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.2003年5月12日；161(3):653-60.
doi:10.1083/jcb.200302070。

claudin-5缺乏小鼠血脑屏障的选择性松解

武弘·尼塔 1, Masaki Hata先生, Shimpei Gotoh公司, Yoshiteru Seo先生, 佐佐木裕久, 桥本信夫, 米基奥·福鲁斯, 津田昭一郎
附属公司

claudin-5缺乏小鼠血脑屏障的选择性松解

武弘·尼塔等。 J细胞生物学. .

摘要

中枢神经系统中相邻血管内皮细胞之间紧密连接发达，在建立血脑屏障（BBB）中起着重要作用。Claudin-5是脑内皮细胞紧密连接的主要细胞粘附分子。为了检测其可能参与BBB，我们制备了克劳丁-5缺乏小鼠。在这些小鼠的大脑中，血管的发育和形态没有改变，没有出血或水肿。然而，示踪实验和磁共振成像显示，在这些小鼠中，BBB对小分子（<800D）而非大分子有选择性地受到影响。这一出乎意料的发现（即BBB的大小选择性松动）不仅为BBB的基本分子生理学提供了新的见解，也为通过BBB向中枢神经系统输送潜在药物开辟了新的途径。

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数字

图1。
图1。
Cld-5缺陷小鼠的产生。（a） 小鼠野生型等位基因、靶向载体和靶向等位基因的限制性图谱氯化物-5基因。只有一个外显子覆盖了Cld-5的整个开放阅读框架。靶向载体的中部含有pgk-neo盒，用于删除靶向等位基因中的外显子。Southern印迹的5′和3′探针的位置以条形表示。E、 生态研究所；Sa、SacI；K、 KpnI；N、 NcoI；和S，Sse8387I。（b） 通过Southern blotting对野生型（+/+）、杂合型（+/-）和纯合型（−/-）小鼠Eco-RI消化的基因组DNA进行基因型分析氯化物-5基因等位基因。用5′和3′探针进行Southern杂交，从野生型等位基因中获得8.4kb条带，从靶基因中获得4.7kb和3.7kb条带子。（c） 大脑中Cld-5 mRNA的丢失氯化物-5 −/−RT-PCR检测小鼠。作为对照，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因在所有样本中均扩增。（d） 新生儿第5条 +/+和氯化物-5 −/−老鼠。纯合子Cld-5缺陷小鼠出生时的孟德尔比率符合预期，宏观上看起来正常。然而，它们的活动逐渐停止，它们都在出生后10小时内死亡。
图2。
图2。
血管生成与脑组织学氯化物5 −/− 老鼠。（a和a′）全套免疫染色。9.5-d野生型小鼠和氯化物5 −/−用抗PECAM-1单克隆抗体标记胚胎。在野生型和脊椎动物中观察到头部和脊椎动物部分血管的特征性树状和梯形染色模式氯化物5 −/−胚胎。野生型和氯化物5 −/−18.5天胚胎的大脑。未检测到差异。棒材：（a和a′）300μm；（b和b′）100μm；（c和c′）40μm。
图3。
图3。
脑血管的超微结构 氯 第5天 −/− 老鼠。在氯化物5 −/−18.5天胚胎的大脑，超薄切片电镜显示血管没有明显的形态异常。相邻内皮细胞之间观察到TJ，在高倍镜下，可以清楚地看到所谓的TJ吻点（箭头）。棒材：（左）4μm；（中部）0.2μm；（右）50 nm。
图4。
图4。
脑血管中的Cld-12。（a） 新生成的抗Cld-12 pAb的特异性。总裂解物的免疫印迹大肠杆菌用Cld-1-16胞质域表达GST融合蛋白证实了其特异性。CBB、考马斯亮蓝染色；抗Cld-12单克隆抗体，用抗Cld-12单克隆抗体进行免疫印迹。（b） 野生型和氯化物5 −/−用抗ZO-1单克隆抗体和抗Cld-5单克隆抗体或抗Cld-12单克隆抗体对18.5天胚胎脑组织进行双重染色。Cld-5在氯化物5 −/−大脑。Cld-12不仅在野生型中，而且在野生型和野生型中都集中在ZO-1阳性TJ上氯化物5 −/−脑内皮细胞。当抗Cld-12 pAb与GST-Cld-12融合蛋白预孵育时，这些Cld-12信号被消除。野生型和野生型之间的Cld-12信号强度似乎没有显著差异氯化物5 −/−脑内皮细胞。内皮细胞TJ处的闭塞素浓度在氯化物5 −/−大脑（未发布的数据）。棒材，20μm。
图5。
图5。
中BBB的减值 氯化物5 −/− 18.5天胚胎的大脑。从复苏胚胎的心脏灌注初级胺反应生物素化试剂（443 D）。孵育5分钟后，用HRP偶联链霉亲和素孵育全身（a和a′）或大脑（b，b′，c和c′）的矢状冷冻切片，通过过氧化物酶活性定位生物素化试剂。在低倍放大的野生型小鼠（a）中，试剂完全从大脑（箭头）和脊髓（箭头）中排除；形成鲜明对比的是氯化物5 −/−小鼠（a′），中枢神经系统表现出强烈的过氧化物酶活性。放大倍率较高时氯化物5 −/−（b′和c′），但在野生型大脑（b和c）中没有，试剂大量渗入薄壁组织。棒材：（a和a′）2 mm；（b和b′）40μm；（c和c′）10μm。
图6。
图6。
生物素化试剂从血管中泄漏的时间过程 第5类 −/− 大脑。从复苏胚胎的心脏灌注初级胺反应生物素化试剂（443 D）。经过1、3、5或10分钟的孵育后，用罗丹明结合的链霉亲和素孵育大脑冰冻切片，以观察注射的生物素化试剂的分布。棒材，50μm。
图7。
图7。
BBB的尺寸选择性松动氯化物5 −/− 老鼠。（a） 大脑的石蜡切片被去石蜡化，并用兔抗白蛋白pAb染色，然后用HRP偶联的抗兔IgG pAb孵育。通过过氧化物酶活性观察结合pAb。未观察到内源性血清白蛋白泄漏氯化物5 −/−大脑。棒材，40μm。（b） 将微过氧化物酶（～1.9 kD）注入复苏胚胎的心脏，经过5分钟的孵育后，固定大脑。通过冰冻切片中的过氧化物酶活性观察微过氧化物酶的定位。在氯化物5 −/−大脑。棒材，40μm。（c） 灌注四甲基罗丹明结合葡聚糖（～10 kD）和核染色染料（Hoechst染色H33258；562 D）的混合物，并在荧光显微镜下观察冰冻切片。在野生型大脑中，右旋糖酐（红色）和赫斯特染料（蓝色）均未渗出，而在氯化物5 −/−大脑（Hoechst染料，而非右旋糖酐）渗出，以染色周围神经元/胶质细胞的细胞核。棒材，30μm。
图8。
图8。
18.5天胚胎的MRI。（a） 中矢状T1-野生型和氯化物5 −/−经心注射Gd-DTPA（0.0、0.5和1.0 mmol/kg体重）后的大脑。由于T缩短1弛豫时间，Gd-DTPA可及区域表示为高信号强度。在野生型小鼠中，Gd-DTPA没有进入CNS的血管外空间，因此即使在高剂量的Gd-DTPA下，大脑实质（中上部，箭头）也保持恒定的图像强度。相比之下，在氯化物5 −/−大脑中，包括脊髓在内的CNS所有区域（中下部，箭头）的图像强度均被Gd-DTPA增强，增强程度取决于注射Gd-DTTA的剂量。（b） 水的松弛速率（1/T）之间的关系1)脑内注射Gd-DTPA的剂量。作为1/T1大脑的1/T1取皮层、丘脑、下丘脑、小脑和脑桥5个ROI（156×156×750 mm）的平均值。粗线和虚线分别是拟合和95%置信限的结果。如文中所述，在简单的两室交换模型的假设下（Fabry和Eisenstadt，1978；Schwarzbauer等人，1997），这种关系使我们能够定量估计Gd-DTPA——大脑单位体积的可访问空间。
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