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神经科学杂志。2007年3月21日；27(12): 3260–3267.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.4033-06.2007
预防性维修识别码：PMC6672460型
PMID：17376986

碱性成纤维细胞生长因子在小鼠器官型皮层培养中调节血管密度并保持紧密连接：一种新的体外试验血脑屏障模型

科尔斯汀·本菲尔德,通讯作者1 Vesna Radojevic公司,2 约瑟夫·卡普哈默,2和科杜拉·尼奇1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

本研究旨在检查血管的维护在体外在小鼠皮层器官型切片培养中，特别强调碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2），已知其可促进血管生成并保持血脑屏障的完整性。将新生鼠第3天或第4天的脑切片保存3、7或10天在体外（DIV）在标准培养条件下或在FGF-2存在下。因子VIII相关抗原或层粘连蛋白的免疫组织化学显示，在标准条件下，血管数量相对较少。相反，适度的FGF-2浓度增加了血管数量：与对照组相比，0.5 ng/ml FGF-2在DIV 3后增加了1.4倍，在DIV 7后增加了1.5倍；在这两种情况下，5纳克/毫升的剂量几乎增加了一倍。当超过50 ng/ml时，FGF-2血管在DIV 3后减少，或在DIV 7后与对照组相似。FGF受体1优先在内皮细胞上发现；配体的存在降低了其免疫标记。溴化乙锭类似物或凋亡标记caspase-3检测到的细胞死亡在10天的培养期内几乎检测不到。紧密连接蛋白ZO-1（闭塞带蛋白1）、闭塞素、克劳丁-5和克劳丁-3的免疫标记显示，在中等FGF-2浓度的情况下，血脑屏障的结构完整。总之，FGF-2维持血管在体外并保持紧密连接的成分。因此，我们建议将FGF-2处理的器官型皮质切片作为血脑屏障机制研究的新工具。

关键词：血脑屏障、FGF-2、闭塞素、ZO-1、克劳丁-3、克劳丁-5

介绍

血脑屏障（BBB）是由广泛的内皮细胞间紧密连接网络（TJ）封闭的内皮细胞屏障(Kniesel和Wolburg，2000年). 中风和癫痫等疾病会导致血脑屏障紊乱，对神经功能产生有害影响。体外BBB模型采用分离内皮细胞培养或与星形胶质细胞共培养。然而，脑内皮细胞独特的BBB表型是周围神经组织持续影响的结果，包括周细胞、血管周小胶质细胞、星形胶质细胞和基底膜，尽管这种相互作用的细节仍不清楚(Bauer和Bauer，2000年;雅培，2002;Haseloff等人，2005年).

建立在体外皮层器官型切片培养（COSC）的BBB模型考虑了大脑组织元素的结构连通性，为在复杂的大脑环境中研究不同实验条件下的单个组织元素提供了独特的可能性。与传统的血脑屏障模型相比，血管仍然存在就地在维持结构中，允许自然环境中的细胞间相互作用体内合作伙伴。因此，我们对新生小鼠COSCs中存在碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2）的脑微血管和血脑屏障的特征进行了表征。

FGF-2主要由靠近BBB内皮细胞的星形胶质细胞产生(Sobue等人，1999年)并模拟星形胶质细胞对BBB的信号作用(加伯格，1998年,Klint等人，1999年). 它与内皮细胞上的FGF受体1（FGFR1）结合，表现出广泛的血管营养效应，并激活参与调节内皮细胞存活的信号通路(加伯格，1998年;Sobue等人，1999年). FGF-2也被发现可以降低血脑屏障的通透性在体外(El Hafny等人，1996年)这与缺乏FGF-2的突变小鼠显示紧密连接蛋白闭塞素和ZO-1水平降低以及BBB功能缺陷的发现一致(Reuss等人，2003年). 因此，我们假设FGF-2也可能是一种合适的工具来保存小鼠COSC中血管的BBB完整性，并研究其对其持久性和结构完整性的影响。

然而，由于切片培养物的外植和解剖造成的创伤，血管可能会死亡。此外，随着时间的推移，缺乏腔内血液灌注可能会导致影响血脑屏障的退行性变化。事实上，到目前为止，关于移植脑组织中BBB紧密连接蛋白的具体命运，尤其是克劳丁-5和克劳丁-3的具体命运尚不清楚，它们已被证明参与了小鼠脑微血管中BBB的建立和维持(Nitta等人，2003年,沃尔伯格等人，2003年).

在这里，我们首次表明，中等浓度的FGF-2促进小鼠脑COSC血管结构的维持，并以浓度依赖的方式增加其数量。如紧密连接蛋白claudin-5、claudin-3、clodin和ZO-1的存在所示，它也有助于维持内皮细胞间TJ，从而维持BBB功能。

材料和方法

培养方案。

COSC的制备和培养根据Stoppini等人（1991年）和Radojevic和Kapfhammer（2004）稍作修改。出生后第3天（P3）至P4野生型小鼠幼崽被迅速斩首。取下大脑后，粗略地将大脑皮层连同下面的纹状体或间脑部分一起解剖，并在组织切割器上切下350μm厚的冠状切片。将切片分离，放置在六孔培养皿中的Millicell-CM 0.4μm培养板上（每层膜六片；瑞士祖格州Millipore），并在37°C的增湿CO培养基中保存2-浓缩空气至少3d，以使组织从外植创伤中恢复。培养基由HEPES缓冲的最低必需培养基（50%）、HBSS（25%）和热灭活马血清（25%）组成，并辅以谷氨酸（2 m）米; Invitrogen、Eugene、OR）并调节至pH 7.3。

将FGF-2（Peprotech，London，UK）添加到培养基中（分别为0.5、5或50 ng/ml），每隔一天更换培养基。对照切片未用FGF-2处理。未使用抗生素或抗有丝分裂药。

免疫组织化学的准备。

通过免疫荧光分析切片的细胞分化和血管的形成。在室温（RT）下用4%PFA在PBS中固定培养物2小时，用PBS冲洗三次，并在室温下用含有PBS、0.5%Triton X-100和3%正常山羊血清的封闭溶液（BS）培养20分钟。

一级抗体在BS中稀释如下：兔多克隆抗因子VIII相关抗原（FVIII-rAg；1:250；Dako，High Wycombe，UK），小鼠单克隆抗FGFR1（1:250–1:1000；Millipore）兔多克隆抗层粘连蛋白（1:75；Sigma，St.Louis，MO），兔多克隆抗半胱氨酸-3（1:250；R&D Systems，Minneapolis，MN），兔多克隆抗闭塞素（1:100；Zymed，San Francisco，CA）、兔多克隆抗体ZO1（1:100，Zymed）、小鼠单克隆抗克劳丁-5（1:50；Zymet）、小鼠单克隆抗克劳汀-3（1:100）、兔多克隆抗GFAP（1:250）和鼠单克隆抗NeuN（1:250。

培养物在4°C下培养过夜，在RT下用PBS冲洗，并在RT下在BS中用Alexa Fluorochromes（Invitrogen）培养2小时。通过省略一级抗体来研究非特异性染色。切片用Vectashield安装介质（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）安装在玻璃载玻片上，并在配备AxiocamHR相机的蔡司（德国Oberkochen）Axiophot-microscope上观察。使用Photoshop（加利福尼亚州圣何塞，Adobe）调整录制图像的亮度和对比度。

共焦显微镜。

使用共焦激光扫描显微镜（LSM）（TCS4D；Leica Microsystems，Mannheim，Germany）对荧光免疫标记切片进行分析，该显微镜配备有Ar、Kr激光和声光器件（声光可调谐滤波模块）。在同步采集模式下，使用复消色差100×数值孔径（NA）1.4物镜记录图像。在使用中值滤波器抑制背景进行处理后，使用Imaris软件包（瑞士苏黎世Bitplane）的共定位模块分析图像堆栈。使用Leica LSM软件采集和重建图像，在Photoshop 9.0（Adobe）中进行裁剪、调整和优化。

细胞死亡的测定。

应用荧光探针Ethidium-homedimer1（EthD-1，生死试剂盒；Invitrogen）观察细胞死亡。EthD-1进入膜受损的细胞，与核酸结合后荧光增强40倍，从而在死亡细胞的细胞核中产生鲜红色荧光。EthD-1被活细胞完整的质膜排除。caspase-3标记显示细胞凋亡。

量化和统计。

血管网络根据Moser等人（2003年）进行了一些修改。血管交叉数以6×6网格（每平方米100×100μm；总视野0.25 mm）计算2). 在Photoshop中，用每片三个网格覆盖皮层切片的记录图像（10×0.63倍放大），并对每只动物的三个切片进行分析。中的值图2（括号内）表示各个切片的平均值。通过单向方差分析进行统计分析，随后进行Bonferroni校正事后（post-hoc）测试(第页<0.05定义为显著）。

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血管段的量化。微血管计数显示，对照组中的血管数量相对较少，其数量以浓度依赖的方式增加，达到5 ng/ml FGF-2，与培养时间无关（例如，0.5 ng/ml时增加约1.5倍，5 ng/ml时增加2倍）。与对照组相比，过量的50 ng/ml FGF-2对防止血管丢失无效。与DIV 3相比，DIV 7微血管的绝对数量减少了一半。与控制相比，给出了显著性(*第页≤ 0.05; ***第页≤ 0.01). 误差条表示SEM。

结果

血管持续存在中等浓度的FGF-2

P3和P4小鼠切片中的脑微血管对特定浓度的FGF-2暴露有强烈反应，如FVIII-rAg标记所示，FVIII-rAg是鉴定内皮细胞和血管结构的最佳标志物之一(图1).

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FGF-2治疗下新生儿皮质切片微血管的显示。A–C，标记FVIII-rAg的免疫荧光图像显示，在DIV 3与5 ng/ml FGF-2孵育后，COSC中存在微血管(A类)，第7部分(B)和DIV 10(C类). 血管呈现为完整且经常分支的结构，具有连续的线条（箭头）和交点（圆圈）。D类层粘连蛋白免疫染色也显示5 ng/ml FGF-2后DIV 10处血管网络的复杂性。E、 F类，没有FGF-2的对照外植体在DIV 3处显示较少的FVIII-rAg标记(E类)和DIV 7(F类). 注意，不连续的箭头表示很少有不连续的血管结构。G公司在DIV 7存在50 ng/ml FGF-2的情况下，几乎没有观察到免疫标记。H（H），对照切片省略第一抗体。比例尺，100μm。

在第3天，不含FGF-2的对照切片中含有相对较少数量的FVIII-rAg阳性血管在体外（DIV），在DIV 7时进一步下降。在中等FGF-2浓度下，与对照组相比，血管数量增加：在存在0.5 ng/ml FGF-2的情况下，DIV 3时增加了1.4倍，DIV 7后增加了1.5倍；FGF-2浓度为5 ng/ml时，其含量分别增加了1.8倍或2倍(图2). 相反，使用50 ng/ml FGF-2，DIV 3的血管数量比对照组减少1.7倍，DIV 7的血管数量保持在对照水平。一般来说，除了50 ng/ml集合外，随着培养时间的延长，血管消失，与DIV 3相比，DIV 7发现的血管减少了约50%。

定性地说，在存在0.5或5 ng/ml FGF-2的情况下，血管网络更加复杂。DIV 3后，船舶出现连续结构(图1A类)和DIV 7(图1B). 即使在DIV 10，也观察到复杂的血管网络(图1C类)细胞外基质蛋白层粘连蛋白的标记也证明了这一点(图1D类). 相比之下，在没有FGF-2的情况下，DIV 3后检测到少量碎片血管(图1E类)和DIV 7(图1F类). 在第7部分用超过50 ng/ml FGF-2处理的切片中，几乎没有发现FVIII-rAg标记的血管(图1G公司).

FGFR1定位于脑血管

为了显示FGF-2对血管作用的特异性，在DIV 7用FGFR1抗体和血管标记层粘连蛋白进行染色。共聚焦显微镜分析显示，层粘连蛋白染色勾勒出血管轮廓，血管壁局部区域存在FGFR1免疫反应性(图3A–C). Colocalization分析(图3A–C（插图）显示层粘连蛋白染色显示FGFR1免疫反应性强共定位。这两种情况都适用于微小毛细血管(图3A类)对于较大的船舶(图3B,C类). FGFR1的免疫组织化学检测在没有FGF-2治疗的情况下更为明显(图3A类,B)与经FGF-2处理的切片培养物相比(图3C类). 这种免疫反应性的降低可能归因于FGFR1在FGF-2处理的切片中被其配体占据。我们还分析了FGFR1免疫反应是否与星形细胞标志物GFAP共定位。GFAP染色的星形胶质细胞几乎没有发现共定位(图3D类)表明受体主要由血管壁的内皮细胞和/或其他细胞表达。总之，这些发现表明血管内皮细胞可能是FGF-2治疗的主要靶点。

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FGFR1本地化。A–D，FGFR1和血管标志物层粘连蛋白的共定位(A–C)或星形胶质细胞标志物GFAP(D类)双免疫荧光激光共聚焦显微镜显示。FGFR1免疫反应以红色显示，层粘连蛋白或GFAP免疫反应以绿色显示。黄色表示同位化。图中还显示了同位化程度，如插图所示A–D层粘连蛋白染色显示典型毛细血管的轮廓(A类)和更大的微血管(B,C类)DIV 7。FGFR1染色定位于血管的亚区；在血管外仅发现少量和微弱的FGFR1免疫反应性表达。注意FGFR1在对照组中的更广泛表达(A类,B)与FGF-2处理的切片相比(C类). GFAP染色的星形胶质细胞几乎没有发现FGFR1的共定位(D类). 所有图像均采用复消色差100×NA1.4物镜记录。

船舶保持在健康的环境中

由于中枢神经系统组织对微小的环境变化很敏感，因此必须验证在我们的培养条件下，切片中是否发生了细胞死亡，这可能会损害血管系统的完整性。

中等浓度的FGF-2能够很好地保护皮层的器官型细胞结构(图4). 神经元通过其对DNA结合的免疫反应，即神经元特异性蛋白NeuN进行鉴定，该蛋白存在于大多数神经元细胞类型中。标记显示在DIV 7处存在FGF-2的许多NeuN-阳性细胞，表明神经元分化(图4A类). 星形胶质细胞通过对GFAP的免疫反应进行鉴定，GFAP是一种只在大脑中表达的中间丝。在DIV 7处的GFAP标记显示，在未经治疗的对照组中，星形胶质细胞均匀分布，在整个皮层具有多个分支过程(图5B–D类)在FGF-2在场的情况下(图5F–K型). 未经治疗的对照组的GFAP（绿色）和FVIII-rAg（红色）双重染色显示，血管突起的尖端沿着血管粘贴(图5D类)以及在FGF-2存在的情况下(图5H–K型). 然而，如果没有FGF-2，大多数血管在DIV 7时已经消失(图1F类)和少数剩余的血管结构（如图5A类)看起来极度膨胀。

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切片培养的存活率。A类,B，皮层的器官型细胞结构保持完好(A类)在5 ng/ml FGF-2存在的情况下，组织的总体存活率较高(B).A类神经细胞的Inset、NeuN标记显示分化良好的细胞。B，如EthD-1染色所示，在DIV 7下几乎没有观察到细胞死亡。C–K型，DIV 7标记FVIII-rAg抗体（绿色）和EthD-1（红色）的皮质切片图像(C–F类)和DIV 10(G–K型).C类，插入，D–F型在DIV 7中，在存在5 ng/ml FGF-2的情况下，未观察到血管内皮细胞的细胞死亡。邻近神经组织中只出现了一些死亡细胞(E类，箭头，F类，覆盖）。G公司，插入，H–K型，在DIV 10，神经组织变性明显，但主要发生在切片的中央(我，箭头，K（K），overlay），表明神经元和星形胶质细胞退化，而不是皮质血管的内皮细胞。L–O型在培养物的皮层区域，包括皮层血管（层粘连蛋白染色，绿色），在DIV 10存在5 ng/ml FGF-2的情况下，caspase-3染色（红色）显示的凋亡细胞死亡几乎不存在。有时在皮层下区域的切片中心观察到神经组织的凋亡变性。c、 皮层；皮下，皮质下。比例尺，100μm。

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未经处理和FGF-2处理的切片中的星形胶质细胞。A–D，未处理的控件。E–K公司，FGF-2处理的切片（5 ng/ml，DIV 7）。A类,E类，血管结构的FVIII-rAg标记（红色）。B,F类，星形胶质细胞的GFAP标记（绿色）。插入（英寸）C类和G公司如所示D类和H–K型.A类在没有FGF-2的情况下，脑血管明显解体（注意箭头显示血管扩张）。E类，在存在FGF-2的情况下，血管结构看起来完好无损。B,F类GFAP染色显示星形星形胶质细胞试图在扩张的血管结构周围维持其末端(C类，插图，D类).G公司，插图，H–K在FGF-2处理的切片中，星形细胞末端与不同大小和形状的血管紧密接触，并以规则的方式包围血管。比例尺：A–C,F类,G公司，100微米；D类,H–K型，25微米。

在中等浓度的FGF-2下，DIV 7后几乎没有观察到血管内皮细胞或邻近细胞的细胞死亡(图4B). FVIII-rAg和EthD-1双重染色显示皮质几乎没有细胞死亡(图4E类,F类)以及层粘连蛋白和凋亡标志物caspase-3的双重染色(图4L–O型). 只有几个死核可见(图4E类,F类，箭头），但FVIII-rAg可以显示大量完整的微血管(图4C类,D类). DIV 10处(图4G–O公司)，一些切片显示其中心神经组织开始退化的迹象(图4我,K（K）,M（M）)与皮层下神经组织有关。然而，即使在DIV 10，皮层微血管中也没有细胞死亡(图4O（运行）).

在对照组和用50 ng/ml FGF-2处理的切片中也几乎没有检测到细胞死亡（数据未显示）。这可能是因为在这种情况下，大多数血管以及退化的血管碎片已经消失。

一般来说，与年长（P5–P7）幼犬相比，年轻（P3–P4）幼犬的血管在外植体中存活得更好（数据未显示），这可能是因为年轻幼犬的神经组织存活得更好。因此，为了显示紧密连接蛋白，使用了P4动物。

船舶保持紧密连接

FGF-2处理的切片中的微血管保持其体内紧密连接蛋白claudin-5的存在显示了结构的完整性(图6B–D类)（并覆盖层粘连蛋白F），克劳丁-3(图6G–K型)，ZO-1(图6L（左）)和闭塞素(图6M（M）). 它们的分布与紧密连接样结构的预期定位非常吻合：在血管结构的壁中存在连续的、大的紧密连接蛋白带；图6D–F型例证了claudin-5和层粘连蛋白沿血管壁的定位。紧密连接蛋白也有规律地描绘邻近的内皮细胞(图6J,K（K）箭头）以及微血管的交叉点(G公司,H（H），箭头）。因此，在拟议的COSC模型中，假定的回归变化不会影响拟议文化时间窗口中的紧密连接结构。

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血脑屏障的紧密连接表现为完整的结构。A类在没有FGF-2的情况下，紧密连接蛋白的丢失（这里是claudin-5标记）表明BBB的完整性丢失。B–M类免疫染色显示，经中等浓度FGF-2（此处为0.5 ng/ml）处理的切片中存在复杂的紧密连接网络，表明BBB得以维持。注意claudin-5的连续大条带(B–D类)，第3条(G–K型)，ZO-1型(L（左）)和闭塞素(M（M）)描绘血管壁，不同血管之间的交叉点(G公司,H（H），箭头）和邻近内皮细胞(J,K（K），箭头）。E类血管层粘连蛋白标记。F类层粘连蛋白和克劳丁-5的叠加。比例尺，100μm。

讨论

BBB在多种中枢神经系统感染性和神经退行性疾病中受到挑战，但大多数关于BBB的研究都是进行的体内在动物模型中，不适合研究潜在的机械事件。因此，BBB研究中的一个主要问题是开发具有代表性的在体外模型。

尽管大多数在体外模型依赖于分离细胞的培养，切片培养提供了在不同实验条件下研究BBB的独特可能性，同时考虑到大脑的复杂环境。与现有的BBB模型相比，COSC的优点是血管虽然被分割成较小的碎片，但仍然保留就地在一个维护结构中，允许自然体内合作伙伴。

尽管血管可能会因缺乏腔内血流而死亡，但在人类和新生大鼠脑组织中的两项早期超微结构研究(Wolff等人，1974年;Hauw等人，1975年)表明移植脑组织中的血管存活。此外，最近的免疫组织化学方法证明了血管的生存能力（即，在大鼠皮层培养物中存在血管内皮生长因子）(Kremer等人，1997年;Rosenstein等人，1998年;Moser等人，2003年).

在这里，我们利用FGF-2作为调节BBB、促进血管生成和调节内皮细胞存活的关键分子(加伯格，1998年;Sobue等人，1999年). 一些研究表明，星形胶质细胞或星形胶质细胞因子在脑内皮细胞BBB特性的形成和维持中起作用(Bauer和Bauer，2000年;加伯格，1998年). 在已知的星形胶质细胞衍生生长因子中，只有FGF-2模拟星形胶质细胞对BBB的信号传导作用(Klint等人，1999年;Sobue等人，1999年). FGF-2是维护BBB完整性的重要候选(Langford等人，2005年)，它已被证明拧紧在体外BBB模型(Sobue等人，1999年)可能是大鼠C6胶质瘤细胞分泌的一种假定的屏障紧缩因子(Brown等人，2003年).

在这里，我们首次在小鼠的COSC中证明，在存在0.5–5 ng/ml FGF-2的情况下，血管结构可以持续10天，同时保持BBB的结构完整性。报道了FGF-2水平与肿瘤血管程度的相关性体内星形细胞脑肿瘤患者脑脊液中(Peles等人，2004年). 然而，在临床研究中观察到的FGF-2水平略高（20–50 ng/ml）。

尽管最初DIV 7培养物中的血管段数量低于DIV 3培养物，但在0.5和5 ng/ml FGF-2后，两组的血管数量增加相似（例如，血管结构数量在0.5 ng/ml后增加了约1.5，在5 ng/ml FGF-2之后增加了一倍，这与在体外持续时间）。这是否归因于血管生成或现有血管存活率的提高尚不清楚。事实上，DIV 3后检测到的血管中约50%在DIV 7后缺失，因此不太可能产生新的血管。与对照组相比，过量的50 ng/ml FGF-2对防止血管丢失也无效。因此，中等浓度的FGF-2似乎可以延长血管存活时间，而不是促进血管生成。

在存在FGF-2的情况下，星形细胞终末以规则的方式包围每个血管(Simard等人，2003年). 在缺乏FGF-2的情况下，脑血管结构的解体是明显的。血管碎片在DIV 3出现扩张，大多数血管在DIV 7完全解体。然而，即使在没有FGF-2的情况下，星形胶质细胞终末也试图与扩张的血管保持接触，在含有或不含FGF-2星形胶质细胞的显微解剖中没有发现差异。

因此，我们得出结论，主要是血管本身而不是星形胶质细胞受到FGF-2缺乏的影响。通过共焦显微镜对COSC中FGFR1的免疫组织化学定位分析证实了这一点。FGFR1主要在血管上表达。大量受体与层粘连蛋白（内皮基底膜的一种成分）共定位，而与星形胶质细胞无共定位。FGFR1和层粘连蛋白的共定位与细胞培养实验的先前证据一致，即通过FGFR1的信号传导依赖于毛细血管内皮细胞分化中细胞外基质的组成，层粘连蛋白在这些细胞-基质相互作用中起着关键作用(神田等人，1999年).

在无FGF-2的对照培养条件下，器官型薄片培养中神经元的存活和功能已被证明Stoppini等人（1991年）,Yamamoto等人（1992年），以及许多其他。我们还发现，未经处理的对照COSC以及经FGF-2处理的切片中的神经元在拟定的时间范围内存活良好（数据未显示）。

为了排除FGF-2治疗后血管的保存可能与切片培养中神经元和胶质细胞元件存活率的提高有关，我们用凋亡标记物caspase-3研究了凋亡细胞死亡。然而，一般来说，在切片培养10天后，caspase-3免疫反应缺失或非常低在体外，一些切片显示其中心开始组织退化。在对照培养物和FGF-2处理的培养物之间没有发现capase-3免疫反应性的差异。此外，细胞死亡更多地与皮层下区域的神经组织有关，而与切片的皮层区域关系较小。总之，这些结果表明，在存在FGF-2的情况下，脑血管得到了很好的保护，这似乎不是由星形胶质细胞或神经元对血管网络的间接或人工作用引起的。然而，未来的研究将阐明FGF受体下游的信号通路以及在缺乏FGF-2的情况下血管变性的机制。

长期以来，TJ构成了BBB选择性通透性的解剖学基础（有关综述，请参阅Wolburg和Lippoldt，2002年). 据报道，一些外周膜蛋白如ZO-1集中在TJ的细胞质表面(施尼伯格和林奇，1992年;Anderson和van Itallie，1995年;Balda and Matter，1998年;Tsukita等人，1999年,2001)已知完整膜蛋白定位于TJ（即闭塞素和克劳丁）(Furuse等人，1993年,1998).

Claudins是TJ链的主要组成部分(Tsukita等人，2001年)，是非均相克劳丁物种的共聚物(Furuse等人，1999年). Claudin-5主要存在于内皮细胞中，尤其是大脑中(Morita等人，1999年)从而产生了直接参与BBB建立的想法。最近，claudin-3在体内健康的小鼠中枢神经系统血管被证实(Wolburg等人，2003年).

紧密连接似乎在中枢神经系统的病理状态中起着重要作用，因为克劳丁家族紧密连接蛋白的改变与克劳丁-5缺乏小鼠的血脑屏障通透性变化有关(Nitta等人，2003年)以及营养不良mdx小鼠的渗漏血管(Nico等人，2003年)以及在缺血性中风期间(马克和戴维斯，2002年). 在肿瘤或炎症过程中claudin-3免疫染色的选择性缺失表明claudin-3是决定血脑屏障TJs完整性的中心成分(Wolburg等人，2003年).

然而，尽管闭塞素、克劳丁-5和克劳丁-3被认为限制了血脑屏障的通透性(Wolburg和Lippoldt，2002年)，它们的表达不一定总是与BBB的紧密性相关。例如，从共培养物中去除星形胶质细胞并没有导致紧密连接分子的任何可见损失，尽管早期BBB向细胞旁示踪剂开放(Hamm等人，2004年). 此外，在某些神经病理学条件下，改变的脑血管选择性地丢失了克劳丁-3，但没有丢失克劳丁-5、ZO-1或闭塞素，这表明紧密连接蛋白的丢失可能是BBB破裂的一个相当晚的事件(Wolburg等人，2003年). 然而，这似乎与体内观察发现，在长期存在的病理条件下，紧密连接蛋白完全丢失，并伴有BBB分解。

本研究的一个重要部分是验证提议的在体外FGF-2处理的COSC模型，表明TJ分化良好，且BBB的结构完整性没有重大回归变化。因此，我们建议将COSC-FGF-2模型作为机械研究的合适工具，尤其是对BBB的晚期或更显著影响（即在缺血或神经退行性疾病期间的炎症过程中，当相邻神经组织强烈参与病理事件时，需要有关导致BBB分解的特定细胞相互作用和信号的信息）。然而，该模型也将允许研究BBB的早期和更微妙的变化，这与紧密连接蛋白的完全丢失（例如，它们的磷酸化）不同。重要的是，由于该系统相对简单，COSC可以很容易地进行操作，并受到不同的损伤，如缺氧、葡萄糖缺乏和药物治疗，以帮助理解BBB紊乱。

脚注

我们感谢M.Saxer和G.Kalt的专家技术援助，并感谢L.Landmann博士在共焦显微镜方面的专家帮助。

工具书类

  • 新泽西州雅培。星形胶质细胞与内皮细胞的相互作用和血脑屏障通透性。J Anat杂志。2002;200:629–638. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Anderson JM，van Itallie CM。紧密连接和细胞旁通透性调节的分子基础。美国生理学杂志。1995;269：G467–G475。[公共医学][谷歌学者]
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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会