在人类中已鉴定出三种主要的HP1同系物，即HP1α、β和γ。这些副记录包含一个结合组蛋白H3赖氨酸9甲基（H3K9me）标记的Chromodomain（CD），一个二聚化的Chromoshadow结构域（CSD），为招募多种配体蛋白提供接口，一个连接CD和CSD的铰链（H）区域，以及非结构化的N和C末端()2,4HP1β和HP1γ在其CD和CSD结构域中显示>90%的序列保守性，但其功能与HP1α截然不同5,6虽然HP1α通常与沉默的异色区相关，但HP1β和HP1γ同时发挥基因沉默和基因激活作用7一个似是而非的假设是，保守度较低、结构较低的区域（铰链、N-和C-末端）负责不同HP1蛋白的独特特性8–11最近的研究表明，人类HP1αN末端延伸的磷酸化(，NTE）对细胞异染色质病灶的形成很重要12HP1β和HP1γ中没有相应的磷酸化位点13NTE磷酸化增加H3K9三甲基化尾肽的亲和力，并增强核小体内H3K9-三甲基标记的特异性5为了研究NTE磷酸化是否对HP1α有额外影响，我们生成了不同类型的磷酸化HP1α蛋白，如前所述()12.通过质谱和H3K9me3肽结合验证磷酸化(&)5,12.分离磷酸化对NTE或铰链的影响，铰链也被磷酸化体内，我们产生了HP1α的两个突变体(，nPhos-HP1α和hPhos-HP1α）。
HP1α相分离。一，HP1α突变体的示意图。CTE公司-C类-T型终端E类延伸，CSD-C类色度S公司阴影D类omain，H型铰链，CD-C类色度D类北爱尔兰奥曼-N个-T型终端E类延伸。b条，左侧面板：nPhos-HP1α在4°C、75 mM KCl、20 mM HEPES pH 7.2下的相分离。右侧面板：在10×下拍摄的相分离nPhos-HP1α显微照片。比例尺为50μm。c（c），使用S形函数测量饱和浓度的浊度分析。虚线表示计算的饱和浓度。d日，含或不含Sgo或LBR肽的nPhos-HP1α和nPhos-ΔCTE-HP1α的饱和浓度。e（电子），不同HP1α蛋白的饱和浓度使用自旋下降分析（插图）。测量需要三个独立的实验（n=3），误差条反映平均值的标准误差（s.e.m）。
在使用nPhos-HP1α时，我们观察到在冰上冷却蛋白质时会形成混浊溶液(，左侧面板）。升高温度或用碱性磷酸酶处理后，混浊溶液变得清澈(SI视频a和d). 显微镜下对混浊物质的研究显示出液滴(，右侧面板，SI视频b). 总之，这些观察结果表明了相分离，这是蛋白质具有内在无序区域的一个特征，以及多价的能力14,15事实上，NTE、Hinge和CTE区域包含具有高内在紊乱倾向的序列16与nPhos-HP1α不同，野生型HP1α在冷却时没有相分离。我们在室温（~22-24°C）下使用两种独立的方法量化了相分离的饱和浓度（参见&、和方法）。这是HP1α溶液作为两个独立相出现的浓度。nPhos-HP1α、Phos-HP1α和hPhos-HP1α蛋白的饱和浓度依次增加，而WT HP1α、HP1β和HP1γ蛋白在测试的最高浓度下未表现出可检测到的相分离(和). 用戊二酸（nE-HP1α）取代HP1α中的NTE丝氨酸不会引起任何相分离().
考虑到相分离与多价相互作用有关，我们研究了nPhos-HP1α是否形成更高阶的低聚物。我们发现nPhos-HP1α在二聚体之外确实形成了更高阶的低聚物(和)与WT HP1α和HP1β相反，它们没有显示可检测的高阶齐聚。总的来说，能够进行相分离的HP1蛋白表现出高阶齐聚，而那些没有相分离的蛋白表现出无法进行高阶齐聚化(和). 这些数据表明，相分离取决于聚合物间的接触。使用SAXS（小角度X射线散射）进行的成对距离测量表明，nPhos-HP1α的分子比WT HP1α的分子长得多（Dmax~220ºvs.130º，). SEC-MALS（尺寸排除色谱-多角度光散射）研究进一步支持磷酸化后的扩展构象().
NTE磷酸化促进HP1α齐聚和构象变化。一300μM WT HP1α和nPhos-HP1α的沉积速度AUC分析。b条，WT HP1α和nPhos-HP1α的P（r）分布得到SAXS。2倍稀释（绿色实线与黑色虚线）不会显著改变nPhos-HP1α的Dmax，表明数据报告主要是二聚体状态(). 插图：描述方法中所述生成的HP1α二聚体的两种可能构象的模型。c（c），HP1α如何在紧凑和扩展状态之间切换的模型：N-末端磷酸盐与基本铰链残基相互作用，以稳定扩展状态下的二聚体间接触并促进高阶齐聚。中显示的三个独立实验的痕迹一和b条（n=3）。
我们假设延伸构象暴露出带正电荷的铰链残基，使一个二聚体中磷酸化的NTE与另一个二聚体中的铰链残基可相互作用(). 为了测试这种可能性，我们将铰链中的一个保守的基本补丁突变为丙氨酸（残基89–91，b条专用集成电路第页匹配米乌塔特）(，Phosbpm-HP1α）。Phosbpm-HP1α在磷酸化驱动的齐聚和相分离方面都有缺陷(,). 此外，在我们生成的各种HP1β和HP1α嵌合体中，只有同时将HP1α的铰链和磷酸化NTE交换为HP1β的嵌合体形成了高阶低聚物(，PhosNH-α/β嵌合体）。这些结果表明，寡聚反应需要HP1α特异的铰链和NTE的序列特征。
为了确定有助于稳定WT HP1α紧密构象的HP1α区域，我们使用BS3（双（磺基琥珀酰亚胺）琥珀酸）进行交联，然后进行质谱分析(). 我们发现CTE和铰链之间存在几个推测的HP1α间交联（74个中的21个，补充表格). 与nPhos-HP1α相比，在NTE磷酸化（nPhosΔCTE-HP1α）的背景下删除14 aa CTE可将饱和浓度降低约10倍(). 这些结果表明，CTE和铰链之间的相互作用使HP1α二聚体稳定在紧凑的自抑制状态，不能进行多价相互作用(). 因此，我们假设结合CSD-CSD界面的配体可能会改变nPhos-HP1α的闭合和开放状态之间的平衡，从而调节CTE稳定紧致状态的能力。Shugoshin 1（Sgo1）和层粘连蛋白B受体（LBR）蛋白已被证明通过Shugoshin中的特定PxxVxl样序列和LBR中的不同序列与HP1α的CSD二聚体直接相互作用1,三因此，我们研究了这些序列作为肽对nPhos-HP1α的相分离性质的影响。
与之前的工作一致，这两种肽都与CSD-CSD二聚体特异性结合()1,17有趣的是，Sgo肽促进了相分离，当以100μM的浓度添加时，饱和浓度降低了约3倍(,SI视频c中的视频). Sgo肽也促进nPhos-HP1α齐聚(). 相反，LBR肽的添加抑制了相分离()并且没有促进nPhos-HP1α齐聚(). H3K9甲基化和未甲基化尾肽以及同等浓度的精胺也促进了相分离(). 由于H3尾肽富含赖氨酸和精氨酸，这些结果表明，除了特殊配体（如Sgo肽）直接调节HP1α齐聚，其他分子也可以通过一般静电效应促进相分离().
在中的模型中，NTE上的磷酸盐与相邻二聚体的铰链区域进行桥接相互作用。铰链也在HP1α和HP1β的上下文中结合DNA5因此，我们想知道DNA是否可以桥接相邻的HP1分子，并通过其固有的多价性促进相分离。DNA饱和浓度导致WT HP1α形成液滴，但令人惊讶的是，没有导致HP1β形成液滴(). 突变HP1α铰链中与DNA相互作用的基本补丁可消除液滴形成(). 为了更好地理解这一现象，我们使用了DNA幕分析和全内反射荧光显微镜（TIRFM）来观察HP1对λ-DNA底物的影响()通过荧光染料YOYO-1嵌入DNA4.
与DNA相互作用的后果。一，DNA结合导致与WT HP1α而非HP1β形成液滴。突变HP1α铰链残基（bpm）或破坏CSD二聚体（CSDm）可抑制DNA驱动的相分离。b条，DNA帘幕示意图。流动细胞中的流体脂质双层允许系留DNA链扩散到具有缓冲流的纳米制造屏障（黑色箭头表示方向）c（c），DNA压实分析卡通。用嵌入染料YOYO（黄星）标记的DNA随着时间的推移（水平箭头）被压实（垂直箭头），并添加HP1α。DNA压实的宽场TIRF显微图像d日、WT-HP1α和e（电子）nPhos-HP1α在不同时间点，比例尺为5μm。平均波形图（f），WT-HP1α（N=422）和克nPhos-HP1α（N=371）覆盖平均压实速度（虚线）和标准偏差（实线）拟合。小时，显示WT HP1α（顶部）和nPhos-HP1α（底部）压实的单个波形图。我，四个面板显示了WT HP1α在反式中压实DNA的时间过程，底部的时间以秒为单位。星号表示个体泪点的形成。j个，HP1α（WT、nPhos和BPM）和HP1重叠的DNA压实轨迹β.
WT HP1α对DNA的作用似乎是协同的，正如荧光点的出现所表明的那样，这是局部致密化导致YOYO-1标记DNA局部浓度较高的结果(). 非合作机制将表现为压实过程中荧光的全球增加。通常，对于WT HP1α，会出现一个单点，然后是快速[vav（平均值）=2.25μm/s+/-0.026，（SEM）]压缩48.5 kbp（~12μm）λ-DNA分子的其余部分，而点外荧光不增加(和SI视频g). 这种压实主要是由静电相互作用驱动的，因为增加的单价盐会逆转压实(). 相比之下，YOYO-1的强度较低，DNA链在nPhos-HP1α与DNA的初始结合和压实过程中经常出现多个荧光点()表明HP1α磷酸化干扰了与DNA的协同结合。此外，WT HP1α能够在低浓度下压缩DNA(). 最后，虽然nPhos-HP1α能够完全压实λ-DNA，但其压实DNA的速度较慢[1.1μm/s+/-0.15，（SEM）]，与WT HP1α相比变化更大().
在某些情况下，品牌间DNA相互作用清晰可见，表明跨μm尺度的桥接(). 这种连接至少需要由约100个WT-HP1α二聚体组成的中尺度蛋白质-DNA网络。因此，相分离的能量学可以在DNA结合、压实和组织的动力学中发挥关键作用，而不会形成宏观液滴。有趣的是，尽管HP1β的铰链中含有几个带正电荷的残基，但它不能致密DNA或产生点状突起(和)与HP1β不能与DNA形成液滴一致(). bpm-HP1α的DNA压实行为受到了严重关注(和)这表明，与相分离和结合DNA的能力一样，HP1α对DNA的压实也涉及到铰链中的这个基本补丁。
基于这些数据，我们提出磷酸化和DNA结合发挥相关作用。在这个模型中，一个二聚体中的NTE磷酸盐与另一个二聚体铰链中的碱基残基进行静电相互作用，导致（i）CTE介导的自抑制减轻，以及（ii）暴露特定残基以进行高阶相互作用(和). DNA与铰链的结合可以类似地取代WT HP1α中的CTE，从而暴露出新的相互作用表面。此外，多个WT HP1α分子与DNA结合可增加WT HPlα的局部浓度，可能进一步促进高阶HP1α相互作用和液滴形成。或者，通过一个WT HP1α二聚体桥接DNA的两个区域可以局部改变DNA构象，从而促进额外WT HPlα二聚物的结合，而无需高阶齐聚。我们的模型还暗示NTE磷酸化应该与DNA结合竞争，并有助于解释为什么nPhos-HP1α的DNA压实与WT HP1α相比合作性较差且速度较慢(). 与这种竞争一致，先前的研究表明，HP1α的NTE磷酸化降低了DNA结合5.
接下来，我们研究了已知的核成分如何与相分离的HP1α相互作用。我们使用Cy3标记的成分来观察和测量它们在nPhos-HP1α液滴中的分配(). 核心核小体，147bp dsDNA和Aurora B激酶，HP1α的已知相互作用伙伴，都位于液滴中。标记有YOYO-1的H3K9三甲基十二核小体阵列也很容易并入nPhos-HP1α液滴。相反，还原的Cy3马来酰亚胺染料和Cy3标记的细菌Hsp90似乎被排除在nPhos-HP1α液滴之外(). 自旋下降分析给出了类似的定性结果(). 使用该分析，我们还发现核心转录因子TFIIB既没有在HP1α相中富集，也没有从HP1α相中排除。这些结果表明，与HP1α相互作用的大分子可以在HP1α为主的相中保持溶剂化，而其他大分子则被排除或按体积分配。
特定大分子在HP1α相中的分配以及HP1α分子在细胞中的行为。一，分别使用Cy3荧光或YOYO荧光显示具有Cy3标记或YOY标记宏观分子的相分离nPhos-HP1α液滴的显微照片。对于每个面板，显示了三个独立实验的代表性显微照片。比例尺为50μm。b条、用Cy3标记的HP1蛋白转导的NIH3T3细胞和点状分布的分类。右上图：每个单元格中不同点的平均数量。右下角图：至少有一个大点的单元格百分比。大冲头被定义为在Z投影的XY尺寸内的任何方向上直径>5μm。比例尺为10μm。误差条表示平均值的标准误差。nPhos-HP1α（N=36）、WT-HP1α（N=38）和CSDm-HP1α。c（c），染色质组织中调节相分离作用的模型。
结果在提出了相分离有助于分隔细胞中异染色质成分的可能性。因此，我们研究了HP1α的相分离行为如何与其在核内的定位相关。我们使用Chariot传递系统将化学标记的HP1蛋白直接传递到NIH3T3细胞18我们使用直接蛋白质传递来确保高水平的NTE磷酸化，因为基因编码的GFP标签抑制磷酸化驱动的相分离在体外(). 我们使用一个小的C末端“KCK”标记用Cy3标记HP1蛋白，这允许相分离(). 90分钟后，与WT HP1α相比，含有nPhos-HP1α的细胞比例更大（>5μm），而nPhos-HP1α的平均点状细胞数量更少。这些结果与nPhos-HP1α与WT HP1α相比具有更高的齐聚性和多价性一致(). 二聚化和DNA驱动相分离缺陷的HP1α突变体CSDm-HP1α表现出更广泛的定位().
异染色质扩散的部分原因是HP1蛋白在H3K9甲基化染色质上的寡聚8.使用S.pombe公司HP1蛋白Swi6已经证明了这种高阶齐聚作用及其对沉默的重要性体内19然而，迄今为止，人类HP1蛋白的高阶齐聚还没有报道20,21相反，以前的研究表明，HP1α和HP1β的二聚体在核小体和紧密染色质之间架起桥梁20,22,23在这里，我们表明，NTE磷酸化可以促进HP1α的高阶低聚()并且进一步地，高阶低聚与相分离强烈相关。假设每个核小体结合一个磷酸化的HP1α二聚体，简单计算得出具有20bp DNA连接子的延伸染色质上HP1α的局部浓度>100μM，与本研究中测量的饱和浓度相当。Shugoshin和LBR等配体可以进一步提高或降低饱和浓度。因此，根据核环境的不同，异染色质可以以更宽松的可溶状态或更少的相分离状态存在。此外，相分离的两种不同驱动因素，DNA结合和NTE磷酸化，可以提供不同的质量调节异染色质的方法。例如，当需要快速染色质压实时，可以利用结合DNA的相分离。值得注意的是，WT HP1α压缩λ噬菌体DNA的速度比其自身的衣壳包装马达快约15倍，但抵抗的力较小()24相反，NTE磷酸化可能提供了一种调节异染色质小体大小的方法，因为磷酸化可以使大规模组装无需DNA结合。
对核仁和P颗粒等非膜结合细胞体进行了大量研究15,25据推测，染色质组织也可能包含相分离机制26,27我们的发现为这种可能性提供了实验证据。HP1异染色质中的相分离作用也由果蝇属28最简单的是，相分离的HP1α液滴可以物理隔离和致密染色质，同时可以招募抑制因子(). 然而，仍然存在许多基本问题：相分离异染色质内的物理化学环境的性质是什么；其他异染色质成分如何改变这种环境；HP1α构象主要维持在相分离状态吗？以研究其他相分离细胞体的方法为基础，将为解决这些问题提供强有力的方法15,25.
方法
蛋白质纯化
将全长人HP1α克隆到pBH4表达载体中，按照快速克隆方案使用定点突变技术制备突变体，并从大肠杆菌中纯化蛋白质。28磷酸化HP1是通过在pRSF-Duet载体中与CKII的催化亚基共表达获得的。从大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中纯化HP1蛋白如下。用50μg/mL卡宾西林和25μg/mL氯霉素在2XLB中于30°C下将细胞培养至OD.4。为了与pRSFduet CKII质粒共表达，添加25μg/mL卡那霉素。然后在18°C下将细胞生长至OD.8，并用.3 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导14小时。将收集的细胞重新悬浮在裂解缓冲液中（1XPBS pH 7.2、300 mM NaCl、10%甘油、7.5 mM咪唑和蛋白酶抑制剂苯甲烷磺酰氟、胃蛋白酶抑制素A、抑肽酶和亮肽）。在C3乳化液（Avestin）中溶解后，通过25000g离心35分钟去除细胞碎片。将澄清的裂解液与钴-NTA亲和树脂（Clontech）在4°C下培养40分钟。然后用约50 mL裂解缓冲液清洗树脂，并用20 mM HEPES pH 7.2、150 mM KCl和400 mM咪唑洗脱。蛋白质用3 mg/mL TEV蛋白酶隔夜裂解，同时透析到20 mM HEPES（pH 7.2）、150 mM KCl、3 mM DTT中以去除咪唑。然后将蛋白质注射在Mono-Q 4.6/100 PE阴离子交换柱（GE）上，清洗并用120–800 mM KCl梯度洗脱15个柱体积。然后将蛋白质浓缩在Amicon Ultracel-10K自旋浓缩器中，然后注射到Superdex-75 16/60大小的排除柱上，该排除柱带有存储缓冲液（20 mM HEPES pH 7.2，200 mM KCl，1 mM DTT，10%甘油）。在液氮中快速冷冻之前，蛋白质在Amicon浓缩器中浓缩至~1 mM2。浓度通过280 nM下的紫外线吸收率和计算的消光系数ε=29495进行测量。在未磷酸化HP1α（ΔCTE-HP1）的环境中去除14 aa CTE会导致快速降解和不稳定蛋白质。然而，ΔCTE HP1α与CKII的共同表达可稳定蛋白质（nPhosΔCTE-HP1α）。nPhosΔCTE-HP1α蛋白在25°C下与35000聚乙二醇进行透析浓缩，因为其在自旋浓缩期间容易形成水凝胶。随后以这种方式浓缩WT和磷酸化蛋白，以确保AUC没有观察到伪影。
人类TFIIB和Aurora B DNA序列在IDT的gBlocks中排序，并克隆到pBH4载体中。虽然使用单-S阳离子交换柱代替单-Q，但蛋白质的纯化与上述类似。
nPhos-HP1α突变体的铰链中有丝氨酸残基突变为丙氨酸，因此它只能在NTE中被磷酸化。相反，hPhos-HP1α突变体的NTE的丝氨酸残基突变为丙氨酸，因此它只能在铰链中被磷酸化。
沉降速度分析超速离心
蛋白质在4°C下透析至HEPES 7.2、75 mM KCl和1 mM DTT过夜。浓度通过280 nM的紫外线吸收率进行检查。样品在适当温度下在真空下预平衡转子中培养50分钟。在Beckman XL/a分析超离心机中以50K rpm的转速运行8-10小时。扫描在250或280 nm处收集，径向步长为0.003 cm，间隔约60秒。运行一式三次，以确保分析中没有实验伪影。使用SEDFIT/SEDPHAT（NIH）软件进行SV分析，并使用GUSSI生成曲线图。29,30使用Sednterp软件计算实验参数如下：HP1αvbar-.72820、HP1βvbar-.92794、缓冲液密度-1.002、缓冲液粘度-0.0089。由于AUC检测到的nPhosΔCTE-HP1α的最低浓度显示出大量的相分离，因此评估nPhos△CTE-HPIα齐聚特性的尝试没有定论。
SEC-MALS公司
蛋白质在25°C的Shodex KW-803柱上注射。缓冲液为pH 7.2的20 mM HEPES和75 mM KCl，DTT为1 mM。再次在pH 6.8下运行样品，以排除柱相互作用对洗脱体积的可能影响。注射前运行BSA标准进行内部校准。
SAXS测量和分析
测量前对所有样品进行透析，以获得匹配的缓冲液。SAXS实验是使用带有线准直照明的内部仪器（Anton Paar SAXSESS MC2）进行的。使用吉尼亚曲线图检查减去缓冲区的数据的聚集性。使用用Python和Fortran90编写的自定义软件，使用NumPy、SciPy、Matplotlib和PyQtGraph库（UCSFsaxs，可在https://github.com/delnatan/UCSFsaxs). 该软件实现了一种贝叶斯算法，用于确定最佳最大粒子直径和平滑因子，以将散射数据拟合到两两原子间距离分布P（r）31。这是通过求解正则化最小二乘方程实现的（在矩阵形式中，矩阵用黑体表示）：
其中J是最小二乘目标函数，x是要求解的P（r）。b是散射强度矢量。L是近似二阶导数的带状矩阵。Alpha是平衡数据过拟合和P（r）平滑度的平滑因子。矩阵Z除第一个和最后一个元素（设置为1）外，到处都是零。矩阵Z用任意大的值β（设置为100倍α）惩罚P（r）端点的非零值。此优化是使用SciPy的非负最小二乘（NNLS）例程完成的。优化。
中的模型利用系综优化方法从SAXS包络和两个结晶HP1结构域CSD（3Q6S）和CD（3FDT）生成（插图），这些结构代表HP1α二聚体的两种可能构象。32,33
交叉链接质谱和磷酸肽分析
将WT HP1α与1mM BS3在室温下交联5分钟，并通过加入10mM Tris碱而猝灭。使用预制的4–20%Bis-Tris凝胶通过SDS-PAGE对样品进行解析，并通过考马斯染色。切除对应于单体和二体HP1α的凝胶带并消化胰蛋白酶34提取的肽在Orbitrap Velos（Thermo Scientific）质谱仪、纳米电喷雾离子源和NanoAcquity UPLC系统（Waters）上进行脱盐和分析。肽在15 cm×75μm ID的PepMap C18柱（Thermo）上分离，使用含0.1%甲酸的3–28%乙腈的60分钟梯度。Orbitrap分析仪在350–1800 m/z（质量分辨率：30000）的扫描范围内测量前驱体MS扫描。在线性离子阱（隔离窗：4 m/z）中分离出六种最强烈的三重带电或更高的前体，用HCD解离（归一化碰撞能量：30），并在Orbitrap中测量产物离子光谱（质量分辨率：7500）。应用了30秒的动态排除窗口。每个条件分析三个技术重复。
使用Proteome Discoverer（Thermo）生成峰值点，并使用Protein Prospector 5.14.20进行搜索35对SwissProt的数据进行了初步的无偏搜索（自2012年3月21日起，共有535248条数据），结果表明，按光谱计数，样本主要由人类HP1α组成（>90%）。随后对交联肽的搜索仅限于人类HP1α的序列和接下来的15种最丰富的蛋白质，这些蛋白质由来自大肠杆菌以及残留的TEV蛋白酶。此外，这些蛋白的随机版本被包括在错误发现率分析（FDR）的搜索数据库中。利用以下参数对85个最强烈的产物离子峰进行交叉链接搜索：酶特异性：胰蛋白酶，3-缺失裂解；质量公差：8 ppm（前体），25 ppm（产品）；交联剂：DSS/BS3；可变修饰：Ser/Thr/Tyr处的磷酸化，Met处的氧化，N-末端Glu转化为pyroGlu，蛋白质N-末端的Met损失和/或乙酰化，通过半水解BS3对Lys进行死修饰；持续修饰：Cys的氨基甲酰化。据报告，交联肽的Prospector得分大于20，得分差异大于6.5，对应的FDR低于1%。通过将二聚体凝胶带中唯一识别的一组交联残基对与相应的单体带进行比较，推测HP1α分子间交联被指定。
在Q-Exactive Plus Orbitrap仪器（Thermo）上对溶液中胰蛋白酶化样品的N-末端磷酸化HP1α进行了磷酸肽分析。直接分析肽（无磷富集）。进行了三次技术复制，并使用Protein Prospector搜索磷酸肽作为Ser和Thr残基的可变修饰。
Native-MS公司
使用Exactive Plus EMR仪器（Thermo Scientific，San Jose，CA，Lu等人，2015）进行自然质谱分析，该仪器使用在水中制备的5 mg/mL CsI溶液进行外部校准。在分析之前，使用在同一缓冲液中预先平衡的MicroBiospin-6色谱柱（Bio-Rad，Hercules，CA）将蛋白质样品缓冲交换成150 mM的pH值为7.5的醋酸铵。使用离线Au/Pd涂层硼硅酸盐发射器（NanoES喷雾毛细管、Medium、ES380、Thermo Scientific）以10–40 nL/min的流速将蛋白质样品引入质谱仪米/z在正离子模式下为500–20000，取其平均值，然后导出用于反褶积和后续使用PeakSeeker和Unidec生成零电荷质量值36,37采用以下实验参数对样品进行分析：喷雾电压（0.8–1.5 kV），注入电压=5；平板间透镜=5；弯曲平板=5；传输多极=2；C-trap入口透镜=2，源直流偏移（25 V），碎片能量（CE=25和CID=65），注入时间（200μsec），捕获气体压力（7.5），分辨率（17500个任意单位），毛细管温度（250°C），S-len RF电平（200 V），微扫描（10）和AGC（1e6）。
饱和浓度测量
这些实验在室温（~22–24°C）下在含有75 mM KCl、20mM HEPES pH 7.2和1 mM DTT的缓冲液中进行。
离心降速试验
在这种方法中，我们将相分离材料旋转至10000g，从而形成两相溶液，低浓度相存在于顶层，高浓度HP1α相存在于管底部(). 测量顶层中HP1α的浓度，以获得相分离的饱和浓度。将10μL样品在适当的温度下孵育5分钟，然后在台式离心机中以10000×G离心5分钟。去除4μL上清液，在纳米滴仪器上进行A280测量，一式三份。用移液管或旋涡将样品送回混浊溶液(SI视频f).
浊度法
该分析通过340 nm处的吸光度测量相分离溶液的浊度(). 在该方法中，饱和浓度由浊度达到一半最大值时的浓度定义。在12管PCR条带中进行连续稀释。然后将20μL样品添加到底部384孔板（Corning）中，并在340 nm处在Spectramax M5板阅读器中读取吸光度。对于肽添加，添加、混合1μL适当浓度的肽，并在读取之前培养5分钟。
显微镜
使用10×或40×气动物镜在徕卡Axiovert 200M显微镜上对液滴进行显微镜观察。对于Cy3检测，使用520 nm激光和560±20 nm发射滤光片激发样品。一个定制的氮气室用于冷却实验，以消除冷凝。YOYO标记阵列和NIH3T3细胞通过Andor Zyla 4.2 cMOS相机在尼康Eclipse共焦显微镜上进行成像。图像分析是在ImageJ和Python中完成的。对于水滴图像，通过将图像除以空白图像来消除物镜上的明显斑点，从而对图像进行背景校正。用YOYO染料标记nPhos-HP1α和H3K9me3 12核小体阵列的显微照片，并用488激光进行可视化。
蛋白质标记
在HP1的C末端克隆了一个插入不稳定半胱氨酸的“GSKCK”肽标签。半胱氨酸133突变为丝氨酸，以利于C末端标记。将蛋白质透析到标记缓冲液中（20 mM HEPES pH 7.2，350 mM KCl，.5 mM TCEP），并将浓度调节为200μM。将1:1摩尔比的Cy3马来酰亚胺与HP1添加到100μL蛋白质中，混合，然后在5秒后用过量的β-巯基乙醇淬火。使用illustra G-50柱从标记蛋白中分离游离染料。根据Cy3染料吸收和A280测量结果，所有蛋白质都被确定为40–45%的Cy3标记，使用150000M−1厘米−1Cy3和29495 M在552 nm处−1厘米−1HP1α在280 nm处。
细胞培养和成像
NIH/3T3细胞（CRL-1658）来自ATCC。细胞在补充有10%小牛血清的DMEM H-21培养基中在37°C和5%CO条件下生长2将约10000个细胞置于总体积为100μL的玻璃底康宁环状烯烃96孔板上，并生长至汇合过夜。使用纳米滴仪器定量3μg总标记蛋白，并用Chariot载体肽系统转导。战车（Active Motif，CA）是一种非细胞毒性药物，能有效地将蛋白质输送到细胞核中。细胞用PBS清洗一次，90分钟后用4%多聚甲醛固定。再过15分钟，取出固定液，用1μg/ml Hoechst 33342替换PBS中的固定液。实时成像实验证实，在固定过程中，核结构没有出现伪影。然后在尼康钛蚀共焦显微镜上观察细胞。核内有Cy3信号的细胞用40×物镜成像，使用步长为0.5μm的16μm Z堆叠。Hoechst染色显示死亡或分裂的细胞被排除在外。细胞在不同的孔中重复转导用于技术复制，并在不同的细胞传代中转导用于实验复制。
核小体阵列构建
修改了以前工作中的协议。38使用DNA模板组装重组的12-mer阵列爪蟾组蛋白存在于载体DNA中，以确保适当的负载。通过DraI和PAGE纯化pUC19载体主干中的载体DNA。使用EcoRV和纯化的PAGE从pUC57骨干质粒中消化阵列DNA。从2-.2M氯化钠中进行透析，以在DNA上组装组蛋白八聚体。用HpaI消化重组阵列样品，并在天然5%聚丙烯酰胺凝胶上运行，以确保正确组装。然后在5–25%蔗糖梯度上纯化阵列。样品在Beckman Ti-55转子中以35000 rpm在4°C下旋转8小时。离心后，收集样品并在聚丙烯酰胺凝胶上消化分析。将样品汇集、浓缩并储存在−80°C下。
构件
1
KCK HP1：添加到C末端的“GSKCK”序列和突变为丝氨酸的不稳定半胱氨酸133
bpm HP1α：K89、R90、K91突变为丙氨酸
nPhos HP1α：S92、S95、S97突变为丙氨酸并与CKII共同表达
ΔCTE HP1α：氨基酸178–192（PEDAENKEKETAKS）去除
hPhos HP1α：氨基酸S11、S12、S13、S14突变为丙氨酸并与CKII共同表达
nE:S11-14突变为谷氨酸
2
HIS-TEV-‖ηα/β嵌合物（来自HP1α的N末端和铰链，带有Chromodomain、Chromoshadow结构域，以及来自HP1β的CTE）： 三
HIS-TEV-Ntermα/β嵌合体（来自HP1α的N端，带有铰链、Chromodomain、Chromoshadow结构域，以及来自HP1β的CTE）： 三
4
5
HIS-TEV-Aurora B激酶-人丝氨酸/苏氨酸激酶Aurora-B。
多肽
Sgo1（来源于人类Shogusin-like蛋白1）：NVSLYPVVKIRRLSPKKNK
LBR（源自人类拉明B受体）：DIKEARREVEVKLTPLILKP
H3（来源于爪蟾组蛋白H3）：ARTKQTARK（me3）STGGKA
与N-末端荧光素相同的肽用于各向异性研究。所有肽均购自BioBasic。
DNA帘幕实验
如前所述，制造了微流体装置，并进行了DNA帷幕分析39,40简单地说，在流动细胞组装后，脂质双层沉积在样品室的表面上，λ-噬菌体DNA通过生物素-链霉亲和素连接锚定在双层上。然后通过施加流体动力使DNA沿着扩散屏障的前缘排列。HP1压实试验在含有20 mM HEPES（pH 7.2）、70 mM KCl、2 mg/ml BSA、0.8%葡萄糖、YOYO-1和葡萄糖氧化酶-钙化酶加氧系统的反应缓冲液中进行。将HP1在反应缓冲液中稀释至50μM的浓度，然后注入流动池以开始每次实验。为了反向压实，使用添加了0.5 M KCl的反应缓冲液从样品室中冲洗HP1。通过使用python编写的定制软件和scikit-image软件包跟踪YOYO-1 DNA分子荧光来确定压实率。
数据可用性
所有相关数据均包含在主手稿、扩展数据图和补充信息文件夹。如有合理要求，可从相应作者处获得任何其他数据。
