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.1998年6月29日；141(7):1539-50.
doi:10.1083/jcb.141.7.1539。

Claudin-1和-2：定位于紧密连接处的新整合膜蛋白，与闭塞蛋白的序列无相似性

M Furuse公司 1, K富士达, T希拉吉, K藤本, S筑田
附属公司

Claudin-1和-2：定位于紧密连接处的新整合膜蛋白，与闭塞蛋白的序列无相似性

M Furuse公司等。 J细胞生物学. .

摘要

闭塞素是唯一已知的定位于紧密连接（TJ）的完整膜蛋白，但最近对闭塞素基因的靶向破坏分析表明，在TJ中存在尚未识别的完整膜蛋白质。因此，我们重新检查了从鸡肝中分离的连接部分，闭塞素首次从中鉴定出来。在该组分的众多组分中，通过4 M胍基HCl提取以及超声处理，然后逐步蔗糖密度梯度离心，仅检测到约22 kD的宽银染带，而闭塞蛋白带则检测到。从宽带的下半部和上半部获得了两个不同的肽序列，通过数据库的相似性搜索，我们可以分离出两个全长cDNA，分别编码由211和230个氨基酸组成的相关小鼠22-kD蛋白。亲水性分析表明，两者都具有四个跨膜结构域，尽管它们与闭塞素没有任何序列相似性。免疫荧光和免疫电子显微镜显示，标记有FLAG或GFP的两种蛋白都是靶向TJ链本身并整合到TJ链中的。我们分别将其命名为“第1条”和“第2条”。尽管克劳丁与TJ之间的精确结构/功能关系仍不明确，但这些发现表明，具有四个假定跨膜结构域（闭塞素和克劳丁）的多重完整膜蛋白构成了TJ链。

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数字

图1
图1
鸡肝分离连接部分中闭塞蛋白带和九条胍不溶性带的鉴定。(一)隔离连接部分的闭塞素免疫吸收。用0.1%十二烷基硫酸钠溶解分离的连接部分。稀释后，用兔抗鸡occludin pAb（F44）或对照兔血清进行免疫沉淀，然后对上清液进行SDS-PAGE处理。在银色凝胶中，60-kD带(箭头)在未经处理的(Fr.交界处。)以及对照血清治疗(+控制IgG)F44处理组分中消失的组分(+抗Oc抗体). 因此，银染法证实闭塞素在接合部位为60-kD带。伴随着免疫印迹和抗闭塞素pAb（F44）证实了这一观点。(b条)分离的连接部分的胍提取。为了从分离的连接处彻底提取外周膜蛋白，用4 M胍-HCl处理部分。比较了未经处理的(Fr.交界处。)和胍处理(4 M胍)样品。未处理部分中的闭塞素(箭头)通过胍处理浓缩(闭塞素). 除闭塞蛋白带外，还鉴定出9条胍不溶性带（带1–9)其数量接近或大于闭塞素。条形表示从顶部开始的分子质量分别为200、116、97、66、45、31和21 kD。
图3
图3
克劳丁-1和-2编码cDNA的克隆和测序。(一)肽序列测定。带9的下半部和上半部（见图1b条)分别进行直接肽序列测定，得到肽序列-1和-2。数据库搜索确定了人类和小鼠EST克隆（这些序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，登录号分别为AA305424和AA116709），其编码的序列分别与肽序列-1和-2具有显著相似性。同一性和同源性分别用星号和圆点表示。(b条和c（c）)小鼠claudin-1和claudin-2的核苷酸和推导的氨基酸序列。基于上述肽序列，从小鼠肝脏cDNA文库中分离出两个不同的cDNA（有关详细信息，请参阅材料和方法）。这些cDNA编码的产物被指定为claudin-1和-2。与肽序列-1和-2同源的序列(一)下划线。由于肽序列-1被确定为NH2-末端序列（详见材料和方法），在claudin-1 cDNA中最终确定了第一个ATG密码子。第1条和第2条之间的序列相似性（见图4一)然后使我们能够估计claudin-2 cDNA中的第一个ATG密码子。Claudin-1和-2 cDNA编码211和230氨基酸多肽，预测分子量分别为22.9 kD和24.5 kD。
图4
图4
小鼠克劳丁-1和-2的结构。(一)用GENETYX程序比较小鼠claudin-1和-2的氨基酸序列。同一性和同源性分别用星号和圆点表示。它们在氨基酸序列水平上显示出38%的同一性。(b条)使用Kyte和Doolittle算法绘制了claudin-1和claudin-2的亲水性曲线。该图记录了八个残基窗口上序列的平均亲水性。亲水残留物和疏水残留物分别位于框架的下部和上部。轴以氨基酸残基编号。克劳丁-1和-2似乎都包含四个主要的疏水性、潜在的跨膜区域(箭头)尽管没有排除这样的可能性，即只有在文中讨论的这些图中，这些分子中才包含五个跨膜结构域。
图4
图4
小鼠克劳丁-1和-2的结构。(一)用GENETYX程序比较小鼠claudin-1和-2的氨基酸序列。同一性和同源性分别用星号和圆点表示。它们在氨基酸序列水平上显示出38%的同一性。(b条)使用Kyte和Doolittle算法绘制了claudin-1和claudin-2的亲水性曲线。该图记录了八个残基窗口上序列的平均亲水性。亲水残留物和疏水残留物分别位于框架的下部和上部。轴以氨基酸残基编号。克劳丁-1和-2似乎都包含四个主要的疏水性、潜在的跨膜区域(箭头)尽管没有排除这样的可能性，即只有在文中讨论的这些图中，这些分子中才包含五个跨膜结构域。
图2
图2
在蔗糖密度梯度离心后，超声作用下闭塞素和九条胍不溶带的行为。(一和b条)未经处理的超薄切片电子显微镜图像(一)和声波(b条)在0.1%单宁酸存在下，结合分数固定。未处理组分的特征是大量肌动蛋白丝（*）和孤立的连接(箭头)，其中包含典型的紧密连接(插图). 超声处理后离心，未检测到肌动蛋白丝，分离的连接被破碎成小泡状结构(箭头)其中一些仍然包含典型的紧密连接(插图). (c（c）)声波结分数的分馏。超声处理后，用逐步蔗糖密度梯度离心法分离分离的连接。收集0:25%、25:30%、30:34%、34:38%、38:42%和42:50%的界面，进行SDS-PAGE，然后进行银染。闭塞带的分布(闭塞素)与9条胍不溶带（带1–9)只有第9条带与闭塞素共分。银染色和用抗occludin mAb（Oc-1）进行的免疫印迹显示，occludin主要在25:30%、30:34%和34:38%的界面处回收，其中条带9也有特征性积累。条形图英寸c（c）从顶部分别表示200、116、97、66、45、31和21 kD的分子质量。棒材，0.2μm。
图2
图2
在蔗糖密度梯度离心后，超声作用下闭塞素和九条胍不溶带的行为。(一和b条)未经处理的超薄切片电子显微镜图像(一)和声波(b条)在0.1%单宁酸存在下，结合分数固定。未处理组分的特征是大量肌动蛋白丝（*）和孤立的连接(箭头)，其中包含典型的紧密连接(插图). 超声处理后再离心，未检测到肌动蛋白丝，分离的连接处被破碎成小泡状结构(箭头)，其中一些仍然包含典型的紧密连接(插图). (c（c）)声波结分数的分馏。超声处理后，用逐步蔗糖密度梯度离心法分离分离的连接。收集0:25%、25:30%、30:34%、34:38%、38:42%和42:50%的界面，进行SDS-PAGE，然后进行银染。闭塞带的分布(闭塞素)与9条胍不溶带（带1–9)只有第9条带与闭塞素共分。银染和伴随的抗闭塞素单克隆抗体（Oc-1）免疫印迹显示，闭塞素主要在25:30%、30:34%和34:38%界面处恢复，其中带9也有特征性聚集。条形图英寸c（c）从顶部分别表示200、116、97、66、45、31和21 kD的分子质量。棒材，0.2μm。
图5
图5
在MDCK转染剂中用闭塞素对FLAG标记的克劳丁-1和-2进行克隆化。表达FLAG–claudin-1或FLAG–claudin-2的MDCK转染细胞的融合培养(标记有FLAG的条款-1或标记有FLAG的条款-2)用小鼠抗FLAG单克隆抗体双重染色(防FLAG)和大鼠抗闭塞素单抗MOC37(抗闭塞素). 通过共焦显微镜在侧膜最顶端区域的焦平面上获得图像。FLAG–claudin-1和FLAG–claudin-2与occludin在紧密连接区域精确共定位。棒材，10μm。
图6
图6
比较在MDCK转染剂中claudin-1和-2与clodin和E-cadherin的亚细胞分布。表达FLAG-tagged claudin-1或FLAG-tagned claudin-2的MDCK转染细胞汇合片用小鼠抗FLAG单抗（M2）/大鼠抗闭塞素单抗（MOC37）或小鼠抗FLAG-单抗（M2）/鼠抗E-cadherin单抗（ECCD2）双重染色。对于每个样品，共聚焦显微镜以0.5μm的间隔记录了22个光学切片，并生成了横截面图。每个蜂窝板的厚度用箭头表示。在计算机生成的横截面视图中，FLAG–第1条，FLAG-第2条(防FLAG)和闭塞素(抗闭塞素)高度集中在MDCK细胞侧膜的最顶端，重叠图像显示FLAG–claudin-1和FLAG–claudin-2与闭塞蛋白精确共定位(混合成的). 相反，E-钙粘蛋白沿侧膜分布(抗E-钙粘蛋白)，其分布比FLAG–claudin-1或FLAG–claudin-2更基本(混合成的). 在表达GFP-tagged claudin-1的MDCK转染体中观察到claudin-1/闭塞素和claudin-1-E-cadherin的相同空间关系，表明tag肽并不影响claudins的亚细胞分布。
图7
图7
表达FLAG-(一和b条)或GFP标记的第1条(c（c）)抗FLAG单克隆抗体或抗GFP单克隆抗体。TJ地区(箭头)而不是桥粒等其他膜域(箭头在里面一；星号在里面b条和c（c）)，用免疫金颗粒专门标记。考虑到免疫金标记的固有分辨率（20–25 nm），大多数免疫金颗粒似乎直接标记了TJ链本身，这表明claudin-1被并入TJ链。棒材，0.1μm。
图8
图8
用抗FLAG单克隆抗体免疫标记表达FLAG-tagged claudin-2的MDCK转染体的冷冻断裂复制品。TJ区，但不包括桥粒等其他膜域(星号在里面b条)，用免疫金颗粒专门标记。考虑到免疫金标记的固有分辨率（20–25 nm），大多数免疫金颗粒似乎直接标记了TJ链本身，这表明claudin-2被并入TJ链。棒材，0.1μm。
图9
图9
小鼠claudin-1和-2表达的Northern blots。用claudin-1或claudin-2 cDNA片段探测小鼠多组织北方斑点（Clontech）。Claudin-1 mRNA在所有检查的组织中均检测到4.0 kb的主带和1.3 kb的小带，在肝脏和肾脏中尤其大量。Claudin-2的表达（主要为4.0 kb，次要为2.0 kb mRNA）仅限于肝脏和肾脏（少量在大脑中）。
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引用人

  • Claudins与癌症：当前和未来的治疗目标。
    Hana C、Thaw Dar NN、Galo Venegas M、Vulfovich M。 Hana C等人。 国际分子科学杂志。2024年4月24日；25(9):4634. doi:10.3390/ijms25094634。 国际分子科学杂志。2024 PMID：38731853 免费PMC文章。 审查。
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