NPC/非核心蛋白组装很容易观察到高水平的凝集素亚基SMC2(最高约70%,,). 尽管在检测pH3S10缺失方面存在抗体特异性差异,但pH3S0也获得了类似的结果(). 此外,约5倍RNAi介导的SMC2敲除未能在滞后染色体上恢复NPC/非核心NE组装(,). 此外,相关光镜和电镜(CLEM)实验表明,NE组装时,所有染色体,包括滞后染色体,都出现了相对浓缩的现象(,底部面板)。因此,与早期细胞融合研究的数据一致20NPC组装不需要大规模的染色体去凝聚,持续的凝聚蛋白结合不能解释滞后染色体上不可逆的NE组装缺陷。
考虑前期工作10,21,22,我们假设,滞后染色体上NE组装的不可逆缺陷可能是由于它们在缺乏NE的NPC中的包围造成的。例如,爪蟾缺乏Nup107–160复合物的鸡蛋提取物只能在反应早期添加纯化的复合物才能组装NPC,因为连续无NPC NE的形成不可逆地阻碍NPC组装21与这一观点一致的是,ESCRT-III成分,它促进了末期新形成的NE的闭合1,23与正常动力学的滞后染色体相关和分离(,,补充视频3). 结构光照显微镜(SIM)显示,滞后染色体确实被膜蛋白emerin包裹,但不是NPC(). CLEM实验表明,尽管滞后染色体周围的膜缺乏NPC,但所有染色体周围都同步形成了双膜,包括滞后染色体(). CLEM证实这种NPC的缺乏持续存在于间期微核(),与不可逆NE组件缺陷一致。
尽管我们的实验反对NE组件的空间标记检查点调节(如上和,),整体极光B抑制在后期早期对NE组装的影响仍需解释(,). 我们认为NE装配的部分恢复可能是Aurora B依赖性纺锤体微管在早期后期稳定的间接结果()24的确,在爪蟾卵提取物、染色体附近的微管稳定不可逆地抑制含NE的NPC的形成22因此,我们发现,诺克唑和Aurora B抑制对非核心NE组装具有显著相似的作用:诺克唑在早期后期对微管的拆卸逆转了滞后染色体上的非核心组装缺陷,而如果诺克唑稍后添加,则影响最小(,). 此外,在正常NE组装过程中,非核心NE通常被排除在中心纺锤的致密微管束附近的核心域之外(,)8,25然而,无论极光B是定位于纺锤体中区还是被迫留在主染色体上(MKLP2基因敲除,).
由于极光B和微管相互依赖的功能24,我们使用紫杉醇来防止极光B抑制后微管分解()并确定微管是否仍能将非核心NE从中央纺锤体区域排除(,,). 在对照的晚期细胞中,核心蛋白和非核心蛋白在有丝分裂后如预期的那样混合在主染色体上。相比之下,在紫杉醇处理的细胞中,非核心NE结构域之间的差距持续存在和/或核心结构域被夸大(,箭头)。重要的是,与紫杉醇联合添加Aurora B抑制剂与单独紫杉醇治疗具有相同的效果(). 因此,非核心NE组装的微管抑制独立于极光B。
主轴微管阻断非核心NE组件,独立于极光B。a、,紫杉醇(PTX)稳定微管可抑制核心结构域的非核心侵袭。左图:药物治疗后的RPE-1细胞图像:方框区域的放大图像显示主染色体上的非核心(Nup133)间隙(红色箭头)。右侧,顶部:实验方案。右下:结果的量化(95%置信区间的平均值,n=40、47、41、61、40、47,41、61,从左到右,来自2个实验)。****P<0.0001,NS:P=0.2974,0.9837,0.2473,0.3374(从左到右),双尾Mann-Whitney检验。b、 c、,KIF4A缺失后滞后染色体上的小尺度核心/非核心结构域分离。b、,表达Aurora B-GFP的HeLa K细胞图像(2个技术复制品)。合并和放大的图像:Emerin(红色、白色箭头)、Nup133(绿色、白色箭头”)。与中的同步.c、,HeLa K细胞中被Nup133覆盖的滞后染色体周长的比例(如左图所示;两个实验中95%CI的平均值,n=90,52,81)。****P<0.0001,双尾Mann-Whitney检验。比例尺,10μm。
上述数据表明,在微管密度高的区域,非核心NE受到抑制。为了验证这一假设,我们通过siRNA介导的驱动蛋白KIF4A的敲低“放松”纺锤体微管捆绑26如预期,KIF4A击倒保留了Aurora B的一般纺锤体组织和可检测的中心纺锤体定位()26然而,KIF4A缺失部分逆转了滞后染色体上的NPC/非核心NE组装缺陷(,,–). 有趣的是,这些位点的NE通常表现出核心蛋白(emerin,白箭头)和非核心蛋白(Nup133,白箭头),发生在末期的主要染色体上。这些“迷你”核心/非核心子域形成于中央纺锤体内的任何位置,包括极光B活性高的纺锤体中区。此外,这些部分修正的滞后染色体的pH3S10水平与中期染色体相当()确认NPC组装与浓缩染色质相容。进一步一致认为,KIF4A敲除后的SIM表明,滞后染色体的“仅核心”区域富集了ESCRT-III组分CHM4B标记的NE微管接触23(–). 有趣的是,Aurora B在早期后期的抑制作用与KIF4A击倒作用非常相似(),具有微小的核心/非核心亚结构域,通常在滞后染色体周围形成。总之,这些数据表明微管的局部组织是NPC/非核心NE能否组装的关键决定因素。
我们的微管抑制模型预测,将错位染色体定位在远离中心纺锤体的位置,可以使NE组装正常化,并恢复微核功能。为了产生外周错位染色体,用MPS1激酶抑制剂处理细胞,在染色体聚集完成之前造成错位。在HeLa细胞中,MPS1的抑制与微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)的敲除相结合,进一步增强了外周染色体的定位(,)27引人注目的是,与中央滞后染色体不同,外周染色体同时招募了核心和非核心NE蛋白,包括NPC(–,,补充视频4). 微管和ESCRT标记23表明外周染色体也较少与微管接触(). 来自外周染色体的微核具有正常的核导入水平,并恢复了DNA复制和修复所需的层粘连蛋白B1和其他核蛋白的水平(,,). 此外,来自外周染色体的微核显示出正常的DNA复制程度(). 外周微核上功能性去甲肾上腺素的恢复与染色体数目无关,这可能导致其较大(–). 最后,在HeLa细胞中,来自外周染色体的微核NE破坏率降低了约5倍,DNA损伤显著减少(,,). 在RPE-1细胞中,外周染色体定位也显著减少了NE断裂和DNA损伤(,补充视频5). 然而,在RPE-1细胞中,外周染色体对NE断裂的影响被部分掩盖,因为这些细胞中外周染色体的大微核受到肌动蛋白依赖性NE断裂,就像在初生核上短暂发生的一样13(参见中的讨论,). 因此,将染色体远离纺锤体可以显著恢复NE组装和由此产生的微核的功能。
错配染色体的外周定位纠正了微核缺陷。a、,产生位于纺锤体内或远离纺锤体的错位染色体的实验方案(微管:红色;非核心NE:绿色)。b、 c、,非核心NE在外周染色体上组装,但不在中心染色体上组装。b、,上图:带有中央(黄色箭头)和外围(红色箭头)染色体的RPE-1细胞图像,标记有核心(红色)或非核心(绿色)蛋白质。底部:量化,如所示【95%CI的平均值,n=83,67(左),n=122,58(右),各来自2个实验】。****P<0.0001,双尾Mann-Whitney检验。c、,结果与中类似b条表达RFP-H2B(红色)和GFP-Nup107(绿色)的HeLa K细胞的活细胞成像(补充视频4,代表15个单元)。d、 e、,外周染色体MN的功能恢复。日期:,所示蛋白质的FI比率,比较来自外周染色体和中心染色体的MN(RPE-1细胞,方案如一). **** P<0.0001,双尾Mann-Whitney检验(95%置信区间的平均值,n=130、97、145、112、52、47、64、48、64、47、49、45、49、45,45,从左到右,从2个实验中得出的指示蛋白质)。e、,上图:实验方案。底部:结果图(HeLa K细胞)。左图:NE完整性由NLS-RFP丢失监测(5个实验)。中间:NE完整性通过GFP-BAF的超积累监测(3个实验)。右:DNA损伤(3个实验)。**P=0.0084,****P<0.0001,双尾Fisher精确检验。注:只有一小部分断裂的MN会受到DNA损伤。比例尺,5μm。
在这里,我们对微核的NE缺陷提供了一种解释。这些发现定义了显色菌的一个重要机制,并为正常细胞分裂期间染色体分离和NE组装的协调提供了一个新模型(补充视频6). 我们认为,在末期,捆绑纺锤形微管抑制NE与NPC/非核心蛋白向滞后染色体的募集。因此,滞后染色体被主要包含核心蛋白的NE包裹。基于先前的体外研究21,22,这种NPC缺陷的NE不可逆地阻断额外的NPC/非核心蛋白组装。这种不可逆的缺陷可能会因非核心蛋白对新形成的子核的隔离而加剧。因为微核从含有少量NPC的NE开始,它们减少了接触需要核转运的间期NPC组装10核质转运缺陷会导致许多蛋白质积累缺陷,包括正常DNA复制、DNA修复和维持NE完整性所必需的蛋白质(例如B型核纤层蛋白6,13,,). 由此产生的自然NE断裂导致染色体断裂,最终导致显色菌2,6,14微管如何抑制非核心NE组装尚待确定,但可能通过简单的物理屏障效应发生。据报道,在末期,鼻咽癌前体细胞聚集在开窗的内质网片上28(以及个人交流,T.Kirchhausen),我们推测这可能不太容易穿透纺锤体微管束。
我们的发现表明,滞后染色体上NE组装的改变不是有益的检查点延迟的结果,而是一种病理结果。在正常细胞分裂过程中,似乎只有松散的协调,而不是精确和连续地监测染色体位置,正常的非核心NE组装依赖于纺锤状微管的及时拆卸。染色体分离和NE组装之间的松散协调,加上有丝分裂退出过程中NE组装错误的不可逆性,提供了一种解释,解释了为什么色三胞症很常见,最近报道在一些癌症中的频率高达65%4,5.
方法
细胞培养。
细胞系保持在37°C和5%CO2DMEM中的大气[HeLa Kyoto(HeLa K),U2OS]或DMEM:F12,不含酚红(hTERT RPE-1)。所有培养基均添加10%FBS,100 IU ml−1青霉素和100μg ml−1链霉素。通过携带相关基因的慢病毒或逆转录病毒载体转导,产生稳定的细胞系(H2B-eGFP和TDRFP-NLS RPE-1、mRFP-H2B和GFP-BAF RPE-1,mRFP-H2B、GFP-BAF和mRFP-LAP2βRPE-1;mRFP-H2B和mNeonGreen-PCNA RPE-1。在10μg ml的浓度下用病毒感染细胞18–24小时−1在抗生素选择或荧光激活细胞分选(FACS)之前,清洗并允许回收聚brene。根据制造商的说明,使用Lipofectamine 3000(Life Technologies)将HEK293FT细胞与适当的包装质粒(慢病毒,pMD2.G和psPAX2;逆转录病毒,pUMVC和pVSV-G)转染产生病毒。通过瞬时转染emerin-eGFP质粒(Lipofectamine 3000转染试剂,Life Technologies),然后使用G418(500μg/ml)进行筛选,生成稳定表达emerin-e GFP的RPE-1细胞。稳定表达mRFP-H2B和CHMP4B-eGFP(BAC29稳定表达mRFP-H2B和mEGFP-Nup107的HeLa K细胞来源于表达mEGFP-Nup107的HeLa K细胞(通过锌指核酸酶介导的基因组编辑构建,来自J.Ellenberg)10稳定表达H2B-mCherry和3XGFP-IBB的U2OS细胞是E.Hatch和M.Hetzer的礼物6对本研究的所有细胞和衍生细胞系进行支原体检测。
DNA构建。
从Addgene获得以下结构:H2B-eGFP(质粒11680,来自G.Wahl)、emerin-eGFP,(质粒61985,来自E.Schirmermer)、pmRFP-LAP2β-IRES-puro2b(质粒21047,来自D.Gerlich)。通过将全长人BAF重组到pLenti-CMV-neo-eGFP载体(T.Kuroda,载体质粒Addgene 17447,来自E.Campeau和P.Kaufman)中,构建了编码eGFP-BAF的构建物。通过将mRFP-H2B重组到pBABE-Puro载体(T.Kuroda,载体质粒Addgene 1764,来自H.Land、J.Morgenstern和B.Weinberg)中,生成编码mRFP-H2B的结构体。编码TDRFP-NLS的结构(在整个手稿中称为RFP-NLS)是a.Salic的礼物。利用Gateway LR克隆酶II酶(Invitrogen)将mNeonGreen-PCNA重组到pLENTI CMV Neo DEST载体(N.Umbreit,载体质粒Addgene 17392,来自E.Campeau和P.Kaufman)中,构建编码mNeon格林-PCNA的结构体。在网关克隆(Invitrogen)之前,首先使用Ex-Taq聚合酶通过PCR扩增mNeonGreen-PCNA(Takara,引物:正向5’CACCATGGTAGCAAGGGG 3’;反向5’CCTCTACAATGGTTATGGCTGG 3’),然后根据制造商的说明将所得PCR产物插入pCR8/GW/TOPO载体(Invit罗gen)。
免疫荧光抗体。
对于免疫荧光,使用了以下主要抗体:LAP2α(1:300,Abcam,ab66588)、LAP2β(1:200,Bethyl Laboratories,A304-840A)、LAP2(1:750,BD Transduction,611000)、小鼠emerin(1:300、Abcam、ab54996)、兔emerin(1:150,Proteintech,10351–1-AP)、兔层粘连蛋白A/C(1:1000,Abcam,ab26300)、,小鼠层粘连蛋白A(1:1000,Abcam,ab8980),兔LBR(1:500,Abcam,ab32535),小鼠LBR(1:100,Sigma-Aldrich,SAB1400151),Nup133(1:300,Abcan,ab155990),Nup107(1:100;生命科技,39C7),Nup22(1:500;BD转导,610497),Nup358,mAb414(1:1000−1:2000,Abcam,ab24609)、ELYS/MEL28(1:200,Bethyl Laboratories,A300–166A)、层粘连蛋白B1(1:1000,Abcam,ab16048)、层黏连蛋白B2(1:1000、Abcam、ab151735)、RPA1(1:100,Cell Signaling,2267,小鼠phospho-H3S10(1:10000,Abcam,ab14955),兔phospho-H3S10,兔α-Tubulin(1:1000,Abcam,ab18251),小鼠α-Tublin(1:300,Sigma-Aldrich,DM1A),CENP-A(1:400,Abcam,ab13939),兔γ-H2AX(1:500,细胞信号,2577),小鼠γ-H2AX(1:500、EMD Milipore,JBW301),FluoTag(Atto488)-X4抗GFP(1:250,NanoTag生物技术),53BP1(1:100,细胞信号学,4937),BRCA1(1:200,Santa Cruz,D-9)和POLD3(1:100,Abnova,克隆3-E2)。所使用的二级抗体为Alexa Fluro 405、488、568和647(Alexa Fluro 405为1:1000、1:500;Life Technologies)。
SDS-PAGE和western印迹。
细胞在2X样品缓冲液(100 mM TrisHCl pH 6.8,4%十二烷基硫酸钠,10%β-巯基乙醇)中溶解。在NuPAGE 4–12%Bis-Tris梯度凝胶(Novex Life Technologies)上对全细胞裂解物进行SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳,并将蛋白质转移到硝化纤维素膜(Millipore)上。对于免疫印迹,使用了以下主要抗体:兔抗MKLP2(1:1000,Bethyl Laboratories,A300–879A)、鼠抗SMC2(1:1000;Abcam,ab10412)、兔抗KIF4A(1:500,Bethly Laboratory,A301–074A)、兔抗TTL(1:2000,Proteintech,13618–1-AP)和鼠抗α-管蛋白(1:15000,Sigma-Aldrich,DM1A)。
RNA干扰。
用5 nmol转染50%融合率的细胞()或根据制造商的说明,使用Lipofectamine 3000转染试剂(Life Technologies)将40 nmol siRNA转染6小时。在滞后染色体诱导前48小时进行转染。使用了以下siRNA序列:MKLP2,5'-ACCACCUUGUAUCUCUCUUG-3'30; KIF4A,5'-AAGCAUUGAAGACCUAG-3’26; TTL,5'-CAGCCACAAUCAGUAACU-3'27; SMC2,SMARTpool:ON-TARGETplus SMC2 siRNA L-006836–01-0005(Dharmacon);TP53,SMARTpool:ON-TARGETplus TP53 siRNA L-003329–00-0050,(J-003329-14)GAAAUUGGGUGGGAGUA,(J-03329–15)GUGCAGUGGUGAUU,(J-004329–16)GCAGAGAUCCUAC,(J-006329–17)GGAGAAUUUCACCUUC(Dharmacon)。使用非靶向沉默剂选择阴性对照1号siRNA(Thermo Fisher Scientific,4390844)或荧光素酶,5'-CGUACGGAAUACUUCGATT-3’作为对照。
EdU公司。
同步化细胞在有丝分裂结束后1小时开始与10μM EdU连续孵育。根据制造商的说明,使用Click-iT Plus EdU Alexa Fluor成像套件647或594(生命科技)检测EdU合并。
用于活细胞成像的SiR-DNA标记。
在成像前约30 min-1h,用1μM细胞可渗透DNA染料SiR-DNA(Cytosketon Inc.)和1μM维拉帕米(一种广谱外排泵抑制剂)处理同步化细胞。
细胞周期同步和滞后染色体/微核的产生。
为了使诺可唑阻滞和释放方案诱导滞后染色体和微核,用100 ng ml处理细胞−1诺卡唑(Sigma-Aldrich)6小时。然后通过摇晃程序收集被截留的细胞,并在重新放置之前用PBS清洗三次。在诺克唑阻断和释放后的前3小时内对细胞进行成像的实验中,将有丝分裂细胞镀在预先涂有0.1 mg ml的盖玻片或成像皿上−1聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma-Aldrich)促进有丝分裂细胞的附着。为了获得后期/末期细胞,分别将RPE-1和HeLa K细胞在诺可唑释放后约40–50分钟或90分钟固定。对于微核细胞在中晚期间期成像的实验,将振荡后的细胞镀到未涂层的盖玻片上。
为了通过抑制MPS1诱导滞后染色体和微核,将细胞置于盖玻片或成像皿上16–24小时,然后用9μM RO-3306(EMD Millipore)再处理19小时,以将细胞阻滞在G2期。然后用含有10%FBS的预加热培养基清洗被截留的细胞7次,并用MPS1抑制剂1μM NMS-P715(EMD Milipore)处理。为了诱导高频率的外周染色体错位及其产生的微核,用3μM NMS-P715处理RPE-1细胞。对于HeLa K细胞,在RO-3306治疗前24小时加入40 nmol TTL siRNA进行TTL敲除。清洗这些G2阳性细胞(19小时)并将其释放到3μM NMS-P715中。我们注意到,使用0.05μM CENP-E抑制剂(GSK923295,Selleckchem)和1μM NMS-P715(EMD Milipore;未显示31).
间接免疫荧光显微镜。
细胞在PBS中清洗并用4%多聚甲醛固定15分钟(除非另有说明);然后将细胞在PBS-0.5%Triton X-100中提取5分钟,用PBS洗涤3次,在含有3%BSA的PBS(PBS-BSA)中封闭30分钟,并与在PBS-3%BSA中稀释的初级抗体孵育60分钟。然后用PBS-0.05%Triton X-100洗涤这些样品3次5分钟。使用物种特异性荧光二级抗体检测一级抗体(Life Technologies)。最后,在添加2.5μg/ml Hoechst 33342检测DNA之前,用PBS-0.05%Triton X-100清洗样品3次5分钟。使用长效钻石防褪色或慢褪色钻石防褪色(Life Technologies)安装所有免疫荧光样品。
用于SMC2的标签(–),用0.5%Triton X-100在CSK中预先提取细胞(1 M PIPES,10 mM NaCl,300 mM EGTA,1 mM MgCl2)在冰上放置5分钟,用4%多聚甲醛固定15分钟,然后如上所述进行处理。
用于CHMP4B、CHMP2A和IST1的标签()在−20°C下用甲醇固定细胞5–10分钟,然后如上所述进行处理。
用于α-管蛋白和CHMP4B的联合染色()用0.5%戊二醛将细胞固定在MTSB(80 mM K-PIPES,5 mM EGTA,1 mM MgCl2(PH6.8)10分钟,然后添加0.1%NaBH4冷却未反应的戊二醛10分钟。然后用PBS清洗细胞3次,并如上所述进行处理。
图像是在尼康Ti-E倒置显微镜(尼康仪器公司,纽约州梅尔维尔市)上采集的,该显微镜配有横河CSU-22旋转圆盘共焦头和Borealis改进型共焦头。激光激发采用405 nm、488 nm、561 nm和642 nm激光。使用X60或X100 Plan Apo NA 1.4油物镜和CoolSnapHQ2 CCD相机(光度计)采集图像。采集参数、快门、过滤器位置和焦点由Metamorph软件(Molecular Devices)控制。
手稿中显示的所有免疫荧光图像均来自单个焦平面,但以下图像除外,,,,这是z焦平面序列的最大强度投影。
相关活细胞/固定细胞成像实验。
为了使用诺克唑阻断和释放方案诱导滞后染色体和微核,如上所述收集和处理有丝分裂细胞,但将其镀在预先涂有0.1 mg ml的玻璃底网格化35 mm成像μ-皿(ibidi)上−1聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma-Aldrich)。为了通过抑制MPS1诱导滞后染色体和微核,在RO-3306处理前6–24小时,将细胞置于ibidiTreat底部网格化35 mmμ盘(ibidi)上。成像皿安装在配备尼康完美聚焦系统的TE2000-E2倒置显微镜上。使用Okolab笼式培养箱将样品保持在37°C和5%增湿CO2用X20 0.5 NA平面荧光物镜采集表达mRFP-H2B、H2B-eGFP和RFP-NLS、H2B-e GFP和eGFP-BAF的细胞的荧光和DIC图像。活细胞成像后,用PBS冲洗细胞,固定并在同一成像皿上进行免疫荧光处理。使用mRFP-H2B通道从记录的电影中识别感兴趣的细胞(除非另有说明),并使用DIC图像基于培养皿上的网格图案确定其位置(参见). 然后通过如上所述的旋转圆盘共聚焦显微镜对免疫染色的样品进行成像。
描述emerin和Nup133在滞后染色体上的补充模式()或滞后染色体或间期微核上H3S10磷酸化或SMC2缺失(,,)每隔2分钟对同步表达mRFP-H2B的RPE-1细胞进行成像,然后按照上述方法进行固定和标记。
用于ZM447439或诺卡唑治疗试验,以测试晚期滞后染色体上非核心NE组装缺陷的逆转(,,,,,)在有丝分裂期间每隔2分钟对同步表达mRFP-H2B的RPE-1细胞进行成像,并在肝细胞成像期间添加药物或载体对照。用于紫杉醇/ZM447439实验,以分析主染色体质量中的非核心NE排除()对同步表达mRFP-H2B的RPE-1细胞进行成像,并用上述药物或载体对照进行治疗。在12-14分钟的肝细胞成像后,对细胞进行上述间接免疫荧光处理。药物浓度为:ZM447439(5μM或50μM,Tocris)、诺可唑(10μM,Sigma-Aldrich)、紫杉醇(10μM,Life Technologies)。
用于长期相关的活细胞/固定细胞成像实验,以检测间期微核缺陷(,,,,)首先以较高的时间分辨率对表达标记的荧光蛋白的RPE-1或HeLa K细胞进行成像,以监测有丝分裂退出过程中错位染色体的位置(后期发病后1–1.5小时间隔3–5分钟)。所有的分析都是从染色体上进行的,这些染色体在有丝分裂结束前始终相对于有丝分裂纺锤体保持在外周或中心位置。有丝分裂结束后,MPS1抑制剂(NMS-P715)减少至0.5–1μM,然后每隔20–30分钟对细胞成像16–18小时。当使用SiR-DNA标记DNA进行长期成像时,最初1.5小时成像后,SiR-DNA浓度降至0.25μM。用于latrunculin A治疗(,)将latrunculin A(150 nM,Life Technologies)添加到RPE-1细胞有丝分裂后约1小时,并维持16-18小时的活细胞成像期。在活细胞成像后,按照上述方法对样品进行免疫荧光处理,以检测NE断裂、DNA损伤或DNA复制。或者,评估NE蛋白、核蛋白或导入报告物在早期间期微核中的积累(,),细胞在有丝分裂后每隔20~30min成像1~3h,然后准备进行间接免疫荧光。
间接免疫荧光图像分析。
使用ImageJ/FIJI软件进行图像分析。使用定制的ImageJ/FIJI宏为滞后染色体/微核和相应的初级细胞核生成感兴趣区域(ROI)。首先,使用来自DNA(Hoechst)图像或mRFP-H2B图像的Li或Otsu阈值进行细胞核分割。其次,使用ImageJ/FIJI函数“Watershed”和“Erode”对核分割进行细化。第三,使用ImageJ/FI功能“Wand Tool”手动选择包含感兴趣细胞核(微核和相应的初级细胞核)的分割区域作为ROI。基于这些ROI,从其他通道量化标记蛋白的平均荧光强度(FI)。为了量化核蛋白(RFP-NLS、RPA1、RPA2、LSD1、Rb、53BP1、BRCA1、POLD3、mNeonGreen-PCNA)、染色质相关蛋白(LAP2α、GFP-BAF、γH2AX)或标记DNA(以及EdU掺入),根据微核和原核最佳焦平面的分割核面积生成ROI。为了量化NE或NPC蛋白,在核分割后,按照上述程序,使用ImageJ/FJI功能“生成带”生成微核和初级核周围的带状ROI。
用于表征NE/NPC蛋白在滞后染色体上的组装(和),如果滞后染色体上标记蛋白的平均FI(背景减影后)高于平均细胞质背景>3个标准差,则滞后染色体为阳性。仅对主要染色体上非核心NE接近完全组装的末期细胞进行评分。
对于微核中蛋白质相对于原核的荧光强度(FI)比率(MN/PN),从定义的ROI中量化平均FI。然后计算背景下MN/PN的FI比值,并显示在相应的图表中。
确定主染色体和滞后染色体上磷酸化H3S10和SMC2的水平(,,,),从步长为0.2μm(或0.5μm)的z-stack(~12μm)中获取图像,以覆盖包含染色体的细胞区域。由于两种抗磷酸化H3S10抗体对染色体块表面抗原的识别能力均强于对染色体块内抗原的识别,因此使用z焦平面序列的最大强度投影来估计磷酸化H_3S10的平均FI。同时,从沿着主染色体群和滞后染色体外围手动绘制的线直接量化磷酸化H3S10的平均FI,得出类似的结果(未显示)。注意,Nup133 in的FI测量值和是从相同的样本中提取的。
计算Nup133标记的滞后染色体周长的分数(图。,,,,,,),我们测量了Nup133阳性的滞后染色体外周手动绘制线的长度(FI>3个标准偏差,高于平均细胞质背景)。然后利用DNA标签测定的滞后染色体周长来计算该值的比值。该比率用于某些晚期有丝分裂NPC(非核心)组装在滞后染色体上恢复的情况(例如KIF4A敲除),但仅限于局部“微域”(例如。,,,). 只分析具有近连续emerin信号的滞后染色体。同时,MN/PN的Nup133的FI比率(例如。,其中测量是从与)以验证来自相应实验的晚期有丝分裂NPC组装,产生类似的结果。
用于分析极光B抑制(ZM447439)对纺锤体微管密度的影响()沿着垂直于有丝分裂纺锤体长轴的线测量α-微管蛋白的FI。
紫杉醇/ZM447439实验分析主染色体质量上的非核心NE排除()Nup133间隙被测量为Nup131信号中沿着主染色体质量的单个小不连续的累积长度(FI<平均细胞质背景以上的3个标准偏差)。阈值被设置为≥5像素,作为Nup133-不连续的下限的定义。emerin富集长度是指沿着emerin丰富的主染色体质量手动绘制的线的累积长度(染色体外围>2倍emerin FI)。只有在主染色体质量上具有近连续emerin信号的细胞被量化。Nup133间隙的长度和emerin富集度归一化为主染色体质量的DAPI信号周长,设置为100。
用于分析KIF4A击倒后滞后染色体上磷酸化H3S10的水平(),沿着白色虚线测量磷酸化H3S10和Nup107 FI的线扫描轮廓。
用于测量外周染色体衍生微核中DNA复制恢复的实验(),按照上述方法测量微核和初级核中EdU的FI比率,然后将其归一化为DNA标记FI比率。测量微核NE破坏的频率(,–),如果微核中RFP-NLS相对于细胞质的FI比值下降到~1,或者如果微核内GFP-BAF相对于初级核的FI比率上升到>3,则微核被打乱。对于DNA损伤,如果MN中γH2AX的平均FI大于初生核中γH2AXFI的平均值3个标准差,则MN得分为阳性。该阈值还用于排除初级细胞核有显著DNA损伤的罕见细胞(例如,在高剂量抑制MPS1后,部分细胞可能会出现这种情况)。
共焦活细胞显微镜。
在所有共聚焦活细胞实验中,如上文所述,使用诺卡唑阻滞和释放方案同步细胞以诱导滞后染色体/微核。在有丝分裂振荡后,将细胞重新放置在预先涂有0.1 mg ml的35 mm玻璃底成像μ-皿(ibidi)上−1聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma-Aldrich)。所有图像均在配备横河CSU-X1旋转圆盘共焦头、Spectral Applied Precision LMM-5(带AOTF)、哈马松ORCA ER冷却CCD相机和尼康完美聚焦系统的尼康Ti倒置显微镜上采集。使用488nm激光激发和525/50nm发射滤光片对GFP进行成像;RFP是使用561nm激光激发和620/60发射滤光片成像的。使用Okolab笼式培养箱将样品保持在37°C和5%增湿CO2图像采集由MetaMorph软件(Molecular Devices)控制。
用于活体细胞成像以测量核导入微核的动力学(,,,)如上文所述,制备表达H2B-eGFP和RFP-NLS的RPE-1细胞或表达GFP-IBB和mCherry-H2B的U2OS细胞,或表达SiR-DNA标记RFP-NLS的U2OS细胞进行成像。为了持续追踪随时间推移移入和移出焦平面的滞后染色体和微核,使用X60 Plan Apo NA 1.4物镜,在诺可唑释放后30分钟至3小时的时间窗内,以1分钟的间隔,从RPE-1的步长为2μm的7 z切片或U2OS的12 z切片获取图像。
用于实时成像ESCRT-III动态()或Nup107动力学(,)如上所述制备表达CHMP4B-eGFP和mRFP-H2B的HeLa K细胞或表达GFP-Nup107和mRFP-H2B的HeLa K细胞。使用X60 Plan Apo NA 1.4物镜,在诺康唑释放后1–3小时内,每隔1分钟从步长为2μm的10 z切片上采集图像。
核进口分析。
量化核进口(),使用了自定义的ImageJ/FIJI宏。滞后染色体/MN和PN的ROI如上文所述生成于间接免疫荧光图像分析第节。基于这些ROI,通过时间推移图像序列的z堆栈量化PN和MN对以及非细胞背景的RFP-NLS的平均FI。从滞后染色体/MN和PN对的最佳焦平面确定了RFP-NLS的背景提取平均FI(最佳焦平面是由最大FI决定的,对于MN与PN可能不同)。该程序用于准确测量成像过程中在PN上方和下方移动的MN的FI。手动验证检测精度。然后使用下面描述的漂白系数对测量值进行光漂白校正。
我们使用G2细胞计算在我们假设的稳态条件下完整微核和初级核的光漂白速率。然后使用测得的漂白系数校正核导入分析期间的漂白。使用与核导入分析所用相同的成像设置和条件,在诺可达唑块释放后16小时,在细胞中对表达GFP-H2B和RFP-NLS的RPE-1细胞进行活细胞成像。我们测量了细胞质、原代细胞核和微核中的RFP-NLS-FI,减去了细胞外的背景。为了控制RFP-NLS表达的细微细胞间差异(FACS后),将每个细胞的原核FI设置为100。然后绘制12 MN/PN对RFP-NLS的归一化平均FI随时间的变化。对于每个PN/MN对,将绘制的数据拟合成带偏移量的指数曲线:年=a*exp(-bx个)+c,其中b是漂白系数,a是年t时的值0漂白前,c是年漂白后的平台值(相机噪声)。从该分析中,PN和MN的平均漂白系数之间没有统计上的显著差异[b=0.05(PN和MIN),P=0.62(NS),Wilcoxon配对检验]。通过比较实验测量值(RFP-NLS-FI)和使用上述方程预测的随时间变化的漂白校正值,验证了该漂白校正方法。实验测量值相对于预测的漂白校正值的比率保持恒定(接近1)。
正交宽场成像方法能够获得更大的样本量,证实了核内RFP-NLS和RPA2的缺陷核积累(,). 对于这些实验,使用X20物镜每隔5分钟进行一次成像,然后按照上述方法进行固定和定量免疫荧光。
相关光和电子显微镜(CLEM)。
用于末期细胞的CLEM分析()将表达CenpA-GFP和centrin1-GFP的RPE-1细胞用3μM诺卡唑处理4小时,释放到新鲜培养基中,并安装在玫瑰室中。从中晚期到胞质分裂完成,每隔5秒进行一次活细胞成像(17个细胞)。通过绘制收缩程度(归一化为细胞宽度)随时间的变化来确定沟壑进入的动力学(,左上角)。此图用于确定EM所选细胞的阶段。细胞用2.5%戊二醛固定在PBS中,pH7.4,30分钟。染色体用Hoechst 33342以1μg/ml染色。多模(DIC和荧光)LM(光学显微镜)数据集是在配备X100 1.45 NA Plan Apo物镜和Zyla 4.2 sCMOS相机(Andor)的尼康TE2000显微镜上获得的。所有荧光图像在SoftWoRx 5.0软件(Applied Precision)中用透镜特定PSF进行解卷积。如前所述,进行了填充、嵌入和切割32使用AMT Capture Engine 7.0版控制的侧装400万像素XR401 sCMOS相机(Advanced Microscopy Technologies Corp),在80 kV电压下操作的JEOL 1400显微镜上对连续薄片(70 nm)进行成像。
用于间期微核的CLEM(4个细胞,具有3个完整的MN和4个新破坏的MN)RPE-1细胞,表达H2B-eGFP和RFP-NLS,通过诺可达唑阻断和释放方案同步并如上所述重新接种。在活体细胞成像之前,用金刚石划片标记多个xyz位置以进行后续分析。每隔10分钟采集一次图像,通过RFP-NLS的突然丢失检测到微核破坏。然后按照上述方法固定并处理为EM选择的细胞。注:从诺卡唑块(未显示)释放后16小时从固定样品(无活细胞成像)中采集的4个细胞(5个完整细胞和2个破坏的MN)的分析得出了类似的结果。
结构照明显微镜(SIM)。
表达emerin-eGFP的RPE-1细胞的3D-SIM()或表达CHMPB-eGFP的HeLa K细胞(–),用诺可唑阻滞释放法诱导滞后染色体。诺卡唑释放后,将细胞重新放置在预先涂有0.1 mg ml的盖玻片(MatTek,高耐受盖玻片)上−1聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma-Aldrich)。为了获得后期/末期细胞,细胞在有丝分裂退出期间(RPE-1和HeLa K细胞分别释放诺康唑后约50分钟或90分钟)固定在PEM缓冲液中稀释的4%EM级甲醛(Polysciences)中[80 mM K-Pipes,5 mM EGTA,1 mM MgCl2(pH 6.8)],37o个C.然后用PEM/0.15%Triton X-100渗透细胞2分钟,并进行免疫荧光处理。初级和次级抗体在PBS/0.05%皂苷中稀释,并孵育2–3小时。为了尽量减少样品的光漂白,通过使用FluoTag(Atto488)-X4抗GFP(1:250,NanoTag Biotechnologies)标记来增强CHMP4B-eGFP或emerin-eGFP信号。
SIM在配备三个水冷PCO.edges CMOS相机的OMX V4 Blaze(GE Healthcare)显微镜上进行,分别为405 nm、488 nm、568 nm和642 nm激光线。使用X60 1.42 NA平面Apochro物镜(奥林巴斯)以0.125μm步长采集图像,无需分格。对于每个z截面,采集了15个原始图像(三个旋转,每个旋转五个相位)。为了最大限度地减少厚有丝分裂标本中GFP的光漂白,通过手动选择将z-stack采集限制在包含整个滞后染色体的细胞的中间(3.5–5μm)区域。图像采集自约28–40个z截面,步长为0.125μm。通过浸没油匹配将球差降至最低33使用基于Gustafsson等人的CUDA加速3D-SIM重建代码,从具有通道特定的、测量的光学传递函数和0.001的维纳滤波器常数的原始数据集计算重建超分辨率图像。(2008)34使用TetraSpeck珠子(Thermo Fisher)或纳米网格控制玻片(GE)测量轴向和横向色差,并使用MATLAB(MathWorks)中的imwarp函数注册实验数据集。使用Imaris图像分析软件(Bitplane)生成3D渲染图像。
统计分析。
使用Prism(GraphPad软件公司)进行统计分析。根据样本分布进行学生t检验或非参数检验(Mann-Whitney检验)。对于条形图或散点图,条形图表示95%置信区间的总体平均值,除非另有规定。确定MN中RFP-NLS和RPA2积累水平之间的相关性(,)采用Spearman相关分析。没有使用统计方法预先确定样本量。这些实验不是随机化的,研究人员在实验和结果评估期间也没有对分配盲视。
数据可用性。
作者声明,支持本研究结果的数据可在论文及其补充信息文件中获得。所有图形的源数据(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,)与论文的在线版本一起提供。本研究中生成和/或分析的所有其他数据集可根据合理要求从相应作者处获得。补充图1包含西方斑点的扫描完整图像。