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比较研究
.2005年2月2日2:6:8。
doi:10.1186/1471-2202-6-8。

FGF2介导的内皮细胞免受HIV-gp120感染的信号串扰

戴安·朗福德 1, 罗斯玛丽·赫福德, 桥本真本, 穆拉特·迪吉卡利奥卢, 埃利泽·马西利亚
附属公司
比较研究

FGF2介导的内皮细胞免受HIV-gp120感染的信号串扰

戴安·朗福德等。 BMC神经科学. .

摘要

背景：血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）抵御循环病原体（如HIV）的第一道防线。细胞毒性HIV蛋白gp120破坏BBB的内皮细胞，从而损害其完整性，这可能导致HIV感染细胞迁移到大脑中。主要由星形胶质细胞产生的成纤维细胞生长因子2（FGF2）促进内皮细胞适应性和血管生成。我们假设用FGF2处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）可以通过内皮细胞生存信号保护细胞免受gp120介导的毒性。

结果：HUVEC暴露于gp120导致剂量和时间依赖性细胞死亡；然而，用FGF2预处理内皮细胞可以保护细胞免受gp120的血管毒性。用FGF2处理HUVEC导致细胞外调节激酶（ERK）的剂量和时间依赖性激活，对磷酸肌醇3激酶（PI3K）和蛋白激酶B（PKB）（也称为AKT）有中度影响，但对糖原合成酶激酶3（GSK3β）活性没有影响。通过药理学方法、基因转移和激酶活性测定，我们发现FGF2介导的抗gp120毒性的血管保护作用受ERK、PI3K-AKT和PKC信号通路之间的串扰调节。

结论：综上所述，这些结果表明FGF2在HIV相关脑内皮细胞损伤过程中可能在维持血脑屏障完整性方面发挥重要作用。

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数字

图1
图1
FGF2保护HUVEC抵抗gp120介导毒性的细胞活性测定HUVEC的（A-D）相位对比、（F-I）TUNEL染色和（K-O）荧光染色。面板A、F和K显示未经处理的HUVEC对照的图像；B、 G和L表示用FGF2（20 ng/ml）处理HUVEC 24小时；面板C、H和M显示HUVEC用gp120（25 ng/ml）处理24小时，面板D、I和N显示HUVEC在暴露于gp120 24小时之前用FGF2预处理24小时。面板E、J和O分别显示了通过台盼蓝排除法确定的细胞死亡百分比、通过TUNEL和FA/PI染色确定的DNA碎片百分比。面板E、J和O中显示的结果代表三次单独实验的平均值。*=与对照组相比，采用单因素方差分析和事后Dunnett’s检验，P＜0.05。Bar=20微米。
图2
图2
FGF2和gp120对细胞增殖和活力的影响A） 暴露于FGF2和/或gp120的增殖HUVEC的密度。B） 将HUVEC与FGF2预处理不同时间后，暴露于gp120的细胞的细胞存活率。在添加gp120后24小时测量细胞活力。*=与对照组相比，采用事后Dunnett’s的单向方差分析，P<0.05。
图3
图3
抑制剂对FGF2介导ERK激活的影响A）Western blot（WB）在FGF2治疗0、5、10分钟后（1–3区）和抑制剂LY294002（阻断PI3K）、U0126（阻断MEK）、Bis I和Gö6983（阻断PKC）（分别为4–7区）与抗磷酸-ERK反应。B）WB与抗总ERK抗体反应。（C）WB与抗磷酸化GSK3β反应。D）WB与抗GSK3β反应。E）WB与抗PI3K抗体反应。在剥离、重新锁定并与给定蛋白质的新抗体孵育后，在每次实验中使用相同的WB。
图4
图4
抑制剂对FGF2刺激ERK和GSK3β活性的影响免疫复合物激酶检测（A）ERK和（B）未经FGF2处理的GSK3β活性，或经PD98059、U0126、LY29004、双吲哚马来酰亚胺I或Gö6983抑制后再进行FGF2治疗。（C）仅进行抑制剂治疗。(D类)ERK和GSK3β磷酸化（P）变化与活性（Act）变化的总结。⇑ 表示增加，⇓ 表示减少，–表示无变化。*=与对照组相比，采用事后Dunnett’s的单向方差分析，P<0.05。
图5
图5
活性分析表明，ERK激活是FGF2抵抗gp120所必需的（A）)用抑制剂LY294002、U0126、Bis I或Gö6983治疗30分钟，然后用FGF2和/或gp120治疗，用台盼蓝排斥试验检测细胞存活率。（B）单独使用MEK抑制剂U0126治疗30分钟后，然后暴露于gp120和/或FGF2 24小时后，用台盼蓝排斥试验检测细胞存活率。在使用FGF2和抗FGF2治疗的细胞中，HUVEC暴露于抗FGF2抗体1小时后，再单独或与gp120联合治疗。*表示与对照组有显著差异。*=与对照组相比，采用事后Dunnett’s的单向方差分析，P<0.05。
图6
图6
组成活性ERK和AKT的基因转移保护细胞免受gp120毒性（A）在组成型活性（ca）ERK或ca AKT的基因转移后，将HUVEC暴露于gp120、FGF2或两者的组合，并通过台盼蓝排除法测定细胞活力。对照组包括ca-ERK、ca-AKT和GFP基因转移，无需进一步治疗。*表示与对照组有显著差异。**表示与*.*=有显著差异与对照组相比，采用事后Dunnett’s进行单因素方差分析，P<0.05。**=在实验组之间进行比较时，使用事后Tukey-Kramer进行单向方差分析，P<0.05。
图7
图7
组成活性ERK、AKT或GFP磷酸化的基因转移效应（A-D）用FGF2治疗后的HUVEC Western Blot，感染GFP、ca-ERK或ca-AKT腺病毒构建物，或用FGF2治疗后感染腺病毒构建体。在剥离和再杂交后，对所有抗体使用相同的Western blot。A） 与抗磷酸ERK抗体反应（B）与抗总ERK抗体反应。（C）与抗磷酸化AKT抗体反应。（D）与抗总AKT抗体反应。（E）免疫复合物分析显示，在含有caERK、caAKT或GFP的HUVEC中，经或不经FGF2处理后ERK活性发生变化。（F）如材料和方法中所述，使用磷光成像仪对用caERK、caAKT或GFP处理的HUVEC+/-FGF2中ERK活性水平进行量化。*表示与对照组有显著差异。*=与对照组相比，采用事后Dunnett’s的单向方差分析，P<0.05。
图8
图8
FGF2、gp120和抑制剂对ERK和GSK3β磷酸化的影响（A、B）蛋白质印迹显示ERK和GSK3β磷酸化（A）gp120单独（车道2）和抑制剂（车道3-6），（B）FGF2和gp120（泳道2），以及具有抑制剂和gp120的FGF2（泳道3-6）。（C）western blots数据汇总表（A）和B）显示ERK和GSK3β磷酸化的变化。⇑ 指示并增加，⇓ 表示减少，–表示没有变化。
图9
图9
可能参与FGF2介导的gp120保护的信号通路示意图如图所示和数据所述，PI3K/AKT/GSK3β和ERK通路之间的串扰可能部分由PKC介导。据报道，PKC信号也直接发生在PI3K和Ras上游。此外，还报道了Ras下游MEK和PKC之间的直接相互作用。同样，据报告，ERK2（p42）通过正反馈机制向Raf-1发出信号。还显示了抑制剂LY290042、U0126、双吲哚马来酰亚胺I和Gö6983的作用点。
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