Distinct ‘safe zones’ at the nuclear envelope ensure robust replication of heterochromatic chromosome regions

Hani Ebrahimi; Hirohisa Masuda; Devanshi Jain; Julia Promisel Cooper

doi:10.7554/eLife.32911

电子生活。2018; 7:e32911。

2018年5月3日在线发布。数字对象标识：10.7554/eLife.32911

PMCID公司：项目编号：5933923

PMID：29722648

核膜上独特的“安全区”确保异色染色体区域的稳健复制

哈尼·易卜拉希米,^#^1,^† Hirohisa Masuda先生,^#^1,^† Devanshi耆那教,¹^†和朱莉娅·普罗米尔·库珀¹

雷蒙德·威灵格，审阅编辑器

雷蒙德·威灵格，加拿大谢尔布鲁克大学；

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补充资料: 透明的报表。
elife-32911-transrepform.pdf（27万）
内政部：10.7554/eLife.32911.021

摘要

染色体复制和转录发生在一个复杂的核环境中，其功能亚区开始被绘制出来。在这里，我们描述了裂变酵母核膜（NE）的不同区域，重点是富含内部NE蛋白Bqt4或层粘连相互作用域蛋白Lem2的区域。Bqt4在NE周围相对移动，具有两种功能。首先，Bqt4系链染色体末端和垫子当这些区域复制时，特定地定位到NE。这种定位是准确异染色质复制所必需的。其次，Bqt4动员NE周围的Lem2分子子集，促进中心周围异染色质的维持。与Bqt4依赖的Lem2迁移相反的是稳定中心体下Lem2的因素，其中Lem2在动粒维持中起着关键作用。我们的数据提示了一个模型，在这个模型中，富含Bqt4的核亚结构域是“安全区”，在这个安全区中，转录和复制之间的碰撞被避免，异染色质被忠实地重新组装。

研究生物：S.pombe公司

介绍

在细胞核内，特定的染色体区域倾向于定位于与核膜组件（NE）接触的外围(Bickmore，2013年). 外周定位染色质往往富含与转录沉默相关的抑制性组蛋白修饰，而活跃的转录基因丰富区域往往位于细胞核内的内部位置。然而，位于外围的核孔复合体（NPC）暂时宿主转录活性区域(Capelson等人，2010年;石井等人，2002年;Lemaêtre和Bickmore，2015年). 因此，NE似乎包含至少两种功能不同的域类型。

异色区通常包含转换率相对较低的低乙酰化核小体，以及在赖氨酸9（H3K9me）处二甲基或三甲基化的组蛋白H3(Aygün等人，2013年;Rea等人，2000年). 富含H3K9m的染色质区域可招募抑制基因转录的蛋白质复合物；组蛋白去乙酰化酶（HDAC）对该网络至关重要。裂变酵母的研究S.pombe公司对我们理解异染色质形成和功能的保守机制具有重要意义(Allshire和Ekwall，2015年;Grewal和Jia，2007年;马丁森和摩押，2015年;Motamedi等人，2008年;Woolcock等人，2011年). Clr4是唯一的组蛋白S.pombe公司H3K9甲基转移酶，对异染色质的建立至关重要(Nakayama等人，2001年;Ragunathan等人，2015年). 含有H3K9me的核小体为HP1家族色域蛋白（包括Swi6）提供了一个结合平台。HP1介导的SHREC招募，其同时含有HDAC和Snf2样核小体重塑剂(Sugiyama等人，2007年)，创建了一个正反馈回路，以确保递归的H3K9甲基化、HP1的募集和SHREC沿着沉默的DNA区域的扩散(Motamedi等人，2008年;Zhang等人，2008年). 保守的JmjC蛋白Epe1阻止抑制性标记扩散到异色结构域以外(Shimada等人，2009年;Trewick等人，2007年;Zofall和Grewal，2006年).

核RNAi途径在几个位点触发异染色质组装。这些位点的转录物通过RNA依赖的RNA聚合酶或聚合酶转录转化为dsRNA，为Dicer（Dcr1）核糖核酸酶创造底物，该酶裂解dsRNA生成siRNA。一旦载入Argonaute复合体（RITS），这些siRNAs将RITS靶向染色体通过与新生转录物的同源性，引发H3K9甲基化、HP1结合和转录沉默。Dicer还可以将RNA聚合酶II（RNAP2）从高转录区域和重复DNA区域（如tDNA、rDNA和中心周围重复）中清除。Dicer介导的RNAP2释放通过限制转录和复制机制之间的碰撞促进基因组稳定性(Castel等人，2014年;Kloc等人，2008年;Zaratiegui等人，2011年).

着丝粒是最显著的异色区域之一。着丝粒中央核是着丝粒的集合体，两侧是由最内层重复序列组成的异色重复序列(国际货币兑换)和外部重复(光电转换管) (高桥等人，1992年;Steiner等人，1993年;Wood等人，2002年). 这种结构在脊椎动物中是保守的，动粒组装的核心平台两侧是异色重复序列(Kniola等人，2001年). 含HP1的着丝粒周围异染色质新兵与外重复序列结合(Nonaka等人，2002年)从而确保忠实的染色体分离(Bernard等人，2001年). 着丝粒周围异染色质在含有CenpA功能的着丝粒的从头组装中也起着关键作用，这些着丝粒能够进行着丝粒组装(Folco等人，2008年). 然而，一旦功能着丝粒组装好，异染色质就成为动粒维持所必需的。

异染色质也从染色体末端向内延伸约30 kb inS.pombe公司。插入这些末端区域的报告基因转录沉默(库珀等人，1997年;Kanoh等人，2005年). 端粒DNA由双链（ds）富G重复序列和末端单链（ss）富G 3'悬垂组成，为统称为庇护蛋白的六种蛋白质提供了平台(de Lange，2009年)调节端粒酶活性，防止染色体末端被视为DNA双链断裂。这些重要的端粒功能不需要异染色质(Khair等人，2010年;Tuzon等人，2004年). 然而，在端粒酶缺失的幸存者中，异染色质对保护染色体末端至关重要通过“HAATI”(Jain等人，2010年)或相反，用于抑制端粒酶阴性癌症中持续断裂诱导复制的“ALT”途径(Benetti等人，2008年;贝内蒂等人，2007年). 裂变酵母保护素组分Taz1（人类TRF1和TRF2的直系同源物）直接与端粒dsDNA结合；Rap1结合Taz1（并且，至少在没有Taz1的情况下，弱结合其他庇护蛋白）并直接与内部NE蛋白Bqt4相互作用(Chikashige等人，2009年)促进端粒定位到NE。保守的Fun30染色质重塑剂Fft3也以非Bqt4依赖的方式促进端粒系留(Steglich等人，2015年). 然而，端粒并不总是被束缚的；例如，有丝分裂前端粒从NE上脱落似乎有助于准确的染色体分离(Fujita等人，2012年).

除Bqt4和NPC外，其他关键的裂变酵母NE复合物包括“核骨架和细胞骨架复合物连接子”（LINC）和层粘连相关蛋白的Lap2/Emerin/Man1（LEM）家族(Gonzalez等人，2012年). LINC包括保守的SUN-（Sad1）和KASH结构域（Kms1/Kms2）蛋白，它们形成从核质到细胞质的反式NE连接。Kms2与位于NE外表面的中心体（纺锤体极体或SPB）相互作用。LINC的核质延伸（Sad1）与聚集在SPB下NE的着丝粒相互作用(费尔南德斯-阿尔瓦雷斯等人，2016年;Hagan和Yanagida，1995年;Scherthan等人，2011年). 尽管裂变酵母中没有典型的核片层，但两种LEM蛋白Lem2和Man1仍具有类层片功能(蔡等人，2001;Gonzalez等人，2012年;Lee等人，2001年). 研究表明，Man1与端粒50-100 Kb区域相互作用(Steglich等人，2012年)，而Lem2似乎被隔离在着丝粒附近(Hiraoka等人，2011年). 最近的研究已确定Lem2是中心周围区域异染色质沉默的调节器(Barrales等人，2016年;Tange等人，2016年).

尽管特定染色质区域倾向于与NE结合，但这种结合在大多数情况下的功能仍有待阐明。我们在一个筛查（将在别处描述）中确定了与维持端粒酶阴性生存的HAATI模式有关的基因Bqt4(Jain等人，2010年)其中异色rDNA重复序列易位到所有染色体末端并获得末端保护能力。Bqt4在野生型中的作用探讨(重量)我们揭示了Bqt4在细胞中的两类作用，一类是在S期直接调节染色质区域的子集，另一类是调节Lem2，而Lem2又在维持着丝粒周围异染色质和着丝粒中央核中起着不同的作用。除了Bqt4在染色质定位中作用的S期特异性外，我们还报道了几个b季度4Δ表型和遗传相互作用，暗示富含Bqt4的微域是专门的“安全区”，可防止转录和复制机制之间的碰撞，从而通过连续世代准确维持异色状态。

结果

NE蛋白组织成不同的结构域

为了绘制NE关键蛋白的组织结构，我们使用了超分辨率荧光成像（OMX系统）(Dobbie等人，2011年)查看内源性标记的Bqt4、Man1和Lem2（参见材料和方法）。与之前描述的电子显微镜图像一致(Chikashige等人，2009年)，我们观察到Bqt4并非均匀分布在NE周围，而是以点状出现，表明NE成分的空间异质性(图1A). 解决缺乏可检测Bqt4的区域组成（图1A)，我们同时成像了Bqt4和Man1(图1B)或Bqt4和Lem2(图1C). Bqt4和Man1信号偶尔重叠，但更常见的是，它们不重叠(图1C,图1——图补充1A). 同时查看Bqt4和Lem2时也可以看到域分区(图1C,图1——图补充1A).

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图1。

内部NE蛋白被隔离到不同的微域中。

(A类)含有Bqt4-GFP的活细胞的代表性超分辨率显微镜（结构照明，SIM）图像。横向分辨率为120–150 nm。箭头表示可检测荧光团丰度相对较低的区域。比例尺表示所有图像中的2µm。(B)表达Man1-GFP和Bqt4-mCherry的代表性固定细胞的SIM图像，以及(C类)柠檬2-GFP和Bqt4-m樱桃。色度化定量和程序如所述图1——图补充1A. (D类)DeltaVision对含有Lem2-GFP和Man1-tdTomato的活细胞进行反褶积荧光成像。定量如所示图1——补充图1C. (E类)活动的代表性单个z平面图像重量表达Lem2-GFP和组蛋白H3-mCherry的细胞。Lem2-GFP在NE周围可以检测到，SPB下方有一个密集的点。(F类)在没有Bqt4的情况下，Lem2未能包围NE，但仍位于SPB下方。横向分辨率(E–F)约300纳米。

图1——图补充1。

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NE蛋白共定位定量。

(A类)皮尔逊相关系数来自固定细胞的SIM成像。数值表明Man1-GFP和Bqt4-mCherry或Lem2-GFP和Bqt4-m Cherry之间的重叠水平是使用Applied Precision softWorX软件测量的。水平黑线表示平均值（Man1 Lem2:0.143，n=38；Lem2 Bqt4:0.37，n=22）和SD(B)Man1-td番茄和Lem2-GFP同步实时成像的其他示例图1. (C类)通过活显微镜评估的指示蛋白质对的颜色化量化为(A类).

图1—图补充2。

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Bqt4控制Lem2的定位，但不控制Man1、Nup107或Cut11。

(A类)在NE周围定位Lem2需要Bqt4。WT和bqt4Δ表达Lem2-GFP和Pcp1-RFP的细胞。可见的Lem2-GFP点bqt4Δ细胞与SPB共定位（标记为Pcp1-RFP）。这些图像是通过整个细胞核的成像横截面的最大强度投影。(B)删除Bqt4不会影响Man1-GFP、Nup107-GFP和Cut11-GFP的定位。在表达所示标记膜蛋白的细胞中进行活细胞成像重量和bqt4Δ细胞。

最强烈的Lem2池出现在SPB的正下方，而Lem2分子的一个不太突出的子集位于NE周围的一个环上(图1E). 值得注意的是，在缺乏Bqt4的细胞中，Lem2的环减少到几乎不可见，而只有一个Lem2焦点仍然存在(图1E和图1——图补充2A)，与SPB组件Pcp1同位(图1-图补充2A) (Gonzalez等人，2012年). 相反，NPC蛋白Nup107的定位模式(Baí等人，2004年)，NE组件Cut11(West等人，1998年)、和Man1均独立于Bqt4(图1——补充图2B). 因此，在NE周围分配Lem2特别需要Bqt4。

Bqt4在网元内具有高度的移动性

Bqt4、Man1和Lem2的不同定位模式，以及Bqt4控制Lem2在NE周围的流动性的观察结果，表明这些NE成分之间和不同NE区域的蛋白质动力学不同。事实上，以前曾报道过NE蛋白的动态变化水平(Ellenberg等人，1997年;Rabut等人，2004年). 为了探索这一点，我们使用光漂白后荧光恢复（FRAP）来评估周转率。图2A显示了一个含有Bqt4-GFP的代表性细胞核。捕获参考“预漂白”图像后，我们对包含NE段的感兴趣区域（ROI）进行了光漂白(图2A). 漂白窗口内的Bqt4-GFP信号在~12秒内恢复(图2B; 半衰期5.029 s）。此外，Bqt4-GFP信号在ROI内的再次出现始终显示出明显的恢复模式；信号不是在整个漂白NE段均匀恢复，而是从侧翼NE边缘到漂白区域中心逐渐出现(图2A)这表明游离的Bqt4-GFP通过NE周围的运动得到补充。虽然NE未漂白部分的Bqt 4可能会不断从核质池中补充，但无法通过与Bqt4的非膜结合池进行交换来解释所述的恢复模式。

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图2。

Bqt4在NE周围调动Lem2。

(A类)FRAP实验的代表性延时序列。”“Pre”显示了在光漂白之前拍摄的控制图像。白色方框表示用于光漂白的ROI。光浸出后立即测量时间0。每2秒采集一次图像。通过测量ROI内像素值的总和，减去背景信号（与ROI大小相同的细胞核旁边的区域），然后除以“Pre”图像中的ROI信号，进行定量。此处和内部的比例尺(C类)表示两微米。(B)对每个相应时间点的成像细胞的归一化荧光强度（如A所述）进行平均，并使用Prism（GraphPad软件）绘制曲线拟合图。y轴表示相对于设置为1.0的“Pre”强度的标准化强度（半衰期5.03 s，n=13）。(C类)表达Lem2-GFP的细胞与A中的细胞一样接受FRAP，但延时间隔增加到15秒。ROI（“Pre”中的虚线框）围绕覆盖可见Lem2-GFP点的区域绘制。Lem2-GFP环围绕着核，其他成像系统可以看到(图1E、F)，在此处使用的特定FRAP系统和设置中无法检测到。数量如所示图3C.

年东北部周围Lem2-GFP水平大幅下降bqt4Δ在这种情况下，cells阻止了FRAP在测量NE周围Lem2周转量时的稳健使用。然而，我们能够测量两种情况下位于SPB下方的Lem2-GFP的周转率重量和bqt4∆细胞。在该地点，Lem2住宅的半衰期不受Bqt4损失的影响(图2C; 半衰期，重量：23.11秒，bqt4∆：23.99秒）。因此，在SPB下方和NE周围的两个不同的Lem2池由不同的机制控制，Bqt4控制远离NE周围的SPB区域分布的Lem2池。

SPB下方的Lem2定位受LINC相互作用蛋白Csi1调节

由于Lem2集中在SPB下方，我们推测LINC复合体控制了该位置的Lem2聚集。Csi1（染色体分离受损蛋白1）与Sad1结合并促进着丝粒与LINC复合体的牢固结合(Hou等人，2012年)，使Csi1成为Lem2定位到此区域的候选调节器。当强烈的Lem2焦点与SPB组件Sid4在重量单元格(Chang和Gould，2000年)，85%的csi1∆细胞，表现为SPB下方缺乏Lem2-GFP点(图3A). 然而，值得注意的是，NE周围的Lem2-GFP环仍然位于csi1∆细胞。因此，Csi1要么招募或稳定SPB下的Lem2。

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图3。

Csi1使Lem2稳定在SPB下方，而Bqt4使Lem2围绕NE移动。

(A类)高分辨率图像（约300 nm横向分辨率）表明，SPB下方的Lem2定位需要Csi1。Lem2-GFP和Sid4-mRFP在所有WT单元中重叠，但在85%的csi1Δ细胞。比例尺表示所有图像中的两微米。(B)删除b季度4+恢复SPB中可检测到的Lem2-GFP点csi1Δ细胞。(C类)如中所述的可见Lem2-GFP点的FRAP图2C。指示菌株的荧光回收率的非线性拟合显示Lem2-GFP在SPB的半衰期缩短bqt4Δcsi1Δ双缺失菌株。半衰期：WT 23.11 s，n=12；bqt4Δ半衰期23.99秒，n=10；bqt4Δcsi1Δ半衰期11.24s，n=18。WT的流动分数（平台）：72%，bqt4∆: 91%,bqt4∆csi1∆: 100%. 适合度(R（右）²)对于WT:0.961，第四季度∆: 0.974,bqt4∆csi1∆: 0.956. 无法在中执行FRAPcsi1Δ由于SPB处缺少可见Lem2，导致出现背景。(D类)表达Bqt4-GFP和Taz1-mCherry的代表性固定细胞的SIM（横向分辨率120–150 nm）图像(E类)Man1-GFP和Taz1-mCherry，以及(F类)Lem2-GFP和Taz1mCherry。插图显示方框区域的放大倍数。(G公司)使用Applied Biosystems softWorX软件，将Taz1和所示蛋白质之间的Co-localization量化为Pearson相关系数。

图3——图补充1。

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通过SIM显微镜同时成像Lem2-GFP和Taz1-mCherry的其他示例。

Lem2和Taz1信号往往不会重叠。定量如所示图3G.

由于Bqt4促进Lem2在NE周围的分布，而Csi1将Lem2集中在SPB下方，我们想知道当这两个因素都缺失时，Lem2将定位在哪里。在缺乏Bqt4和Csi1的细胞中，Lem2-GFP从NE周围的环中显著减少，但在SPB下仍能强烈检测到(图3B). 然而，FRAP分析显示，Lem2的换手率在csi1∆bqt4∆单元格相对于重量或bqt4∆单元格(图3C). 因此，虽然SPB下LINC区域的初始Lem2招募独立于Bqt4和Csi1进行控制，但Csi1需要稳定该区域的Lem2；这种稳定作用是为了平衡Lem2从LINC区域的Bqt4依赖动员。

Bqt4系链端粒和垫子它们在复制时特异性定位

Bqt4与端粒的间期定位有关，端粒在NE形成两到三个簇(Funabiki等人，1993年;Chikashieg等人，2009年). 为了评估端粒是否特异定位于Bqt4区，我们观察了含有各种标记NE蛋白的细胞中的端粒(图3D-F). 与之前的观察结果一致(Dehé等人，2012年;Funabiki等人，1993年)，我们在每个细胞核中观察到两到三个Taz1病灶。图3D显示了包含单个Taz1焦点的单个焦平面；该端粒焦点与Bqt4-GFP共定位(图3D). 相反，端粒与Man1或Lem2的共定位程度明显较低(图3E-G,图3-图补充1). 因此，端粒比富含Man1或Lem2的NE结构域更容易定位于富含Bqt4的结构域。

在相间期，着丝粒定位于NE，在SPB下方形成簇(Funabiki等人，1993年). 在该区域可检测到Lem2的强烈聚焦(图4A)与ChIP实验一致，该实验显示Lem2和着丝粒之间存在相互作用(Barrales等人，2016年;Tange等人，2016年). 为了研究着丝粒-Lem2共定位的排他性，我们观察了内源性mCherry标记的Mis6，一种内部动粒成分(Takahashi等人，2000年). 与之前的观察结果一致(Hiraoka等人，2011年)，SPB下富含柠檬酸的区域内的Mis6螯合物(图4A,图4——补充图1). 相反，Mis6不与Man1同处一地(图4B，以量化图4——补充图1B). 为了观察紧邻动粒区域的着丝粒DNA序列，我们对含有mCherry标记的tet阻遏物（tetR-mCherri）和一系列四环素操作符（tetO）的细胞进行了成像，这些细胞被插入到动粒区域周围国际货币兑换着丝粒I的标记国际货币兑换SPB（Sid4-GFP）在100%的细胞中共定位(图4——补充图1C). 我们还对含有LacI-CFP和一系列Lac算子（LacO）的细胞进行了成像，这些算子与otr系统着丝粒III(丁等人，2004). 与中央相比国际货币兑换，这个远端光电转换管该区域仅在12%的细胞中与SPB共定位(图4——补充图1C); 在大多数细胞中，otr系统出现在SPB附近，而不是叠加在SPB上。因此，中央核心区和国际货币兑换仅局限于SPB区域，而中心周围otr系统序列与远离SPB的NE区域相关联。总的来说，这些观察结果揭示了NE具有独特的微结构域，这些微结构域专门富含Man1、Lem2或Bqt4，并与不同的染色体区域相互作用。

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图4。

Bqt4系链端粒和垫子DNA复制的位点。

(A类)表达Lem2-GFP和Mis6-mCherry的代表性固定细胞的SIM图像，以及(B)Man1-GFP和Mis6-mCherry。插入(B)显示方框区域的放大倍数。(C类)Bqt4调节端粒定位，而Lem2不调节。捕获了含有Tel1L-lacO/I-GFP和Cut3-mCherry（标记NE）的活细胞的快照，测量了端粒和NE之间的距离，并根据核分区分析（见材料和方法）对距离进行分类，其中核体积的外三分之一被视为外围。红色虚线表示核内随机定位的外围分区水平（33%）。Y轴表示端粒-NE距离被归类为I区（距离NE最大距离约为0.22µm的最外围区）的成像细胞百分比。表1显示此处和中数据的统计信息(D–F型). 误差条指示SD。****表示通过学生t检验确定的p≤0.0001。(D类)成像、定量和绘图如C垫子轨迹和剪切3基因被可视化通过lacO/I阵列插入距离小于40 kb；端粒簇被可视化通过塔兹1-m樱桃。(E–F)成像和定量如A所述（n>80）。(G公司)通过对800–1000个细胞进行自动图像分析，利用MATLAB脚本评估所示菌株中Taz1-mCherry和Polα-GFP的定域性，该脚本使用恒定阈值水平检测点并分配定域，并测量到细胞核边缘的距离。箭头表示Polα/端粒共定位的位点。(H（H）)G的数据按C所述绘制。

图4——图补充1。

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NE蛋白与着丝粒和着丝粒周围共定位的成像和定量。

(A类)携带Lem2-GFP和Mis6。白色箭头表示同位化。(B)所有表达Lem2-GFP和Mis6-mCherry的细胞都显示出这两种荧光信号的共定位，而只有10.5%表达Man1-GFP和Mis6-mCharry细胞显示出共定位。按中所述捕获SIM卡图像图1. (C类)使用时间推移显微镜对带有标记SPB（Sid4-GFP）和标记着丝粒I（lacO/I-RFP插入中央核心序列的左端）的细胞进行成像，并测量着丝粒和SPB之间的距离。图中显示SPB和着丝粒I之间距离为0µm的细胞百分比（红色条，100%）。此外，还对含有lacO/I-CFP的细胞进行了成像，这些细胞距离着丝粒III的着丝粒周重复序列10 Kb，并绘制了该着丝粒周围位点与SPB（Sid4-mRFP）之间的距离（蓝色条）。(D类)端粒与NE连接不需要异染色质。重量和clr4Δ对带有标记的Tel1L的细胞进行成像，如图4C.Tel1L仍位于clr4Δ与类似级别的单元格重量细胞。成像、定量和绘图按照图4.

Bqt4介导的NE定位对端粒的特异性可能源于其异色性(库珀等人，1997年). 然而，含有H3K9me的异染色质对于端粒与NE的连接是不必要的，因为clr4Δ单元格(图4：补充图1D). 因此，尽管氯丁橡胶4+已报告删除以使垫子轨迹(Alfredsson-Timmins等人，2007年)，端粒以H3K9me-独立的方式与NE相连。这与观察结果一致taz1Δ端粒中的沉默和H3K9甲基化大大减少，但仍保留NE定位(Zaaijer等人，2016年).

端粒和着丝粒相对于Bqt4和Lem2的独特定位模式促使我们探索Bqt4-和Lem2-微域的功能意义。首先，我们以细胞形状为指标，研究端粒定位与细胞周期阶段的关系。有丝分裂核分裂后不久，分裂酵母细胞在胞质分裂完成之前经历S期；因此，双核细胞处于早期/中期S期。随着细胞从晚期S期进展到G2期，胞质分裂产生两个单核子细胞。因此，我们将间期双核细胞划分为早/中期S期，将单核细胞划分成晚期S/G2。左侧端粒1（Tel1L）通过整合在草皮2+轨迹(丁等人，2004)在表达LacI-GFP的细胞中的着丝粒近端近端亚粒区（距染色体末端约50 Kb）(丁等人，2004)，以下称为Tel1L-lacO/I-GFP。通过用mCherry标记NE蛋白Cut11来观察NE，以测量Tel1L-lacO/I-GFP与NE之间的距离。外围区被定义为核体积的外三分之一；一个随机定位的序列将在约33%的细胞中定位于该区域(Meister等人，2010年); 所有测量的统计数据如所示表180%重量设置，Tel1L定位到核外围(图4C)无论是早期/中期S期还是晚期S/G2。这种定位以依赖细胞周期的方式被破坏bqt4∆细胞。而Tel1L在S早期/中期约60%处于外围bqt4∆细胞，在S/G2晚期大量移位，仅约48%定位于NE(图4C). 因此，与S期早期相比，在S/G2晚期，Bqt4在定位NE端粒方面的作用更为显著。

表1。

染色体定位数据的统计意义图4.

n个₁和n₂表示来自两个生物复制品（独立菌株）的细胞中得分位点的总数。P（P）来自双尾Student t检验的值表明了区域1中观察到的位点数量与预期随机分布之间的差异的显著性。

基因座基因型	早/中	延迟S/G
电话1L 重量	n个₁=112，，n₂ = 93 对<0.000001	n个₁=151，n₂ = 180 对<0.000001
电话1L bqt4Δ	n个₁=110，n₂ = 103 对<0.000001	n个₁=143，n₂ = 112 第页=0.00986
电话1L lem2Δ	n个₁=110，n₂=86 对<0.000001	n个₁=96，n₂ = 160 对<0.000001
垫子重量	n个₁=55，n₂ = 49 第页=5× 10⁻⁵	n个₁=85，n₂ = 95 第页=1× 10⁻⁵
垫子 bqt4Δ	n个₁=70，n₂ = 52 第页=0.79551	n个₁=91，n₂ = 90 对<0.0001
*剪切3* 重量	n个₁=86，n₂ = 73 第页=0.0459	n个₁=57，n₂ = 113 第页=0.97412
*剪切3* bqt4Δ	n个₁=94，n₂ = 90 第页=0.99545	n个₁=78，n₂ = 125 第页=0.99801
塔兹1 重量	n个₁=51，n₂ = 74 对<0.000001	n个₁=85，n₂ = 87 对<0.000001
塔兹1 bqt4Δ	n个₁=67，n₂ = 93 对<0.000001	n个₁=88，n₂ = 86 第页=5× 10⁻⁵
电位计1 重量	n个₁=79，n₂ = 65 对<0.000001	n个₁=54，n₂ = 68 对<0.000001
电位计1 bqt4Δ	n个₁=64，n₂ = 96 对<0.000001	n个₁=59，n个₂ = 81 第页=0.0293
电位计1 taz1Δ	n个₁=60，n₂ = 63 对<0.000001	n个₁=88，n₂ = 96 对<0.000001
电位计1 taz1Δbqt4Δ	n个₁=65，n₂ = 100 第页=0.00025	n个₁=64，n₂ = 149 第页=2× 10⁻⁵
垫子 swi6Δ	n个₁=72，n₂ = 60 第页=1×10⁻⁵	n个₁=103，n个₂ = 120 第页=2× 10⁻⁵
垫子 swi6Δbqt4Δ	n个₁=77，n₂ = 75 第页=0.0002	n个₁=100，n₂ = 59 第页=0.0459

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由于Lem2在一个bqt4Δ设置，我们检查了端粒定位柠檬2∆细胞。与…对比bqt4Δ细胞，Tel1L在整个细胞周期中保持在外围lem2Δ单元格(图4C). 因此，在bqt4Δ设置不是端粒连接位点丢失Lem2的功能。在缺乏Bqt4或Lem2的情况下，着丝粒仍位于SPB下方（数据未显示）。因此，Lem2在染色体位点系留中的任何作用与其他机制是多余的(Barrales等人，2016年).

为了确定所有端粒是否共享Tel1L定位规则，我们监测了直接与所有端粒结合的内源性标记和功能性Taz1-GFP。Taz1强烈定位于外围，仅在S/G2晚期无Bqt4时才离域(图4D). 交配型轨迹(垫子)是另一个位于NE的显著基因组区域(Alfredsson-Timmins等人，2007年;Noma等人，2006年). 为了确定这种定位是否需要Bqt4，我们使用了lacO/I数组插入的菌株垫子。虽然在S期和G2期均观察到外周定位重量细胞，垫子在S阶段早期/中期从NE移出bqt4Δ单元格(图4D). 这种迁移是暂时的，因为垫子在S/G2后期重新调整到NE。相反，控制菌株在常染色位点附近有lacO/I阵列(剪切3)在第二染色体的左臂上（Chr II）(Ding等人，2004年)显示了两个核的随机位置重量和bqt4∆设置(图4D).

这个垫子基因座在S期早期复制，而端粒在S期晚期复制(Hayano等人，2012年;Hayashi等人，2009年;Kim等人，2003年). 端粒复制中的时间不一致与这个垫子基因座与这些基因座从核外周移位的时间不一致有关bqt4∆设置。因此，我们假设Bqt4对于在DNA复制过程中特异性地系留这些位点是必要的。为了评估这种可能性，我们通过删除编码Taz1的基因来消除端粒复制的晚期特异性；在一个taz1Δ背景，端粒在整个细胞周期中复制(Dehé等人，2012年;Tazumi等人，2012年). 我们可视化了taz1Δ通过GFP标记庇护蛋白组分Pot1或Tpz1的端粒，其结合ss端粒悬突并在缺乏Taz1的情况下保持端粒定位(鲍曼和切赫，2001年;Miyoshi等人，2008年). 在一个塔兹1+背景，Pot1-GFP病灶在S期早期和S／G2期晚期均定位于NE(图4E)并在S/G2后期被逐出b季度4删除。相反，在bqt4∆taz1∆在端粒复制时间被解除调控的情况下，在监测的所有阶段都会发生端粒移位(图4E). Taz1去局域化的晚期S/G2依赖性更为明显(图4D)与Tel1L非本地化(图4C)在没有Bqt4的情况下，可能反映了Tel1L与染色体末端的距离；Tel1L可能会比终点稍早复制。Taz1还通过重复的端粒DNA促进复制叉的传递(Miller等人，2006年); 因此，虽然Taz1的缺失促进了端粒复制的启动，但它也阻碍了复制的完成(Miller等人，2006年). 一直以来，端粒在整个S/G2期都处于错位状态bqt4∆taz1∆背景。

Swi6在垫子基因座，并通过促进复制起始因子Sld3的补充而导致早期复制(Hayashi等人，2009年). 虽然Swi6也结合端粒异染色质，但端粒的复制时间由Taz1独立于异染色素/Swi6设置。Swi6的特殊作用使我们能够检查垫子位点及其复制状态。在swi6∆细胞，垫子仍然与NE相连(图4F)，消除了Swi6本身可能影响系留的可能性。然而，在swi6∆bqt4∆单元格垫子在S/G2晚期，该位点随后移位(图4F). 因此，Bqt4是端粒系留和垫子当这些系留位点被复制时。

通过标记的复制因子，如DNA聚合酶α（Polα）的催化亚单位，可以可视化复制DNA的亚核定位(Meister等人，2007年;夏目漱石等人，2008年)，其定位于被认为是活性DNA复制位点的病灶。在S/G2后期，在东北部观察到一个或两个这样的复制病灶(Meister等人，2007年;夏目漱石等人，2008年). 为了检测端粒是否与这些晚期复制病灶共定位，我们使用了同时表达Taz1-mCherry和Polα-GFP的细胞。图4G显示S/G2晚期具有代表性的细胞核。在所示的z平面上可以看到三个强度相似的Taz1焦点；第四个Taz1焦点强度较小，因为它代表不同z平面上的离焦端粒。利用核内的荧光背景来近似其边界，我们计算了共聚点相对于核外围的位置(图4H). 与公布的数据一致(Meister等人，2007年)，我们观察到端粒和NE复制灶之间的显著共定位重量细胞。相反，虽然Taz1和Polα在缺乏Bqt4的情况下表现出共定位，但这种共定位并不发生在NE(图4H)，再次表明端粒在外围复制的趋势需要Bqt4介导的系留。

Bqt4是S期抗DNA损伤剂所必需的

Bqt4在定位复制端粒和垫子向NE提出了这样一个问题，即这种本地化对于其复制是否重要。为了解决这个问题，我们研究了b季度4+DNA复制相关过程中的缺失。Bqt4是细胞抵抗S期诱导DNA损伤的药物所必需的，如bqt4Δ细胞对羟基脲（HU）和甲基磺酸甲酯（MMS）均过敏；图5A); 相反，Bqt4对博莱霉素无抵抗力，博莱霉素诱导的DNA损伤与DNA复制无关(Manolis等人，2001年)微管失稳剂噻菌灵(图5B,图5——图补充1A). 这些结果表明，需要Bqt4本身和/或Bqt4-介导的NE系留来实现稳健的DNA复制。为了描述这些可能性，我们利用了Bqt4跨膜结构域缺失的菌株-∆TM）；Bqt4ΔTM已显示出从东北向离域并扩散到整个核内部(Chikashige等人，2009年). GFP-Bqt4-ΔTM与b季度4+当GFP-Bqt4单独存在时(图5——补充图1B)，表明需要对Bqt4进行NE定位以抵抗MMS。

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图5。

Bqt4是抵抗复制过程中破坏DNA的试剂所必需的。

(A–C)在含有HU、MMS或博莱霉素的培养基上压印五倍于所示菌株对数期培养物的连续稀释液（见材料和方法）。为了控制博来霉素的有效性，我们使用了端粒酶缺乏的、具有圆形染色体的存活细胞，之前证明是博来霉素超敏的(Jain等人，2010年).

图5——图补充1。

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需要对Bqt4进行NE定位以抵抗MMS，但不需要TBZ。

(A类)Bqt4的跨膜结构域（在全长Bqt5的情况下）是抵抗MMS的必要条件。添加GFP-Bqt4，而不是GFP-Bqt4ΔTM，可以缓解MMS敏感性bqt4Δ细胞。重复的行表示相同基因型的独立菌株。(B)bqt4Δ细胞对微管稳定药物噻菌灵（TBZ）不敏感。b季度4然而，缺失确实会导致合成TBZ敏感性dcr1Δ。 如预期(Reddy等人，2011年;Reyes-Turcu等人，2011年;Trewick等人，2007年),环境保护计划1缺失可挽救小鼠的生长缺陷和TBZ超敏反应dcr1Δ细胞以及dcr1Δbqt4Δ细胞。

我们想知道bqt4Δ细胞来源于Bqt4系留区域的异色性，在这种情况下，H3K9甲基化的废除由第4类+删除将抑制损伤敏感性。然而，clr4Δ赋予合成致命性bqt4Δ在彩信上(图5C). 因此，Bqt4和Clr4在控制MMS抗性方面发挥着独立的冗余作用。这表明，当Bqt4相互作用的染色体区域被转录去表达时，定位变得特别重要；这些难以复制区域的转录增强可能导致过度的转录/复制冲突，导致严重的MMS超敏反应。

Bqt4和Lem2微环境调节端粒和着丝粒异染色质

过敏性bqt4Δ细胞对挑战DNA复制的试剂，以及Bqt4系留染色体区域的异色性，提出了异染色质是否因Bqt5缺失而改变的问题。为了评估这一点，我们创建了一些菌株，在这些菌株中，染色质被诱导远离Lem2和Bqt4微域。鉴于我们观察到Lem2集中在SPB下方，而Man1和Bqt4在NE周围占据不同且基本上不重叠的位置，我们试图将复制染色质转移到富含Man1的区域。通过将Man1的C末端与GFP结合蛋白（GBP）融合，实现异位栓系系统(Dodgeson等人，2013年)，然后与mCherry融合。Man1-GBP-mCherry位于东北部(图6A)和未修改的Man1一样。为了将复制DNA连接到Man1-GBP-mCherry，我们利用Polα-GFP(Damagnez等人，1991年)，充分补充了重量Polα函数(Meister等人，2007年) (图6——图补充1). 在缺乏GBP的细胞中，Polα-GFP在S期早期在细胞核内呈弥漫性定位(图6B). 相反，Polα-GFP在NE周围的S期细胞中积聚，其中含有Man1-GBP(图6A). 为了检测活性DNA复制的位置，我们可视化了单链DNA结合RPA（复制蛋白A）成分Rad11，它定位于复制叉（以及DNA损伤部位）。在缺乏GBP的细胞中，在S期整个细胞核可见多个Rad11病灶，而Rad11信号在非复制细胞中扩散(图6-图补充2A) (Zaaijer等人，2016年). 相比之下，在几乎所有Man1-GBP/Polα-GFP细胞中，Rad11病灶与周边定位的Polα-GFP共定位(图6-图补充2B)表明DNA复制的大部分发生在Man1微域；引入Polα-GFP后，在Man1-GBP背景下，Taz1-Man1共定位也会增加(图6补充图2C-E)表明端粒复制从Bqt4微域转移到Man1域。因此，这种方法使我们能够研究诱导大量DNA复制发生在不同于富含Lem2和Bqt4的位点的外围的效果。

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图6。

Bqt4丰富的结构域确保了异染色质的忠实遗传。

(A类)设计用于将复制叉移动到NE的系统示意图。Polα-GFP和Man1-GBP的共表达将Polα相关（复制）染色质招募到NE富含Man1的亚结构域。下图显示Polα-GFP的再活化，以与围绕细胞核的Man1-GBP-mCherry共定位。(B)在缺乏Man1-GBP的细胞中，Polα-GFP在核内部呈弥散分布。(C类)按照文本和方法中的描述，使用H3K9Me2抗体（ab1220，Abcam）进行ChIP-seq实验。(D类)H3K9Me在ade6+三个独立WT菌株的基因座。蓝色实线表示中间带；带状物的宽度表明了三个分离物的富集水平范围。(E–F)H3K9Me2在Chr III着丝粒富集的带状线图。中心核心区由黄色方框表示。核心区域两侧的尖峰(F类)与基因组中多个区域中存在的小重复区域（~25bp）对齐；因此，不可能确定其来源。

图6——图补充1。

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Polα上的C末端GFP标签不会干扰着丝粒沉默。

显示了所示菌株的五倍系列稀释液。While期间重量细胞表达尿酸4+在缺乏尿嘧啶的介质上生长，在FOA的存在下无法生长，尿苷-D18细胞不能在-URA上生长，但在FOA上生长。窝藏细胞尿酸4+在着丝粒国际货币兑换率基因座因沉默而在FOA上生长国际货币兑换率; 这些细胞在-URA上也表现出部分活性丧失，这也是由于国际货币兑换率沉默。这种沉默在携带Polα/Swi7-GFP的细胞中是完整的。

图6——图补充2。

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Man1-GBP将Polα-GFP和端粒复制到富含Man1的结构域。

(A类)三位代表重量细胞核内可见Rad11-mCherry的细胞（活细胞的单个Z平面图像）。(B)每行显示一个代表性活细胞，表达Polα-GFP Man1-GBP和Rad11-mCherry（细胞核的单个Z平面图像）。Polα-GFP再活化到NE，形成荧光环。Rad11也似乎再活化到了NE，与之相比，细胞核内部的细胞可检测到的Rad11-mCherry信号更低重量单元格（与A比较）。(C类)Taz1倾向于局限于Man1贫乏区域（以(E类))在中重量设置。在DeltaVision显微镜上进行成像。(D–E)在包含Man1-GBP/Polα-GFP系留系统的细胞中，Taz1/Man1重叠的频率增加。(D类)中的图像(C类). (E类)使用Applied Precision softWorX软件确定了定义Taz1-mTurquoise和Man1-GBP-mCherry之间共定位程度的Pearson相关系数。虽然在wt情况下Taz1很少与Man1共定位，但GBP介导的Polα-GFP招募会将端粒复制到Man1位点。

为了检测富含H3K9me2的异染色质的变化，我们使用了一种改进的ChIP-Seq协议，该协议要求在每个样本中加入来自一个菌株的染色质，该菌株的内源性ade6+基因已被删除并异位插入到着丝粒I的着丝粒周异染色质中。由于所有使用的实验菌株都只含有单一的内源性拷贝ade6+位于常染色区域(Cam等人，2005年)异位发出的信号ade6+用作常量引用。H3K9me2富集水平归一化的方法与之前描述的ChIP-Rx方法类似(Orlando等人，2014年). 我们以1:4的比例将参考（穗）菌株的液体培养物与每个实验培养物样品混合(图6C). 然后将所得加标样品交联并处理以用于ChIP。图6D显示H3K9me2在ade6打开阅读框，确认我们在指定峰值比率下检测峰值读数的能力。为了验证这种规范化方法，我们比较了三种独立的重量三个独立菌株dcr1Δ已知菌株的中心周围H3K9me2水平显著降低(霍尔等人，2002年;Volpe等人，2002年). 在标准化为在ade6位点（输入无标准化），覆盖异色着丝粒的阅读数在重量菌株(图6E). 相反，缺乏Dicer的菌株(霍尔等人，2002年;Volpe等人，2002年)彼此相似，但相对于重量在着丝粒周围区域(图6E). 因此，归一化峰值足以消除多个样本中引入的技术差异。

如上所述，对携带Man1-GBP和Polα-GFP的细胞进行ChIP-Seq。Man1-GBP-Polα-GFP细胞中所有着丝粒周围区域的读取覆盖率相对于重量(图6F). 因此，通过诱导着丝粒在远离Lem2微区的Man1区域复制，着丝粒异染色质的维持受到影响。除了加强之前关于Lem2在中心周围异染色质维持中的作用的观察外，这些数据与我们的观察一致，即Man1微域在空间上与Lem2微域不同。

为了评估NE-最大复制对粒下异染色质的影响，我们对三个独立的bqt4Δ分离物。在一个重量背景，靠近Chr I左端的35 Kb区域富含H3K9me2(图7A). 在缺乏Bqt4的情况下，H3K9me2水平在该亚砾岩区升高(图7A); 亚端粒2L也显示H3K9me2在bqt4∆设置(图7B). 此外，在端粒异染色质和常染色体臂之间的边界处，H3K9me2的富集明显减少重量细胞，这种独特的H3K9me2过渡区在bqt4Δ细胞中额外的H3K9me2峰延伸到相邻的常染色区域。其他染色体末端的端粒近端区域也显示出缺陷的H3K9me2组织(图7-图补充1A). 然而，非同向异色区域，例如我的4基因（来自Tel2L的1.4 Mb）(Zofall等人，2012年)，在没有Bqt4的情况下显示正常的H3K9me2剖面(图7-图补充1B). 与亚砾岩相比，中心周围H3K9me2富集度略有降低b季度4+删除(图7-图补充1A)和H3K9me2在垫子轨迹大大减少(图7-图补充2A).

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图7。

Bqt4确保在球下区域适当维持异染色质。

(A–B)ChIP-seq实验（H3K9Me2），每个基因型有三个独立的菌株。打印注释，如中所述图6D. (C类)含有指定基因型和尿酸4+基因从II号染色体右端插入约7 kb。这两个bqt4Δ行包含两个独立分离物的培养物。(D类)按照C中所述进行的实验，有五个独立的bqt4Δ分离物。(E–F)覆盖第二章左端的ChIP-Seq数据如所述绘制图6D. (G公司)Chr III着丝粒区域的ChIP-seq数据。

图7——图补充1。

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Bqt4调节中心周围和球下区域的H3K9Me2水平，但不调节美4+轨迹。

ChIP-Seq数据对比WT（蓝色）和bqt4Δ（红色）单元格位于(A类)第二染色体的右端(B)我的4异染色质岛，以及(C类)Chr III着丝粒。

图7——图补充2。

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Bqt4影响mat处的沉默，但不影响远侧基底膜下的沉默。

(A类)Bqt4调节H3K9Me2水平垫子轨迹。ChIP-seq覆盖范围垫子WT（蓝色）和bqt4Δ（红色）单元格。这个中央H区域（紫色方框）与中央H着丝粒周围区域内的序列；因此，不可能在此处将覆盖范围分配给垫子基因座；这个区域被遮住了，可以清楚地看到该区域的其余部分(Pickrell等人，2011年). H3K9Me2在着丝粒的富集程度高于垫子轨迹（将y轴与图7-补充图1). (B)与公布的数据一致(Chikashige等人，2009年)，删除b季度4不会影响位于距离端粒约500bp处的基因的沉默。上图显示了所用菌株的基因型他的+和尿酸4+基因分别插入Chr I和Chr II的末端。在32°C下生长的过夜培养物进行计数并稀释，然后将100个细胞一式三份放在指定的培养基上。生长的菌落在这里被计数并表示为形成菌落的平板细胞的百分比。误差条表示三份板之间的差异。重量异位时细胞在缺乏尿嘧啶或组氨酸的培养基上不能形成集落ura4型+和他的3+基因沉默。clr4Δ由于失去沉默，细胞在缺乏尿嘧啶或组氨酸（绿色和黄色条）的培养基上形成集落。bqt4Δ单元格，类似于重量细胞不能在-URA或-HIS上形成集落，表明对ura4型+和他的3+.

为了通过生理测试来探测我们的ChIP-seq观察结果，我们利用了一株含有尿酸4报告基因从染色体末端插入7 Kb(图7C). 这个异位的尿酸4已知该基因受Swi6转录抑制和结合重量单元格(Kanoh等人，2005年)，导致缺乏尿嘧啶（-ura）的媒体增长缓慢。相同的重量该菌株在含有尿嘧啶和5-氟尿酸（FOA）的培养基上表现出强劲的生长能力，这对表达ura4型。这在很大程度上是正确的bqt4Δ设置，而缺少Swi6的细胞显示出预期的尿酸4然而，在比较重量和bqt4∆-ura菌株；这个bqt4∆菌株生长更差，表明对尿酸4表达式。在类似的实验中，使用具有尿酸4从染色体末端插入11 Kb(图7D)，我们发现尿酸4压制，与之前的观察结果一致(Kanoh等人，2005年). 然而，五个国家的增长差异很大bqt4∆分离株，其中一株表现出与重量（ura较差，FOA稳健）和3bqt4∆隔离(图7D，第4-6行）显示-ura和FOA的增长强劲，表明杂色增强。因此，着丝粒越近尿酸4在没有Bqt4的情况下，记者被抑制，但可以在选择尿酸4原营养化。因此，Bqt4对亚群沉默是不必要的，但亚群沉默的程度和稳健性都受到Bqt4.的存在的限制。与亚群相比，Bqt4似乎不调节端粒区域的沉默（距染色体末端约500 bp；图7-图补充2B).

为了确定Bqt4对端粒异染色质的影响是否通过与Bqt4-相邻微环境的连接介导，我们检测了含有Man1-GBP和Polα-GFP的诱导连接菌株中H3K9me2在端粒的富集。在这些菌株中，Bqt4存在，但DNA复制被诱导发生在远离Bqt5微域的地方。在Tel2L，相对于重量(图7E); 其他子集团也是如此。此外，边界区域似乎受到类似于bqt4Δ设置。因此，端粒在邻近Man1而非邻近Bqt4的微结构域中的复制导致H3K9me2维持的失调。

由于Man1附近的诱导复制同时影响着着丝粒下和着丝粒H3K9me2，我们试图解决着丝粒水平降低是由于着丝粒上的增加所致的可能性。为了在不改变中心周围定位的情况下将端粒区域连接到Man1，我们对表达Rap1-GFP和Man1-GBP的细胞进行了ChIP-seq；在这种情况下，Rap1结合的端粒将定位于Man1结构域，而着丝粒复制不受影响。在Man1-GBP/Rap1-GFP细胞中，Man1-GBB/Rap1-GFP细胞亚集团H3K9me2的增加程度与Man1-GBP/Polα-GFP细胞相似(图7F). 在这种情况下，中心粒H3K9me2峰值振幅略有降低，但与Man1-GBP/Polα-GFP情况下的降低相比，这种降低很小（相比之下图6F具有图7G). 因此，我们怀疑，虽然由于亚集团H3K9me2水平增加而产生的滴定效应对诱导Man1附近复制的近中心效应有一定贡献，但在Man1-GBP/Polα-GFP方案中至少部分空出的Bqt4微域直接调节近中心复制。

在缺乏Dcr1的情况下，Lem2和Bqt4对生存能力至关重要

上述结果概述了Lem2-和Bqt4-相邻微结构域的异染色质复制和组装功能，但也证明了Bqt4调节Lem2本身。为了深入了解Lem2-和Bqt4介导的染色质调节的机制，我们通过构建双突变和三突变菌株来检测一系列遗传相互作用。

这个lem2∆和dcr1∆单个突变细胞的生长相对于重量(图8A). 失去抗静电系数Epe1恢复重量生存水平dcr1Δ但不是lem2Δ细胞，表明Lem2在一条不依赖异染色质维持的途径中发挥作用，以提高生存能力。此外，双重删除lem2Δdcr1Δ显示出活性显著降低，表明Lem2作用于与Dicer介导的途径分离（且与Dicer-mediated途径冗余）的途径以提高活性。因此，删除环境保护计划1禁止lem2Δdcr1Δ不可见，但不能达到epe1Δdcr1Δ应变，应变(图8A). 如下文所述，这些结果以及我们的ChIP-seq和定位数据表明，Lem2在着丝粒周围异染色质维持和着丝粒/动粒维持中都起作用，当受到损害时，这将使Dicer成为必需的(Folco等人，2008年;Klutstein等人，2015年). 与这个想法一致，我们发现我们无法获得含有柠檬2+Cenp-a的一个温度敏感等位基因缺失(中国核电站1-1)在任何温度下(Takahashi等人，2000年). Cenp-A加载因子Ams2的过度表达可以缓解中国核电站1-1(图8B) (Chen等人，2003年)，并且过表达的Ams2的引入确实赋予了有限的（尽管相对于柠檬2+)生存能力lem2Δcnp1-1允许温度（32°C，图8B). 然而，柠檬2+删除取消对中国核电站1-1Ams2过表达的温度敏感性(图8B).

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图8。

遗传分析显示Bqt4和Lem2在促进细胞存活中的作用。

(A类)将所示菌株的五倍连续稀释培养物在32°C的富培养基（YE5S）上培养。(B)携带温度敏感等位基因的细胞的生长中国核电站1号机组+(中国核电站1-1)有无过度表达(国家标准41-对照组）Ams2用25℃和32℃培养的五倍连续稀释培养物进行评估。(C类)按照中所述进行活力测定(A类).

与Lem2或Dcr1相比，仅Bqt4的缺失不会影响未受干扰条件下的生长(图8C). 然而，bqt4Δ和dcr1Δ患有综合性疾病bqt4Δlem2Δ单元格不可见（未显示数据）(Tange等人，2016年). 因此，在缺乏Lem2或Dcr1的情况下，Bqt4对生存能力至关重要。下面我们提出一个模型，其中Bqt4定义了在转录/复制冲突（在dcr1Δ; (Kloc等人，2008年;Zaratiegui等人，2011年)而Lem2在动粒维持中起作用。Dicer通过促进RNAP2移位和异染色质形成与这两个过程交叉。

讨论

在这里，我们描述了核外围生化上不同的微环境，具有不同的调节着丝粒和端粒染色质复制的能力(图9). 除了SPB下的富Lem2-结构域外，这些微环境还包括富Man1-结构域和单独的富Bqt4-结构域。Bqt4调节特定染色体区域的复制通过两种可分离的模式：首先，Bqt4微域通过系留特定异色区，促进DNA复制的保真度和异染色质在复制叉之后的重组。其次，Bqt 4动员Lem2到NE周围的位点，促进中心周围异染色素的维持。我们的结果也表明Lem2具有可分离的作用；被隔离在SPB下的Lem2分子子集影响CenpA负载和动粒维持，而Bqt4动员的Lem2分子子集促进中心周围异染色质维持。总的来说，我们的数据表明，Bqt4的中心功能是在细胞核内提供一个“安全区”，在这个安全区内促进难以复制的重复序列及其潜在染色质的复制。

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图9。

Lem2-和Bqt4-微域的作用模型。

(A类)Lem2（黄色椭圆）存在于两个种群中，最集中的部分位于SPB下方，其中Lem2由Csi1稳定。Lem2组分促进着丝粒中央核心（核心）的动粒维持（右插入）。Lem2也被Bqt4（绿色卵形）动员到远离SPB（左插图）的位置，在那里它起着中心周围复制和沉默的作用。(B)Bqt4定位于东北附近的不同地点，其中一些与Lem2重叠，而另一些则不重叠；Bqt4很少与Man1重叠（蓝色椭圆）。Bqt4微域是重复异色序列、着丝粒周围（Lem2重叠区域）、端粒和垫子位点（位于非Lem2重叠区域）可以复制，而不会遭受过度复制/转录碰撞，可能通过排除RNAP2或浓缩Pfh1解旋酶（红色停止符号，左插入）；这些安全区还促进了中心周围、亚中心和垫子异染色质（右插图）。

虽然已知Bqt4能将端粒连接到NE，但我们发现这种连接作用是端粒复制过程中特有的；冗余路径显然能够将非复制端粒连接到NE。可以想象，Bqt4沿着NE相对较高的流动性允许在端粒释放和调节复制体时灵活地与端粒保持接触。由于Bqt4还系住垫子基因座在复制过程中，我们推断多个基因座，可能所有重复和/或异色基因座都是以这种方式调控的。然而，很明显，并不是所有的基因座都受到Bqt4的控制，就像我们研究的常染色体臂基因座一样(剪切3+)未显示NE富集或Bqt4依赖性定位。可以确定Bqt4与非对合位点相互作用的特异性通过其N末端DNA结合域，显示与真菌转录因子家族的同源性；或者，通过与端粒Taz1-Rap1-Bqt4相互作用类比，Bqt5可能与垫通孔其他DNA结合蛋白。

Bqt4微结构域对于细胞抵抗复制过程中导致DNA损伤的因子非常重要。我们提出了一个模型，在该模型中，这种敏感性源于Bqt4与NE相连的染色质区域（如端粒）的损伤。事实上，这些重复区域对复制机器来说尤其具有挑战性(Miller等人，2006年)HU或MMS可能会加剧这些区域停滞和/或崩溃的分叉水平。特别是，我们认为富含Bqt4的结构域是一种特殊的微环境，在这种微环境中，复制和转录机制之间的冲突得到了强有力的处理或避免。这种碰撞在端粒邻近rDNA区域是一种已知的危险，并且在所有转录水平较高和/或复制停滞的区域更容易发生。The synthetic lethality ofb季度4+和氯丁橡胶4+关于MMS的研究表明，当含有H3K9me的异染色质被废除时，由此产生的转录增加增加了与复制体碰撞的危险，进而增加了对Bqt4介导的系链的需要。一直以来，Bqt5对生存能力至关重要，即使在未受干扰的条件下，当Dicer，已经证明它可以促进复制应激位点的转录终止通过RNAP2的清除丢失。Bqt4微结构域是重复区域复制的“安全区”这一概念可以解释我们最初的观察结果，即Bqt4在HAATI细胞中变得重要，其中rDNA重复形成所有染色体末端，导致细胞携带的rDNA平均比重量细胞。

富含Bqt4的区域的特性使其适合避免复制/转录冲突，但这些特性仍有待确定。这些区域可能排除RNAP2或集中Pif1解旋酶，从而允许复制通过转录机制(Sabouri等人，2012年). 端粒复制过程中，端粒转录物（TERRA）的积累被特异性降低(阿扎林和林纳，2015年); 可以想象，这种减少依赖于对Bqt4丰富域的定位。

我们的显微镜显示了着丝粒核和着丝粒周区域的不同定位模式；着丝粒核心与SPB下方的Lem2共定位，而周着丝粒定位在一微米以外，可能与非SPB相邻的Bqt4依赖的Lem2位点共定位。因此，Bqt4对中心周围异染色质维持的影响可能源于这些SPB远端位点的Lem2的损失。然而，由于Bqt4和Lem2具有综合致死性（未显示数据和(Tange等人，2016年)，它们显然是由任一蛋白质唯一调节的额外通路所必需的。我们观察到的强合成相互作用lem2Δ和中国核电站1-1表明Lem2调节着丝粒核心的Cnp1维持。Cnp1维持受损将需要强大的中心周围异染色质，这是在着丝粒序列中建立Cnp1所必需的(Folco等人，2008年); 当Bqt4授予的复制“安全区”丢失时，此建立功能可能会受到影响。在着丝粒周围，复制/转录冲突的可能性很严重，需要RNAi介导的RNAP2释放来防止停滞的分叉，从而促进异染色质遗传(Kloc等人，2008年;Zaratiegui等人，2011年). 因此，我们建议在lem2Δdcr1Δ双突变体，一个“完美风暴”的因素严重干扰了生存能力；Cnp1的维持受到损害，该区域的复制存在很大问题，中心周围异染色质被废除，不允许动粒建立和动粒维持。这些考虑也可能是完全不可见的lem2Δbqt4Δ单元格（未显示数据）(Tange等人，2016年).

类似的复制挑战可能会改变异染色质在bqt4Δ亚群；此外，通过释放限制性异染色质因子，受损的着丝粒周围异染色素可能有助于H3K9me2水平在bqt4Δ子集团(Tadeo等人，2013年). 我们注意到b季度4+中心周围和近球形H3K9me2水平的缺失是细微的。同样，Bqt4的丢失也不能使微管解聚剂噻苯达唑（TBZ，图5——图补充1A)与Dcr1缺失形成对比，Dcr1的缺失导致TBZ超敏反应，这是由于着丝粒周围异染色质的缺失所致(Provost等人，2002年). 因此，虽然中心周围异染色质水平因Bqt4的丢失而降低，但它们足够高，可以防止中心周围粘连蛋白水平降至控制TBZ敏感性的临界阈值以下。

虽然我们的工作揭示了一对特定微结构域在调节不同染色质区域中的作用，但我们假设这反映了不同的NE亚结构域在影响其他位点染色质结构和功能方面的更广泛作用。在哺乳动物基因组中，细胞核微环境的有序形成更为关键，因为它们在染色体长度上发现了更高比例的重复序列和不同的染色质类型(Akhtar等人，2013年;Gerhardt等人，2016年;Simonis等人，2006年;Zullo等人，2012年). 对于难以复制的染色质区域，存在不同的核亚结构域，其特定的分子组成适合于与不同染色质亚型的相互作用，可能会协调每个亚型复制的保真度，确保整个染色体在遗传和表观遗传信息完整的情况下遗传。

材料和方法

关键资源表

试剂类型（种类）或资源	任命	来源	标识符	其他信息
化合物	噻苯扎多	Sigma-Aldrich公司	类别号T8904
化合物	甲基磺酸甲酯	Sigma-Aldrich公司	分类号66-27-3
化合物	5-氟代酸	美国生物	类别号207291-8-4
化合物	硫酸二氢诺色霉素	美国生物	分类号N5374-74
化合物	G418硫酸盐（基因素）	Invitrogen公司	货号11811031
化合物	湿霉素B	Invitrogen公司	分类号10687010
化合物	羟基菌属	Sigma-Aldrich公司	类别号H8627
显微镜试剂	玻璃底碟	MatTek公司	类别号P35G-1.5–14 C
显微镜试剂	GFP助推器_ATTO488	科莫特克	分类号gba488-100
显微镜试剂	RFP助推器_ATTO594	科莫特克	类别号rba594-100
显微镜试剂	Vectashield公司	矢量实验室	类别号H-1000
显微镜试剂	16%多聚甲醛水溶液	电子显微镜科学	货号15710
显微镜试剂	8%戊二醛	电子显微镜科学	分类号16019
显微镜试剂	酶解酶-100T	安倍医疗	分类号320932
ChIP试剂	抗H3K9Me2 ChIP级	阿布卡姆	类别号mAbcam1220
ChIP试剂	完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）	Sigma-Aldrich公司	分类号：11873580001
ChIP试剂	苯基甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich公司	类别号P7626
ChIP试剂	锆珠子，0.7 mm直径	BioSpec产品	货号11079107zx
ChIP试剂	Dynabeads蛋白质G	Invitrogen公司	分类号10003D
ChIP试剂	ChIP洗脱试剂盒	Clontech公司	分类号634887
ChIP试剂	milliTUBE 1 ml AFA纤维	科瓦利斯	目录号520130
ChIP试剂	DNA SMART ChIP-Seq试剂盒	Clontech公司	分类号634865
ChIP试剂	Agencourt AMPure XP公司	贝克曼·库尔特	类别号A63880
ChIP试剂	NEB下一个库数量工具包	新英格兰生物实验室	类别号E7630S
应变 (葡萄裂殖酵母)	小时⁺ade6 M216 his3-D1 leu1-32 ura4-D18	实验室库存	京财109
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-ade6-M210 leu1-32 ura4-D18 lys1+：：GFP-bqt4	本研究	JCF11923年	质粒pCSS18(Chikashige等人，2009年)在lys1位点整合。
应变(葡萄裂殖酵母)	h90人1-GFP-kanMX6 aur1R-m樱桃-bqt4 bqt4Δ：：natMX6 leu1-32 ura4-D18	本研究	JCF1266型
应变(葡萄裂殖酵母)	h90 lem2-GFP-kanMX6 aur1R-m樱桃-bqt4 bqt4Δ：：natMX6 ura4-D18	本研究	JCF1268型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 man1-td番茄湿度MX6 leu1-32 ura4-D18	本研究	JCF18885型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 hht1-mRFP-hygMX6	本研究	JCF12191型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 hht1-mRFP-hygMX6 bqt4:：natMX6	本研究	JCF12201型
应变(葡萄裂殖酵母)	ura4-D18 lem2-GFP-KanMX6	本研究	JCF12148型
应变(葡萄裂殖酵母)	ura4-D18 lem2-GFP-KanMX6 bqt4:：自然	本研究	JCF12157型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 sid4-m樱桃-natMX6 aur1R-Pnda3-m樱桃-atb2	本研究	JCF14537型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 sid4-m樱桃-natMX6 aur1R-Pnda3-m樱桃-atb2 csi1：：his3+	本研究	JCF14540型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 bqt4:：natMX6 csi1:：ura4+	本研究	JCF14573型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-kanMX6 taz1-mCherry-natMX6 csi1：：his3+	本研究	JCF14535型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-taz1-mCherry-natMX6 lys1+：：GFP-bqt4	本研究	JCF14578型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-taz1-mCherry-natMX6手册1-GFP-KanMX6	本研究	JCF14565型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺taz1-mCherry-natMX6 lem2-GFP-KanMX6	本研究	JCF14532型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺mis6-mCherry-hygMX6 lem2-GFP-KanMX6	本研究	JCF14543型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺mis6-mCherry-hygMX6手动1-GFP-KanMX6	本研究	JCF14533型
应变(葡萄裂殖酵母)	ade6-210 leu1-32 lys1-131 ura4-D18 sod2:：kanr-ura4+-lacOp-his7+：：lacI-GFP cut11-RFP-hygMX6	本研究	京财10756
应变(葡萄裂殖酵母)	ade6-210 leu1-32 lys1+ura4-D18 sod2:：kanr-ura4+-lacOp-his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hyg bqt4:：nat	本研究	JCF10771型
应变(葡萄裂殖酵母)	ade6-210 leu1-32 lys1-131 ura4-D18 sod2:：kanr-ura4+-lacOp-his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hyglem2:：nat	本研究	JCF12202型
应变(葡萄裂殖酵母)	his2:：kanMX6-ura4+-lacOp his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hygMX6	本研究	JCF10732型
应变(葡萄裂殖酵母)	his2:：kanMX6-ura4+-lacOp his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hygMX6 bqt4:：natMX6	本研究	JCF10740型
应变(葡萄裂殖酵母)	切割3+：：lacOp-his7+：：lac-GFP切割11-RFP-hygMX6	本研究	JCF10755型
应变(葡萄裂殖酵母)	切割3+：：lacOp-his7+：：lac-GFP切割11-RFP-hygMX6 bqt4:：nat	本研究	JCF11930年
应变(葡萄裂殖酵母)	taz1-mCherry-nat pLT1-2（nmt1:Ish1-GFP-LEU2）	本研究	JCF10701型
应变(葡萄裂殖酵母)	taz1-mCherry-nat bqt4:：湿度MX6 pLT1-2（nmt1:Ish1-GFP-LEU2）	本研究	京财10723
应变(葡萄裂殖酵母)	pot1-mRFP:kanMX6 cut11-3xPK-GFP:ura4+leu1-32 ura4-D18（WT）	实验室库存	JCF3649型
应变(葡萄裂殖酵母)	切割11-RFP-hyg tpz1-GFP-Kan taz1:：ura4+	本研究	JCF12293型
应变(葡萄裂殖酵母)	切割11-RFP-hyg tpz1-GFP-Kan bqt4:：nat	本研究	JCF12291型
应变(葡萄裂殖酵母)	cut11-RFP-hygMX6 tpz1 GFP:kanMX6 bqt4:：nat-taz1:：ura4+	本研究	JCF12290型
应变(葡萄裂殖酵母)	his2:：kanMX6-ura4+-lacOp his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hyg bqt4:：nat-swi6:：leu2+	本研究	京财10807
应变(葡萄裂殖酵母)	his2:：kanMX6-ura4+-lacOp his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hyg swi6:：leu2+	本研究	JCF 12279号
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-swi7绿色荧光蛋白：：kanMX6 taz1-mCherry-natMX6	本研究	JCF11905型
应变(葡萄裂殖酵母)	swi7 GFP:：kanMX6 taz1 mCherry nat bqt4:：hygMX6	本研究	JCF14504型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-bqt4:：nat ade6-M210 his3-D1 leu1-32 ura4-D18	本研究	JCF11933年
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺ade6 M216 trt1:：hygMX6	Jain等人（2010年）	JCF6858型	圆形幸存者
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺ade6 M210 clr4:：kanMX6	实验室库存	JCF3113型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-clr4:：kanMX6 bqt4:：hymMX6	本研究	JCF10795型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺swi7-GFP-kanMX6手动1-GBP-mCherry-hph	本研究	JCF11950年	GBP质粒是东京大学佐藤正美赠送的礼物
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-swi7-GFP-kanMX6	夏目漱石等人（2008）	JCF10835型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺swi7-GFP-kanMX6 man1英镑mCherry hph bqt4:：naMX6	本研究	JCF14517型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁹⁰otr1R:：ade6电话1L:：his3电话2L:：ura4 ade6-210 his3-D1 leu1-32 ura4-D18	Nimmo等人，1998年	JCF6712型	ChIP-seq实验中的尖峰应变。用于端粒沉默分析
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-dcr1：：ura4+	本研究	京财12179
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺ade6 M216 his3-D1 leu1-32 ura4-D18 bqt4:：natMX6	本研究	JCF14512型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-图1-32 ura4-D18 T2R1-4137:：ura4+	Kanoh等人（2005年）	JCF10833型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-swi6:：LEU2 leu1-32 ura4-D18 T2R1-4137:：ura4+	Kanoh等人（2005年）	JCF10830型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-leu1-32 ura4-D18 T2R1-4137:：ura4+bqt4：：natMX6	本研究	JCF10833、10834
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-swi6:：LEU2 leu1-32 ura4-D18 T2R1-7921:：ura4+	Kanoh等人（2005年）	京财10829
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-leu1-32 ura4-D18 T2R1-7921：：ura4+bqt4：：natMX6	本研究	JCF11998-12002年
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-图1-32 ura4-D18 T2R1-7921：：ura4+	Kanoh等人（2005年）	JCF10832型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺lem2:：kanMX6	本研究	JCF12178型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁹⁰epe1:：natMX6	本研究	邮编：0787
应变(葡萄裂殖酵母)	epe1:：natMX6 lem2:：kanMX6	本研究	JCF12204型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺lem2:：kanMX6 dcr1:：ura4	本研究	JCF12182型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-epe1:：naMX6t dcr1:：ura4	本研究	JCF12209型
应变(葡萄裂殖酵母)	epe1:：natMX6 dcr1:：ura4 lem2:：kanMX6	本研究	京财12211
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺cnp1-1 leu1 Rep41-ams2+[leu1+]	国家公共广播电台	JCF14580型	酵母遗传资源研究生中心（YGRC）大阪理工学院城市大学
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2:：natMX6 cnp1-1 leu1 Rep41-ams2+[leu1+]	本研究	JCF14588型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺cnp1-1：：ura4+ura4-D18	NBPR公司	JCF10266型	酵母遗传资源研究生中心（YGRC）大阪理工学院城市大学
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-bqt4:：nat leu1-32 ura4-D18 his3-D1 ade6-M210	本研究	JCF1193311934年
应变(葡萄裂殖酵母)	epe1:：natMX6 dcr1:：ura4+ bqt4:：hygMX6	本研究	JCF12240型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-bqt4:：hymMX6 epe1:：natMX6	本研究	JCF10811型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺bqt4:：hymMX6 dcr1:：ura4+	本研究	JCF12180型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-ade6-M210 leu1-32 ura4-D18 his3-D1 sid4-GFP-kanMX6 dh1L tetO ura+tetR mCherry nat	本研究	JCF14534型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-他的7+：：adh13pr-lacI-CFP C12：：kanR-ura4+-lacOp sid4-mRFP-natR ade6-210 leu1-32 ura4-D18 lys1-131	本研究	京财18924
应变(葡萄裂殖酵母)	ade6-210 leu1-32 lys1-131 ura4-D18 sod2:：kanr-ura4+-lacOp-his7+：：lacI-GFP切割11-RFP-hyg clr4:：nat	本研究	JCF11961年
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2 GFP Kan bqt4:：nat pcp1 RFP hph	本研究	JCF12189型
应变(葡萄裂殖酵母)	lem2-GFP-Kan pcp1-RFP-hph	本研究	JCF12190型
应变(葡萄裂殖酵母)	man1-GFP-kan ura4-D18	本研究	京财12153
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺man1 GFP-kan bqt4:：自然尿苷-D18	本研究	京财12163
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-ade6-M210他的3-D1 leu1-32 ura4-D18 nup107-GFP:ura4+	本研究	JCF11770型
应变(葡萄裂殖酵母)	nup107-GFP:ura4+bqt4:：nat	本研究	JCF12177型
应变(葡萄裂殖酵母)	切割11-3xPK-GFP:ura4+leu1-32 ura4-D18	实验室库存（来自护士实验室）	JCF2924型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺切割11 GFP-kan bqt4:：nat ura4-D18	本研究	JCF12176型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-bqt4:：nat leu1-32 ura4-D18 his3-D1 ade6-M210 aur1R-GFP-bqt4ΔTM	本研究	JCF12048、12049
应变(葡萄裂殖酵母)	lys1+-GFP-bqt4 bqt4:：自然ura4-D18 ade6-M210	本研究	JCF11958年
应变(葡萄裂殖酵母)	imr1R（Nco1）：：ura4+swi7 GFP-kanR ura4-D18 leu1-32 ade6-M216	本研究	JCF18888型
应变(葡萄裂殖酵母)	imr1R（Nco1）：：ura4+swi7 GFP-kanR ura4-D18 leu1-32	本研究	JCF18890型
应变(葡萄裂殖酵母)	imr1R（Nco1）：：ura4+ura4-D18 leu1-32 ade6-M216	本研究	JCF18892型
应变(葡萄裂殖酵母)	imr1R（Nco1）：：ura4+ura4-D18列1-32	本研究	JCF18893型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁺他的3D1leu1-32 ade6	实验室库存	JCF901型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时^-rad11-m樱桃-kanR leu1-32 ura4-D18 ade6	实验室库存	JCF1234型
应变(葡萄裂殖酵母)	swi7-GFP:：kanMX6 man1-GBP-m樱桃-hph rad11-m樱桃-Kan	本研究	JCF14598型
应变(葡萄裂殖酵母)	taz1-mTurquoise2-natR man1-GBP-mCh-hphR ura4-D18他的3-D1 ade6	本研究	京财18936
应变(葡萄裂殖酵母)	taz1-mTurquoise2-natR swi7-GFP-kanR man1-GBP-mCh-hphR ura4-D18他的3-D1 ade6	本研究	JCF18939型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁹⁰otr1R:：ade6+tel1L:：his3+tel2L:：ura4+ade6-210 his3-D1 leu1-32 ura4-D18	实验室库存	JCF6712型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁹⁰otr1R:：ade6+tel1L:：his3+tel2L:：ura4+clr4:：kanMX ade6-210 his3-D1 leu1-32 ura4-D18型	实验室库存	JCF6715型
应变(葡萄裂殖酵母)	小时⁹⁰otr1R:：ade6+tel1L:：his+3 tel2L:：ura+4 bqt4:：nat ade6-210 his3-D1 leu1-32 ura4-D18	本研究	京财10763
其他	是225	日出科学产品	分类号2011-500
其他	总经理	日出科学产品	类别号2060–500
其他	EMM公司	日出科学产品	分类号：2005–500

在单独的窗口中打开

酵母菌株和培养基

本研究中使用的菌株见关键资源表。所有使用的介质都是以前建立的(Moreno等人，1991年). 使用合适的质粒模板（pFA6a），通过一步基因替换法进行基因删除和荧光标记插入-kanMX6, -湿度MX6、和-国家MX6个选择磁带），如前所述(Klutstein等人，2015年). 对每个标记蛋白的功能进行测试：通过监测减数分裂和端粒NE定位来检查Bqt4功能，这些都没有改变；然而，含有GFP-Bqt4的细胞表现出轻微的HU敏感性（数据未显示），这表明GFP-Bqt4是一种部分低形态。Lem2的功能性通过噻菌灵敏感性的抢救进行测试第2列Δ电池(Banday等人，2016年)菌株交配和随机产孢用于组合多种遗传突变。通过将指示浓度的HU、MMS和博来霉素添加到预冷却至55°C的含有丰富酵母提取物的熔融琼脂培养基（YE5S；Sunrise Science Products，San Diego，CA）中，进行活性分析。隔夜将中对数期细胞培养物（OD600~0.5）连续稀释5倍，并印在含有DNA损伤剂的培养基上。基因沉默分析是通过将连续稀释的培养物冲压在含有补充有适当氨基酸且缺乏指示营养素的最低培养基（PMG，Sunrise Science Products）的平板上进行的。

实时显微镜

菌株培养物在32°C下于50 ml富培养基中培养过夜至中对数期。用EMM洗涤后，将培养物稀释至原始体积，并将1ml样品中的沉淀重悬于20µl成像介质（1:2 YE5S-EMM）中。如前所述，将再悬浮细胞（3µl）安装在玻璃载玻片上形成的琼脂糖垫上(Hiraga等人，2006年). 细胞在宽视野倒置DeltaVision（GE Healthcare）显微镜上成像，显微镜上有100X油浸物镜（NA 1.42）和氙灯激发源。成像温度为22–25°C。使用SoftWoRx（GE Healthcare）捕获并分析图像。通过捕获单个时间点Z堆栈（由25个图像组成）对细胞成像，每个Z平面之间0.25μm。前面描述了分析lacO/I点在核区内定位的方法(Hediger等人，2002年). 为了捕捉延时图像，将细胞粘附到35mm玻璃底培养皿（MatTek）的底部，如前所述(Klutstein等人，2015年)，但成像是在22–25°C下进行的，延时间隔在相应的图形图例中指示。FRAP实验使用蔡司LSM 710共焦系统（纽约桑伍德卡尔蔡司公司）、蔡司Axiovert显微镜、25 mW氩488 nm激光器和100x Plan-Neofluar 1.3 NA油浸物镜进行。数字图像为512×512像素和12位。对于FRAP，使用三条氩激光线（458、488、514 nm）在100%传输和10次迭代下漂白细胞区域。在一次采集扫描后开始漂白，并在指定的时间间隔采集图像。

超分辨率显微镜

SIM图像是使用Applied Precision OMX（GE Healthcare），使用60×1.42 NA Olympus Plan Apo油物镜和前照sCMOS摄像头（6.45 um像素大小）获得的。所有SIM显微镜均在22–23°C下进行。激发源由488 nm激光（用于GFP）或561 nm激光（对于mCherry）组成，使用标准滤波器（FITC/AF488和AF568/德克萨斯红）通过交替激发捕获图像。SIM重建是用SoftWorX完成的，维纳滤波器为0.003。显示的SIM图像是单个Z切片，使用斐济ImageJ（国家卫生研究院）通过双线性插值进行数字缩放。为了制备用于成像的细胞，培养过夜细胞（10 mL，OD595～0.5）并用3.2%甲醛处理1分钟，然后添加0.1%戊二醛并在25°C下培养12分钟。在室温下用1%Triton X-100处理5分钟之前，用0.6 mg/mL酵母酶100T在36°C下清洗固定细胞并处理45分钟。将细胞洗涤并重新悬浮在1 ml洗涤缓冲液中（100 mM PIPES，1 mM EGTA，1 mM-MgSO4 pH 6.9）。为了最小化光浸出和放大荧光信号，将GFP和RFP增强剂（德国ChromoTek）添加到200µl在洗涤缓冲液中重新悬浮的细胞中，并添加1%BSA和100 mM赖氨酸盐酸盐。在室温下培养1小时后，将细胞清洗并重新悬浮在10µl Vectashield中（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs）。将细胞（1µl）放在玻璃载玻片上，用酸洗过的盖玻片覆盖，并在成像前用指甲油密封。

染色质免疫沉淀

培养物在120 ml YE5S培养基至中对数期中培养过夜，并在室温下用甲醛（最终浓度为1%）处理10分钟，偶尔出现漩涡。如中所述图6C在用甲醛处理之前，将37.5ml的穗培养物与112.5ml的每个样品混合。用50mL冷冻Milli-Q（Millipore）水洗涤处理过的细胞。细胞以2000 rpm离心2分钟，再悬浮在1 ml水中，离心后向颗粒中添加1 ml锆珠。将颗粒和珠子混合物在液氮中快速冷冻，并在−80°C下储存在2 ml螺旋卡式防碎管中。将冷冻颗粒重新悬浮在500µl溶解缓冲液中：50 mM Hepes pH 7.4、140 mM NaCl、1 mM EDTA、1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠、1%PMSF和无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Roch），并使用FastPrep（MP Biomedical；设置：5×30 s循环，4.5 m/s）进行溶解。通过以1500 rpm离心3 min，在5 ml snap-cap管中回收每个裂解液，并使用Covaris E210仪器进行超声处理。所用的超声设置为：20%，8个强度，每次200次循环，持续12分钟。通过14000 rpm离心10分钟，对超声裂解产物进行澄清。对于输入DNA，留出20µl澄清的裂解产物。将裂解产物与5µg H3K9me2（abcam#1220）抗体在4°C下孵育过夜。将磁性蛋白-G珠（Invitrogen，Waltham，MA）添加到裂解液/抗体混合物中，并孵育4小时，然后清洗并洗脱珠中的免疫沉淀物。使用ChIP洗脱试剂盒（Clontech）通过煮沸和反向交联进行洗脱，以获得用于Next-Gen文库制备的ssDNA模板。

下一代测序

使用Quibit ssDNA分析试剂盒（分子探针、生命技术）对上述制备的ssDNA样品进行定量，每个样品的5-10 ng用于文库制备。使用DNA SMART ChIP-Seq试剂盒（Clontech）和Illumina索引低聚物制备文库。PCR扩增后（15个周期），使用Agencourt AMPure XP珠（200–400 bp范围）对文库进行大小选择和纯化。使用Quibit 2.0荧光仪检测浓度，使用安捷伦2100生物分析仪检测片段大小，使用NEB下一个库量试剂盒（新英格兰生物实验室）检测适配器存在性，对每个库进行验证。典型文库产量为10–40 ng，平均大小为400 bp。最后，以等摩尔比（10 nM）汇集12个样本的文库，并提交使用Illumina HiSeq2500快速运行模式（GENEWIZ，新泽西州南普莱恩菲尔德）进行测序。每个合并样本共获得约1.4亿个50 bp读数。在进行生物信息学分析之前，根据相应的Illumina指数（>=Q30碱基的百分比：97.85；平均质量分数：38.63）分离池中每个样本的读数。

生物信息分析

根据图书馆建设程序的要求，对读数5’端的三个底座进行了修剪。使用bowtie2将47 bp修剪后的读数与参考基因组进行比对，允许每个重复区域进行50次比对。Chr II的原始参考序列包含部分删除的垫子位点；因此，我们通过替换删除的垫子与…相连的区域小时⁹⁰的配置mat2P-mat3M型区域（如“http://www.pombase.org/status/mating-type-region’; 2017年7月访问）。在标准化之前，将得到的对齐SAM文件转换为排序和索引的BAM文件。规范化是使用一个顺序执行的Python脚本执行的：1-获取对齐读取的总数，包括ade6位点（chr III:1316291–1318035），并读取覆盖邻近常染色质区域的ade6基因座（chr III:13040001380000）；2-计算归一化比例因子：10/（覆盖范围内每个基数的读数中值阿德6轨迹–覆盖相邻常染色区域中每个基底的读数中值）；3-使用BEDTools套装的genomecov函数将比例因子应用于对齐的基因组读取（BAM文件），以生成一个bedgraph文件。为了生成上图所示的带状在线覆盖图，创建了一个R脚本，该脚本导入病历文件，并使用250 bp的滑动窗口计算相同基因型菌株的读取中值、最大值和最小值。本研究使用的脚本存放在https://www.elucidaid.com/repository/ebrahimih17'.

致谢

我们感谢Michael Lichten、Shiv Grewal和我们的实验室成员的讨论；Robin Allshire、Yasushi Hiraoka和Masamitsu Sato慷慨赠送菌株和试剂；Yoshiyuki Wakabayashi帮助设计ChIP-Seq协议；苏珊·加菲尔德为共焦显微镜/FRAP实验提供帮助；和Patrina Pellett寻求OMX图像设置方面的帮助。

资金筹措表

资助者在研究设计、数据收集和解释或提交作品出版的决定中没有任何作用。

资金筹措信息

这篇论文得到了以下拨款的支持：

国家癌症研究所内部资金哈尼·易卜拉希米、Hirohisa Masuda、Julia Promisel Cooper。

其他信息

竞争性利益

没有宣布竞争利益。

作者贡献

概念化、方法论、调查、撰写初稿、软件、数据管理。

概念化、调查、方法论、写作审查和编辑、数据管理。

概念化、方法论、调查，执行初始筛选，确定HAATI维护所需的Bqt4，并分析缺乏Bqt5的细胞的生存能力和损伤敏感性。

概念化、调查、方法论、写作-初稿、写作-审查和编辑、资金获取、形式分析。

其他文件

透明的报告表

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2018;7：e32911。

2018年5月3日在线发布。数字对象标识：10.7554/eLife.32911.023

决定书

雷蒙德·威灵格，审阅编辑器

雷蒙德·威灵格，加拿大谢尔布鲁克大学；

版权和许可信息 PMC免责声明

为了透明起见，eLife包括编辑决定书和附带的作者回复。同行评审后发给作者的信的一个略加编辑的版本显示了最实质性的担忧；次要的评论通常不包括在内。

感谢您提交您的文章“核膜上的不同‘安全区’确保异染色质染色体区域的稳健复制”，以供审议电子生活你的文章得到了杰西卡·泰勒（高级编辑）和三位评论员的好评，其中一位是我们评审编辑委员会的成员。以下参与审查您提交文件的个人同意透露其身份：Marc R Gartenberg（2号审查人）；Mikel Zaratiegui（3号评审员）。

经过一次富有成效的在线讨论，人们对该文件产生了非常积极和连贯的看法。以下文本应指导您准备修订后的提交文件。

这三位审稿人都对记录核膜附近非重叠区域的实验印象深刻。此外，这些独立域对异色区域高效复制的功能重要性大体上被认为是我们在该领域知识的一个重要进步。特别提到了新的polα系留系统，它具有创造性和启发性，允许探索全新的角度。这些要点加在一起，对该领域作出了非常有力和重要的贡献。事实上，所附领域的许多研究人员也会对这些研究感兴趣，因此预计会有很高的兴趣。由于这些原因，审稿人认为你的论文可能达到了预期的水平电子生活并且，在添加了如下所述的少量修订后，可以接受。

需要重新提交新实验的要点：

1）请使用此设置验证Lem2与Man1区域的联合成像定位。这将为东北部特定地区的核心论点增加重要分量。

2）作者表明，嵌合Man1-GBP-mCherry导致polα定位于核外围。他们没有显示任何特定的端粒或着丝粒移动到Man1微域并离开其各自的Lem2和Bqt4微域。这似乎可行。这将表明，它们实际上迫使特定异染色质结构域重新定位，而不仅仅是本体polα。

3）图6F：。正确的比较是Polα-GFP/Man1+与Polα-GFP/Man1GBP。根据文本所述，标记为WT的样本似乎是polα+/Man1-GBP。但更可能影响异染色质的标签是Polα-GFP；Polα最初在绒球作为瑞士7因为它的突变破坏了交配类型的转换（Singh和Klar 1993 PMID 8423854），后来被认为是杂色的抑制物（Nakayama和Grewal 2001 PMID 11387218）。我在论文中找不到PEV测试瑞士7-描述了GFP等位基因（夏目漱石，2008年，PMID 18493607）。一个简单的着丝粒转录物RTPCR显示它们在瑞士7-GFP应变足以排除标签影响的可能性。

其他可能性，更劳动密集但也更令人信服，将是PEV检测（带有尿酸4+记者进入光电转换管或国际货币兑换)或H3K9me2 ChIP。然而，如果这些备选方案需要两个多月才能完成，那么它们对论文来说就不是必需的了。

4）未对图5补充图1A进行正确控制。他们省略了重量GFP-Bqt4。

接下来，我列出了评论员提到的一些问题和要求，这些问题和要求可以通过编辑更改轻松解决。换言之，我们不期望有更多的实验证据证明这些观点，但希望对手稿文本进行调整，以反映提出的问题：

1）所有三位评论员都认为，讨论进行得太久，失去了影响力。在他们看来，整个手稿和讨论过于关注复制/转录冲突的概念，而这些概念没有经过广泛的实验检验。鉴于获取此类冲突的直接实验证据可能会耗费不合理的人力和时间，他们建议相应地减少讨论，并缩短整个讨论。

2）一些地方将受益于更好的定量描述：

-FRET分析中Bqt4依赖的Lem2扩散

-在小节的第一段“Bqt4系带端粒和垫子据说Taz1-Bqt4相互作用比Taz1-Lem2更好。应量化Bqt4-Taz1共定位，如图4补充图1B中Mis6和Lem2所示。

3）为什么Telo1L与Taz1（也绘制端粒）的不同行为/定位。比较：图4C早期/中期S：NE定位WT与bqt4-相比显著下降至：图4D早期/中期S：NE定位WT与bqt4-相比无差异。

4）图5-图补充1A：尽管文中提到，但没有显示MMS面板。

5）图7G没有比例尺，因此很难与图6F进行比较。

6）没有图9（模型），但在讨论中进行了讨论。评论员实际上希望看到这一数字包括在内。

7）在SPB下，着丝粒与Lem2斑点共定位（图4A）。中心周围异染色质（Cen3周围跨越100kb）通常位于巨大的Lem2斑点之外（图4补充图1C）。我认为作者暗示着中心周围异染色质与Lem2的微域相互作用，而这些微域与巨大的Lem2斑点不同。这似乎与以下句子不一致：“在该区域可检测到的Lem2的强烈焦点（图4A）与ChIP实验一致，该实验显示Lem2和着丝粒周围异染色质之间的相互作用（Barrales等人，2016；Tange等人，2016）。”此外，我认为Barrales和Tange的论文显示了Lem2与CenpA染色质的关联，但没有显示更广泛的中心周围异染色质。

8） “我们的显微镜显示了着丝粒核心和中心周围区域的独特定位模式，着丝粒中心与SPB下方的Lem2共定位，而中心周围与非SPB相邻的Lem2共同定位。”据我所知，作者从未显示过这一点。他们在图4补充图1C中显示，着丝粒周围不在SPB。他们没有显示该染色质邻接非SPB相邻的Lem2。

9） “Bqt4系链端粒和垫子当他们在复制时特别定位“会使不熟悉的读者感到困惑蓬贝。让广大读者都能阅读本说明。

10）这只是一个小评论，但实际上非常重要。自始至终，作者都提到了H3K9me。然而，他们的实验是用抗H3K9me2的抗体进行的。他们应该明确这一点，因为虽然H3K9me2仍然是异染色质形成和RNAi活性的良好指示器，但最近描述的H3K9 me2和H3K9-me3之间存在明显的功能差异（Jih等人，2017年，Moazed实验室PMID 28682306）。

11）自始至终，显微镜图像都没有尺寸条。

12）自始至终，大多数比较都没有进行统计分析。这可能会影响一些结论的解释，如图4C和D所示。在bqt4D中，S早期/中期与S晚期/G2的端粒外周定位是否显著？Bqt4D与WT在S早期/中期是否显著？

13）图5——图补充1A。GFP-bqt4+菌株对HU不敏感吗？这将排除GFP标签对Bqt4的影响。

14） “Bqt4和Lem2微环境调节端粒和着丝粒异染色质”小节，第四段末尾：中心周围H3K9me数据显示在图7中的图补遗1C中，而不是1A。

15）图8B，在“Lem2和Bqt4在缺乏Dcr1的情况下对生存能力至关重要”小节中，第一段：第2列+删除大大降低了森1-1ts.我找不到lem1D/cen1-1本图或补充资料中的数据，只有lem1D/cen1-1/pnmt41-AMS和森1-1/pnmt41-AMS。

16） “[…]在HU或MMS中造成额外麻烦”。虽然我很欣赏口语表达，但这太模糊了。请具体说明作者建议如何将MMS或HU与bqt4Δ可能导致无法维持的局面。DNA修复途径是否被加剧的内源性复制应激所淹没bqt4Δ)以及外源性因子（HU/MMS）引起的？

17）导言，第三段。这里请引用Castel等人，2014，这是一个显示Dcr1从tDNA和rDNA中释放RNAPol II的证据。

2018;7：e32911。

2018年5月3日在线发布。数字对象标识：10.7554/eLife.32911.024

作者回复

版权和许可信息 PMC免责声明

需要重新提交新实验的要点：
1）请使用此设置验证Lem2与Man1区域的联合成像定位。这将为东北部特定地区的核心论点增加重要分量。
我们同意同步Lem2/Man1定位对完成图片很重要，并将此数据添加到新的图1中。这一新数据必须通过传统的DeltaVision成像而非SIM进行捕获，因为我们可以为Man1获得的最亮的放大td-tomota标签提供的SIM信号不足（可能是因为SIM需要固定）。尽管如此，通过活分析很容易看到Man1-tdTomato/Lem2-GFP组合，这显示了Lem2和Man1结构域的清晰分离。我们现在已经量化了可视化蛋白质的所有成对组合的共定位（图1-图补充1）。
2）作者表明，嵌合Man1-GBP-mCherry导致polα定位于核外围。他们没有显示任何特定的端粒或着丝粒移动到Man1微域并离开其各自的Lem2和Bqt4微域。这似乎可行。这将表明，它们实际上迫使特定异染色质结构域重新定位，而不仅仅是本体polα。
我们同意这一观点，并尝试在有无Polα-GFP的Man1-GBP-Cherry环境下观察端粒和着丝粒，但效果有限。标签组合使这个实验变得困难。现在，通过用mTurquoise标记Taz1并在Man1-GBP上使用mCherry标记，我们已经能够进行这个实验了——图6补充图2C-E中显示了具有代表性的图像和结果图。数据清楚地表明，Man1-GBP/Polα-GFP组合将端粒从Man1-贫困地区移动到Man1-富裕地区。正如预期的那样，这种影响是适度的（因为这种重新定位只会短暂发生，而给定的端粒会复制），但意义重大。
3）图6F：。正确的比较是Polα-GFP/Man1+与Polα-GFP/Man1GBP。根据文本所述，标记为WT的样本似乎是polα+/Man1-GBP。但更可能影响异染色质的标签是Polα-GFP；Polα最初在pombe中被鉴定为swi7，因为它的突变破坏了交配类型的转换（Singh和Klar，1993年，PMID 8423854），后来被确认为杂色抑制因子（Nakayama和Grewal，2001年，PMID11387218）。我在论文中找不到描述这种swi7-GFP等位基因的PEV测试（Natsume at al 2008 PMID 18493607）。对着丝粒转录物进行简单的RTPCR，表明它们在swi7-GFP菌株中没有上调，这足以排除标签产生影响的可能性。
其他更费力但也更令人信服的可能性是PEV检测（在otr或imr中使用ura4+报告子）或H3K9me2 ChIP。然而，如果这些备选方案需要两个月以上的时间才能完成，那么它们对论文来说就不是必需的了。

好的一点——我们已经通过评估Polα-GFP标签对国际货币兑换着丝粒区域（插入尿酸4+标记被静音）。结果非常清楚地表明，标记对在国际货币兑换，如新的图6补充图1所示。

4）未对图5补充图1A进行正确控制。他们省略了重量GFP-Bqt4。

谢谢你接住这个。我们用wt GFP-Bqt4重复了实验，并在图5的补充图1中给出了新数据。GFP-Bqt4挽救了MMS敏感性bqt4Δ而不是HU敏感性，这表明GFP-Bqt4是一种部分低形态。这令人惊讶，因为Hiraoka实验室发现，虽然Bqt4上的C末端标记废除了功能，但我们使用的N末端标记的Bqt5没有赋予表型。我们现在修改了材料和方法部分，以反映HU敏感性，并删除了HU的ΔTM数据。

接下来，我列出了评论员提到的一些问题和要求，这些问题和要求可以通过编辑更改轻松解决。换言之，我们不期望有更多的实验证据证明这些观点，但希望对手稿文本进行调整，以反映提出的问题：
1）三位评审员都认为，讨论持续了这么长时间，失去了影响力。他们认为，整个手稿和讨论过于集中于复制/转录冲突的概念，而这一概念并未得到广泛的实验检验。鉴于获取此类冲突的直接实验证据可能会耗费不合理的人力和时间，他们建议相应地减少讨论，并缩短整个讨论。
我们同意。我们大大缩短了讨论时间，并试图精简和澄清。
2）一些地方将受益于更好的定量描述：
-FRET分析中Bqt4依赖的Lem2扩散

Lem2 FRAP数据在图3C中进行了量化，但请注意，FRAP不能在弱于外围（即非SPB-相邻）Lem2信号的信号上执行。因此，我们对量化围绕外围的传播并不自信，更愿意坚持对此进行定性描述（希望我没有误解你的观点）。

-在“Bqt4在复制时特异性地系留端粒和mat位点”小节的第一段中，据说Taz1–Bqt5相互作用优于Taz1-Lem2。Bqt4-Taz1共定位应进行量化，如图4-图补充1B中Mis6和Lem2所示。

我们在新的图3G中量化了这些共定位。

3）为什么Telo1L与Taz1（也绘制端粒）的不同行为/定位。比较：图4C早期/中期S：NE定位WT与bqt4-的显著下降：图4D早期/中期S:NE定位WP与bqt4-的无差异。
感谢您要求我们澄清这一点。Tel1L标记（位于草皮2+基因座）与端粒的距离超过50kb，并且可能比实际的端粒（Taz1与之结合）更早复制。我们在文本中对此进行了澄清。
4）图5-图补充1A：尽管文中提到，但没有显示MMS面板。
我们对此表示歉意–我们已经修复了它（请参见上文第4点）。
5）图7G没有比例尺，因此很难与图6F进行比较。
我们已经添加了比例值。
6）没有图9（模型），但在讨论中进行了讨论。评论员实际上希望看到这个数字被包括在内。

我们对这个遗漏表示歉意。我们已经添加了为原稿准备的模型图（图9）。

7）在SPB下，着丝粒与Lem2斑点共定位（图4A）。中心周围异染色质（Cen3周围跨越100kb）通常位于巨大的Lem2斑点之外（图4补充图1C）。我认为作者暗示着中心周围异染色质与Lem2的微域相互作用，而这些微域与巨大的Lem2斑点不同。这似乎与以下句子不一致：“在该区域可检测到的Lem2的强烈焦点（图4A）与ChIP实验一致，该实验显示Lem2和着丝粒周围异染色质之间的相互作用（Barrales等人，2016；Tange等人，2016）。”此外，我认为Barrales和Tange的论文显示Lem2与CenpA染色质有关，但没有显示更广泛的中心周异染色质。
在Barrales等人的论文中，Lem2被确定为国际货币兑换区域，但也显示在森德格更远端的重复；Lem2对沉默的影响很小。Tange论文还显示，H3K9me2在差分/差分重复和imr:：ura4在没有Lem2的情况下。同时，两篇论文都显示了Lem2与中心核心的特异性结合。我们的工作与这些观察结果一致，显示了Lem2在中央核CenpA负荷中的作用（独立于Bqt4依赖的Lem2从SPB的动员），以及可能由瞬态（S期）介导的对中心周围沉默的适度影响Lem2-着丝粒周围的联系没有被之前论文的ChIP实验发现。我们将句子改为“与ChIP实验一致，该实验显示Lem2和着丝粒之间存在相互作用”
8） “我们的显微镜显示了着丝粒核心和中心周围区域的独特定位模式，着丝粒中心与SPB下方的Lem2共定位，而中心周围与非SPB相邻的Lem2共同定位。”据我所知，作者从未显示过这一点。他们在图4补充图1C中显示，着丝粒周围不在SPB。他们没有显示该染色质邻接非SPB相邻的Lem2。
我们修改了文本，以澄清近着丝粒和非SPB-localized Lem2之间的共定位概念是一种推断，而不是结果。
9） “Bqt4在复制过程中特异性地系留端粒和垫位点”小节第四段中对细胞周期的描述会让不熟悉pombe的读者感到困惑。让广大读者都能接触到这一描述。
我们简化了这一描述。
10）这只是一个小评论，但实际上非常重要。自始至终，作者都提到了H3K9me。然而，他们的实验是用抗H3K9me2的抗体进行的。他们应该明确这一点，因为虽然H3K9me2仍然是异染色质形成和RNAi活性的良好指示器，但最近描述的H3K9 me2和H3K9-me3之间存在明显的功能差异（Jih等人，2017年，Moazed实验室PMID 28682306）。
我们修改了文本，将“H3K9me”用于我们共同指代me2和me3的实例，而将H3K9 me2指定用于使用相应抗体的实验。在最初的简介中，我们指定H3K9me同时指me2和me3。
11）在整个过程中，显微镜图像没有尺寸条。
我们在整个过程中添加了比例尺。
12）自始至终，大多数比较都没有进行统计分析。这可能会影响一些结论的解释，如图4C和D所示。在bqt4D中，S早期/中期与S晚期/G2的端粒外周定位是否显著？Bqt4D与WT在S早期/中期是否显著？
感谢您对此进行标记–我们已将相关的p值添加到图4和统计表（图4表补充1）中。
13）图5——图补充1A。GFP-bqt4+菌株对HU不敏感吗？这将排除GFP标签对Bqt4的影响。

请参阅上文第4点。我们的新实验表明绿色荧光蛋白-bqt4+对MMS不敏感，但对HU轻度敏感。

14） “Bqt4和Lem2微环境调节端粒和着丝粒异染色质”小节，第四段末尾：中心周围H3K9me数据显示在图7中的图补遗1C中，而不是1A。
谢谢–已修复。
15）图8B，在“在没有Dcr1的情况下，Lem2和Bqt4对生存能力至关重要”小节中，第一段：Lem2+删除大大降低了cen1-1-ts的生存能力。我在本图或补充图中找不到lem1D/cen1-1/pnmt41-AMS和cen1-1/pmmt41-AMS的数据。
感谢您提醒我们澄清这一点。我们无法获得双突变体lem2 cnp1-1型细胞；只有当Ams2过度表达时，这种突变组合才能生长。我们修改了文本来解释这一点。
16） “[…]在HU或MMS中造成额外麻烦”。虽然我很欣赏口语表达，但这太模糊了。请更具体地说明作者提出MMS或HU与bqt4Δ结合会导致无法维持的情况。DNA修复途径是否被加剧的内源性复制应激（以bqt4Δ计）和外源性因子（HU/MMS）引起的应激所淹没？
我们修改了这段文字，以表明有暂停复制倾向的重复区域（可能是由于放松时虚假的二级结构形成）更容易受到HU和MMS带来的复制压力的影响。这可能是由于未缠绕区域的寿命延长，正如评论者所建议的那样，DNA修复机制被压倒，或者由于重复序列已经停滞的分叉崩溃。
17）导言，第三段。这里请引用Castel等人，2014，这是一个显示Dcr1从tDNA和rDNA中释放RNAPol II的证据。

完成。我们从一开始就打算将Castel等人包括在内，谢谢您的理解。

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