Platform-independent and label-free quantitation of proteomic data using MS1 extracted ion chromatograms in skyline: application to protein acetylation and phosphorylation

doi:10.1074/mcp.M112.017707

.2012年5月；11(5):202-14.

doi:10.1074/mcp。M112.017707。 Epub 2012年3月26日。

使用skyline中MS1提取的离子色谱图对蛋白质组数据进行平台无关和无标记定量：在蛋白质乙酰化和磷酸化中的应用

比吉特·席林¹, 马修·杰·拉丁, 布伦丹X麦克林, 安娜·M·扎瓦兹卡, 芭芭拉·弗雷文, 迈克尔·P·库萨克, 迪伦·J·索伦森, 迈克尔·贝勒曼, 恩轩静, 克里斯汀·C·吴, 埃里克·威尔第, C罗纳德·卡恩, 迈克尔·麦克斯, 布拉德福德·W·吉布森

附属公司

PMID： 22454539
PMCID公司：项目经理3418851
内政部： 10.1074/mcp。M112.017707号

天际线中使用MS1提取离子色谱图对蛋白质组数据进行平台依赖和无标签定量：应用于蛋白质乙酰化和磷酸化

比吉特·席林等。分子细胞蛋白质组学. 2012年5月.

.2012年5月；11(5):202-14.

doi:10.1074/mcp。M112.017707。 Epub 2012年3月26日。

作者

比吉特·席林¹, 马修·杰·拉丁, 布伦丹X麦克林, 安娜·M·扎瓦兹卡, 芭芭拉·弗雷文, 迈克尔·P·库萨克, 迪伦·索伦森, 迈克尔·贝勒曼, 恩轩静, Christine C Wu女士, 埃里克·威尔第, C罗纳德·卡恩, 迈克尔·麦克斯, 布拉德福德·W·吉布森

附属

¹巴克老化研究所，美国加利福尼亚州诺瓦托市，邮编94945。

PMID： 22454539
PMCID公司：项目经理3418851
内政部： 10.1074/立方厘米。M112.017707号

摘要

尽管定量蛋白质组学的代谢和代谢后标记方法取得了进展，但仍需要改进无标记方法。这一需求对于在肽水平上结合亲和力富集的工作流程来说尤为迫切，其中等压化学标签，例如用于相对和绝对定量的等压标签和串联质量标签可能会被证明有问题，或者在细胞培养标签中不能轻易应用氨基酸的稳定同位素标记。Skyline是一个免费的开源软件工具，用于定量数据处理和蛋白质组分析。我们扩展了Skyline的功能，以处理在HPLC-MS/MS蛋白质组实验期间获得的全扫描质谱数据（MS1）中肽分析物的离子强度色谱图。此外，与现有的程序不同，Skyline MS1过滤可以与四大供应商的质谱仪一起使用，这样可以在实验室之间直接比较结果。Skyline中现有的新定量和图形工具专门支持MS1过滤的多次采集查询，包括峰值拾取的目视检查以及自动和手动集成，这些是现有软件中经常缺少的关键功能。此外，Skyline MS1过滤显示光谱库中包含的基本MS/MS数据的保留时间指示器，以确保正确的峰值选择。Skyline的模块化结构还提供了定义明确、可定制的数据报告，从而允许用户直接连接到现有统计程序，进行事后数据分析。为了证明MS1过滤方法的实用性，我们在多个MS平台上进行了实验，并专门检查了该方法的性能，以量化两个重要的翻译后修饰：乙酰化和磷酸化，在使用小鼠和人类模型的日益复杂的以肽为中心的亲和工作流中。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**MS1过滤示意图。** A类，整个色谱梯度上MS1信号的热图*米/z*在高分辨率质谱仪上获得的距离。B类，“放大”显示典型肽分子离子的同位素包络，在M、M+1和M+2选择峰值，显示MS1强度随时间的变化。C类高分辨率数据允许对分子离子进行特定过滤，并分离同位素分布中的各个峰。天际线将单个分辨率内的强度与预测质量电荷比的任一侧相加，从而使滤波窗口达到理论分辨率的两倍，预测全宽达到一半最大值(*2×半高宽*). 用户可以根据MS仪器类型和首选同位素选择分辨率设置*米/z*采集范围。

**图2。**
**MS1过滤蛋白质组数据流示意图。**Skyline MS1过滤独有的新模块或显著修改的模块如所示*文本框*（有关说明，请参阅正文）。

**图3。**
**Skyline MS1过滤图形用户界面。** A类，肽YAPVA的天际肽树卡克DLAS公司**R（右）**(卡克是乙酰赖氨酸，并且**R（右）**是¹³C类₆¹⁵N个₄-Arg），显示三个提取的分子离子同位素峰M、M+1和M+2。B类从两个样品中采集的四个样品的色谱图和峰强度迹线是重复的，重肽的峰值分别为1和3 fmol（S1R1、S1R2、S2R1和S2R2）。这个*垂直线*带有注释的保留时间和标识(*身份证件*)标记最初指导MS1峰值选取的基本MS/MS采样。C类，Skyline显示所选肽的MS/MS光谱库，为特定采集复制提供潜在肽识别信息。在这种情况下，显示了四个重复物中两个重复物（S1R1和S2R2）的基本MS/MS光谱，尽管可以显示所有光谱。天和E类，之前为目标LC-MRM数据处理开发的已建立Skyline可视化显示，包括峰值区域复制视图(天)和保留时间复制(E类)（有关Skyline图形显示、设置和参数的更多详细信息，请参阅补充图S1–S3).

**图4。**
**稳定同位素标记肽和含乙酰赖氨酸肽的标准浓度曲线。** A类和B类，雅典娜卡克DLAS公司**R（右）**(A类，琥珀酸脱氢酶复合物，亚单位A）和LVSSVSDLPKacR公司(B类，3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合成酶2），浓度范围从4到25飞秒。肽被稀释成简单的基质(*红色三角形*，25 fmol“六蛋白混合物”）或复合基质(*蓝色圆圈*，小鼠肝脏线粒体裂解物，柱上0.3μg），并在TripleTOF 5600质谱仪上获得三份。前体离子M的MS1过滤峰面积曲线*米/z*621.8395²⁺(A类，重型YAPVA卡克DLAS公司**R（右）**)和*米/z*626.8604²⁺(B类，重型LVSSVSDLPKacR公司). 显示了加权回归线和计算的LOQ（另见补充表S3)在不同基质中，YAP和LVS肽的加权线性回归斜率分别为1.03和1.03，0.99和1.00。C类，显示了复合基质中每个浓度点（0.037–25 fmol）的三个重复物的6个靶向乙酰赖氨酸肽的峰面积CV，指示了20%和30%的CV截止值（另请参见补充图S6，C类和F类).天高通量分析显示，在复杂的线粒体裂解物背景矩阵中，27个独立获得的序列中有366个肽的峰面积CV。针对MS1过滤前体显示峰面积CV米/z.

**图5。**
**DCA抑制激酶后，PDHE1α中Ser-293、Ser-300和Ser-232磷酸化的时间进程发生变化。** A类，二磷酸肽YHGH三次注射重复的相对定量**pS公司**²⁹³MSDPGV公司**pS公司**³⁰⁰YR，前体离子M在*米/z*876.8155.B类，相应磷酸肽的相对定量，YHGHpS公司²⁹³MSDPGVSYR和/或YHGHSMSDPGVpS公司³⁰⁰YR，前体离子M在*米/z*836.8323.C类，磷酸肽YGMGTpS公司²³²提取前体离子M的VER米/z540.2150.天用磷酸化位点特异性抗体和总蛋白抗体对DCA治疗的PDHE1α磷酸化进行独立的Western blot分析。

**图6。**
**亚型特异性乳腺癌细胞系条件培养基中磷酸肽的相对定量。** A类，CM中磷酸肽富集的工作流程，包括TiO之前的亲水作用液相色谱分离步骤₂磷酸肽富集和随后的LC-MS/MS分析。B类，磷酸肽的Skyline峰面积复制视图，ETNLDpS公司LPLVDTHSKR，来源于波形蛋白，由前体离子M在*米/z*635.642. 监测来自五个管腔癌细胞系、一个基底A癌细胞系和四个基底B癌细胞系（每个细胞系两个生物复制品和两个注射复制品）的CM峰值，测得的峰面积平均值分别为126、33和8538。这个星号在单独的重复中指示MS/MS的取样和磷酸肽的鉴定。C类，根据乳腺癌亚型聚类的MS1过滤峰面积图蓝色对于灯具，*棕色的*对于基础A，以及绿色对于基础B CM样本（每个细胞系两个生物复制和两个采集复制保持相同的符号）。

**图7。**
**监测SIRT3 KO小鼠线粒体蛋白的乙酰化谱。** A类，WT和SIRT3 KO动物骨骼肌线粒体乙酰肽富集的工作流程示意图，包括Lys-乙酰肽的抗乙酰赖氨酸富集，两个注射复制品的LC-MS/MS，以及在Skyline中生成用于MS1过滤和相对定量的光谱库。B类，四只WT和四只SIRT3 KO小鼠骨骼肌样品中三种蛋白质不同部位的单个胰蛋白酶乙酰赖氨酸肽的峰面积强度比（KO:WT）。#表示重要性：第页<0.05（双尾学生）t吨测试；n个WT和SIRT3为4^−/−（KO），每个样品两次注射。

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1. Mueller L.N.、Brusniak M.Y.、Mani D.R.、Aebersold R.（2008）基于质谱的定量蛋白质组学数据分析的软件解决方案评估。蛋白质组研究杂志7，51–61-公共医学
1. Ong S.E.、Blagoev B.、Kratchmarova I.、Kristensen D.B.、Steen H.、Pandey A.、Mann M.（2002）《细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记》，SILAC，作为一种简单而准确的表达蛋白质组学方法。分子细胞。蛋白质组学1，376–386-公共医学
1. Krüger M.、Moser M.、Ussar S.、Thievessen I.、Luber C.A.、Forner F.、Schmidt S.，Zanivan S.、Fässler R.、Mann M.（2008）定量蛋白质组学SILAC小鼠发现kindlen-3是红细胞功能的一个必要因子。手机134、353–364-公共医学
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[2] Bantscheff M.、Schirle M.、Sweetman G.、Rick J.、Kuster B.（2007）《蛋白质组学中的定量质谱学：评论》。分析。Bioanal公司。化学。389, 1017–1031-公共医学

[3] Mueller L.N.、Brusniak M.Y.、Mani D.R.、Aebersold R.（2008）基于质谱的定量蛋白质组学数据分析的软件解决方案评估。蛋白质组研究杂志7，51–61-公共医学

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[5] Ong S.E.、Blagoev B.、Kratchmarova I.、Kristensen D.B.、Steen H.、Pandey A.、Mann M.（2002）《细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记》，SILAC，作为一种简单而准确的表达蛋白质组学方法。分子细胞。蛋白质组学1，376–386-公共医学

[6] Ong S.E.、Blagoev B.、Kratchmarova I.、Kristensen D.B.、Steen H.、Pandey A.、Mann M.（2002）《细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记》，SILAC，作为一种简单而准确的表达蛋白质组学方法。分子细胞。蛋白质组学1，376–386-公共医学

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[8] Krüger M.、Moser M.、Ussar S.、Thievessen I.、Luber C.A.、Forner F.、Schmidt S.，Zanivan S.、Fässler R.、Mann M.（2008）定量蛋白质组学SILAC小鼠发现kindlen-3是红细胞功能的一个必要因子。手机134、353–364-公共医学

[9] Zanivan S.、Krueger M.和Mann M.（2012）体内定量蛋白质组学：SILAC小鼠。方法分子生物学。757, 435–450-公共医学

[10] Zanivan S.、Krueger M.和Mann M.（2012）体内定量蛋白质组学：SILAC小鼠。方法分子生物学。757, 435–450-公共医学

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