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细胞生物学杂志。1999年11月15日；147(4): 891–903.
数字对象标识：10.1083/jcb.147.4.891
预防性维修识别码：项目经理2156154
PMID：10562289

紧密连接股内部和之间异质Claudin物种的相互作用方式

米基奥·福鲁斯，一 佐佐木裕久，b、，c（c）和津田昭一郎一
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摘要

在紧密连接（TJ）中，TJ链与相邻细胞的链横向相连，形成成对链以消除细胞外间隙。Claudin-1和-2，TJ的完整膜蛋白，在转染到L成纤维细胞时重建成对的TJ链。Claudins是一个多基因家族，在单个细胞中有两个以上不同的Claudin共存，这就提出了异质性Claudin是否形成异聚TJ链以及Claudin在每一对链之间是否以异嗜性方式相互作用的问题。为了回答这些问题，我们将claudin-1、-2和-3中的两个共转染到L细胞中，并检测到它们在细胞-细胞边界的共同浓度，形成复杂的网络。免疫复制EM证实，独特的克劳丁被合并到单个TJ链中。接下来，对两个单独表达克劳丁-1、-2或-3的L转染体进行共培养，我们发现克劳丁-3链与克劳丁-1和-2链横向结合形成成对链，而克劳丁-1链与克劳汀-2链没有相互作用。我们得出结论，不同种类的克劳丁可以在TJ链内部和之间相互作用，但某些组合除外。克劳丁的这种组装方式可以增加TJ链结构和功能的多样性。

关键词：紧密连接、股线、克劳丁、细胞粘附、冷冻断裂

T型右侧连接（TJ）是脊椎动物上皮细胞和内皮细胞连接复合体中最顶端的成分，将单个细胞限定为带状结构。超薄切片和冻结断裂EM提供了TJs的三维结构图像(Farquhar and Palade 1963年；施泰赫林1973，施泰赫林1974). 在TJ的带状区域，两个并置的膜紧密相连，在每个膜的脂质双层内，所谓的TJ链可能由线性聚集的整体膜蛋白组成，通过分支形成网络。每个TJ链与相邻细胞的对合膜中的TJ链横向紧密结合，形成一对链，其中细胞间距离几乎为零（参见图1A） ●●●●。

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TJ股和克劳丁。A、 TJ的示意图。在TJs，两个附着的膜紧密地靠在一起，TJ链在每个膜的脂质双层中运行。并列膜中的TJ链横向结合形成成对链，其中细胞外空间被完全消除。B、 每对TJ链中两种不同克劳丁（白色和黑色球体）排列的可能模型。当每条TJ链由单一种克劳丁（均聚物）组成时，两种类型的成对链由每条TJ线的亲同侧结合（亲同粘附；模型a）或亲异侧结合（嗜异粘附；模型B）形成。当每条TJ链是两种不同的克劳丁（杂聚合物）的杂聚合物时，成对的链是通过每个克劳丁分子的亲同相互作用（C型）或亲异粘附（D型）形成的。

基于这些结构和功能上的观察，人们提出了TJ的双重功能，这两种功能对于在多细胞系统中建立成分不同的隔间至关重要(Schneeberger and Lynch 1992年；Gumbiner 1993年；Anderson和van Itallie 1995；Yap等人，1998年). 首先，相邻细胞之间成对TJ链的形成将细胞间隙密封起来，作为通过细胞旁途径扩散溶质的渗透屏障（TJ的屏障功能）。然而，形态学和生理学研究预测，TJ并非绝对封闭，而是含有在开放和闭合状态之间波动的水孔(克劳德1978). 此外，TJ的渗透性和离子选择性似乎随上皮细胞类型的不同而不同（有关综述，请参阅鲍威尔1981). 其次，质膜内的TJ链网络被视为顶端和基底外侧膜域之间脂质和蛋白质横向扩散屏障的形态对应物（TJ的栅栏功能）。

迄今为止，两种不同类型的完整膜蛋白，闭塞素和克劳丁，具有四个跨膜结构域，已被鉴定为TJ链的组成部分(Furuse等人，1993年，Furuse等人，1998年a；Ando-Akatsuka等人，1996年；Tsukita and Furuse 1999年). 最近，免疫球蛋白超家族成员JAM也被报道定位于TJ，但其与TJ链形成的关系尚不清楚(Martin-Padura等人，1998年). 分子量为～65 kD的闭塞素在各种类型的上皮细胞中仅定位于TJ链(藤本1995；Saitou等人，1997年)不仅参与屏障，还参与TJ的围栏功能(Balda等人，1996年；McCarthy等人，1996年；Chen等人，1997年；Wong和Gumbiner 1997). 然而，在哺乳动物非神经元组织的大多数内皮细胞和豚鼠/人类睾丸的支持细胞中未检测到闭塞素，在这些细胞中观察到TJ(Hirase等人，1997年；Saitou等人，1997年；Moroi等人，1998年). 突变体闭塞素的过度表达导致闭塞素分布的改变，而不影响TJ链的结构或分布(Balda等人，1996年). 此外，当封闭性不足的胚胎干细胞被建立并分化为上皮样细胞（内脏内皮细胞）时，相邻细胞之间仍形成发育良好的TJ链网络(Saitou等人，1998年). 考虑到尚未发现闭塞素的亚型，这些发现表明TJ链可以在没有闭塞素的情况下形成。

从肝脏分离的结合部位中鉴定出分子量为～23 kD的Claudin-1和-2为蛋白质，在TJ富集部位的超声和密度梯度离心过程中与闭塞素共分离(Furuse等人，1998年a). 这些分子与闭塞素没有序列相似性。克劳丁家族是一个多基因家族，迄今已鉴定出15种克劳丁(Furuse等人，1998年a；Morita等人，1999a；Tsukita and Furuse 1999年). 当克劳丁被引入小鼠L成纤维细胞中时，它们集中在细胞-细胞接触面上，形成一个精细的网络，其中重建了发育良好的TJ链样结构网络（在本研究中，我们暂时将这些重建的TJ线状结构称为L细胞rTJ链中的重建TJ链状结构）。另一方面，闭塞素的引入仅诱导了少量短TJ股状结构(Furuse等人，1998年b). 当克劳丁和闭塞素共同转染到L细胞中时，闭塞素似乎被整合到基于克劳丁的rTJ链中。

这些发现表明，克劳丁在质膜内线性聚合，构成TJ链的主干，而闭塞素共聚成这些克劳丁基链。有趣的是，推测多个克劳丁物种的存在可以解释TJ屏障功能的多样性。然而，为了评估这种推测，有必要了解多个克劳丁物种以何种方式并入TJ链。Northern blotting显示，组织分布模式因克劳丁物种而异，并且许多组织表达多种克劳丁物种(Furuse等人，1998年a；Morita等人，1999a). 此外，免疫荧光显微镜显示，肾远端小管中的上皮细胞至少表达claudin-4和-8，这表明单个细胞共表达两种以上的claudins来构成TJs。这些观察结果提出了以下问题：在TJ中，多个不同物种的克劳丁是否在线共聚，以形成TJ链作为杂聚合物(图1B） 以及克劳丁是以亲同还是亲异的方式在每一对链之间相互作用(图1B） ●●●●。为了解决这些问题，我们通过免疫荧光显微镜和常规/免疫标记的冷冻骨折EM建立并检测了单独或联合表达claudin-1、-2和-3的L转染子。这项研究为TJ链的结构和功能提供了新的见解。

材料和方法

多克隆和单克隆抗体的生产

兔抗-小鼠claudin-2pAb和兔抗-小鼠claudin-3pAb先前已被饲养并鉴定(Kubota等人，1999年；Morita等人，1999a). 针对合成多肽CPRKTTSYPTPRPYPKPTPSSGKD（对应于小鼠claudin-1（氨基酸186-209）的COOH末端细胞质域），培养豚鼠抗小鼠claudin-1 pAb。这些pAbs在硝化纤维素膜上用GST融合蛋白与相应克劳丁的COOH末端细胞质域亲和纯化。GST融合蛋白表达于大肠杆菌（菌株DH5α），并用谷胱甘肽-Sepharose 4B珠纯化（Amersham Pharmacia Biotech）。

如前所述，产生大鼠抗鼠claudin-1单克隆抗体和大鼠抗小鼠claudin-2单克隆抗体(Itoh等人，1991年). 将GST融合蛋白与相应克劳丁的COOH末端细胞质域免疫Wistar大鼠，将淋巴细胞与P3骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞。通过表达claudin-1或-2的L转染体的免疫荧光染色或GST融合蛋白的免疫印迹筛选融合板。鼠标抗FLAG单克隆抗体（M2）购自伊士曼柯达公司。

表达式向量

构建表达GST/claudin-1和GST/claudin-2融合蛋白的质粒E类.大肠杆菌PCR扩增了编码克劳丁-1（氨基酸188-211）和克劳丁-2（氨基酸189-230）COOH端细胞质区的cDNA。将每个cDNA片段亚克隆到pGEX4T-1（Amersham Pharmacia Biotech）中，生成pGEX-IN（GST/claudin-1）和pGEX-IU（GST/claudin-2）。GST/claudin-3表达质粒的构建如前所述(Morita等人，1999a).

克劳丁-1、-2和-3的哺乳动物表达载体构建如下。从pGTCL-1或pGTCL-2中切下包含claudin-1或-2的整个开放阅读框的cDNA片段(Furuse等人，1998年b)分别通过SacI或EcoRI消化。将每个DNA片段亚克隆到pCAGGSneodelEcoRI中(Niwa等人，1991年)产生表达载体pCCL-1（克劳丁-1）和pCCL-2（克劳丁-2）。同样，将claudin-3 cDNA的整个开放阅读框亚克隆到pCAGGSneodelEcoRI中，构建表达载体pCCL-3(Morita等人，1999a). 为了构建缺失COOH末端胞质结构域的claudin-1突变体的表达载体，利用引物GGCGACATAGTGGCCACAGCATG（sense）和CGCGGATCTCCGGGGACAGGAGCCA（antisense），通过PCR获得与148-188氨基酸对应的claudin-1 cDNA片段，然后进行EcoRI和BamHI消化。从含有FLAG-tagged claudin-1 cDNA的质粒pSKCL-1F中删除了编码氨基酸148-211的claudin-1cDNA片段(Furuse等人，1998年a)经EcoRI和BamHI消化，并被此PCR-扩增的截短cDNA片段取代。然后将FLAG标记的COOH末端胞质结构域缺失的claudin-1 cDNA亚克隆到表达载体pCAGGSneodelEcoRI中，使pCCL-1ΔCF。

转染

为了建立单独表达claudin-1、-2或-3（分别为C1L、C2L和C3L）的L转染体，将1μg pCCL-1、pCCL-2或pCCL-3转染在35-mm培养皿中的小鼠L细胞，并使用脂质体+（GIBCO BRL）将其转染到1ml Opti-MEM中。在含有500μg/ml G418的DME中进行14-16天的筛选后，收集到抗性菌落。通过免疫荧光显微镜筛选分离克隆。用1μg pCCL-2和0.1μg pPGKpuro的混合物转染C1L细胞，建立共表达claudin-1和-2的C1C2L细胞，然后在含有8μg/ml嘌呤霉素的DME中筛选。同样，通过分别用pCCL-1和pCCL-2以及pGKpuro转染C3L细胞产生C1C3L和C2C3L细胞。通过转染表达FLAG-claudin-1的C1FL细胞，建立了在COOH末端与FLAG标签共存的C1FC2L细胞和claudin-2细胞(Furuse等人，1998年b)含1μg pCCL-2和0.1μg pSV2hph(Santerre等人，1984年)然后在200μg/ml的潮霉素B中进行筛选。将pCCL-1ΔCF转染L细胞，产生表达COOH末端胞质结构域修饰的克劳丁-1的带有FLAG-tag的C1ΔCFL细胞，然后进行G418筛选。每次转染实验都分离出几个稳定的克隆。其中，C1L的克隆16、C2L的克隆12、C3L的克隆17、C1C2L的克隆1、C1C3L的克隆12、C2C3L的克隆15、C1FC2L的克隆11和C1ΔCFL的克隆16被重新克隆并用于本研究，因为它们表达相对大量的引入蛋白。小鼠L细胞和转染体在添加10%FCS的DME中培养。

SDS-PAGE和免疫印迹

SDS-PAGE根据莱姆利1970和蛋白质从凝胶电泳转移到聚二氟乙烯膜上。将膜浸泡在5%脱脂牛奶中，并与初级抗体孵育。清洗后，用大鼠、兔子（Amersham Pharmacia Biotech）或豚鼠（Chemicon International，Inc.）IgG的第二抗体培养细胞膜，然后用链霉亲和素结合碱性磷酸酶（Amersham Pharmacia-Botech）培养细胞膜。以硝基四氮唑和溴氯吲哚磷酸为底物，观察酶反应。

免疫荧光显微镜

L转染体（1.5×106细胞）用盖玻片固定在60mm培养皿上。共培养7.5×105将每种转染剂的细胞混合后进行细胞培养。在培养48小时后，将盖玻片上的细胞在室温下用1%甲醛在PBS中固定10分钟，用PBS洗涤，并用0.2%Triton X-100在PBS内处理10分钟。然后用PBS清洗细胞，用1%BSA在PBS浸泡，并在潮湿的室内与一级抗体孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，将细胞与荧光标记的第二抗体孵育30分钟。FITC-结合山羊抗鼠IgG（BioSource International）、Cy3-结合山羊抗兔IgG，罗丹明结合山羊抗豚鼠IgG和FITC-结合山羊抗兔IgG（Chemicon International，Inc.）用作二级抗体。细胞用PBS清洗三次，然后安装在含有对苯二胺和1%的90%甘油-PBS中n个-丙基半乳糖。如前所述，小鼠肝脏冰冻切片免疫荧光染色(Furuse等人，1993年). 使用蔡司Axiophot荧光显微镜观察标本，并使用SensysTM冷却CCD摄像系统（Photometrics）记录图像。

冷冻断裂电子显微镜

对于传统的冷冻断裂EM，培养在60-mm培养皿上的L转染体用2%戊二醛固定在0.1M二羧酸钠缓冲液（pH 7.3）中，在4°C下过夜，用0.1M二羰酸钠缓冲溶液洗涤三次，在0.1%二羧酸盐缓冲液中30%甘油浸泡2h，然后在液氮中冷冻。在Balzers冷冻蚀刻系统（BAF060，BAL-TEC）中，冷冻样品在−100°C下断裂，铂以45°角单向遮蔽。然后将样品浸入家用漂白剂中，将漂浮在样品上的复制品放在塑料薄膜格栅上，并用JEOL 1200 EX电子显微镜在100 kV的加速电压下进行检查。

用于检查冻裂复制品的免疫电子显微镜如所述进行藤本1995用HPM010高压冷冻机（BAL-TEC）将小鼠肝脏切成小块，在高压液氮中快速冷冻。L转染体在室温下用1%多聚甲醛固定在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中5min，在0.1M磷酸缓冲液中洗涤三次，在30%甘油中浸泡在0.1M磷酸酯缓冲液中3h，然后在液氮中冷冻。然后，按照所述对冷冻样品进行断裂和阴影处理。样品在含有2.5%SDS、10mM Tris-HCl和0.6M蔗糖（pH 8.2）的裂解缓冲液中浸泡并在室温下搅拌12小时，然后用含有5%BSA的PBS清洗样品上漂浮的复制品。复制品与一级抗体孵育2小时，用PBS-BSA清洗，用胶体金结合二级抗体孵育，用PBS-BSA洗涤，然后在formvar膜网格上拾取。山羊抗兔IgG与5-nm金偶联，山羊抗鼠IgG和15-nm金偶联（Amersham Pharmacia Biotech），山羊抗豚鼠IgG结合15-nm金（英国生物细胞国际）用作二级抗体。

结果

表达Claudin-1、-2或-3的抗体和L转染体的特性

我们提出了针对克劳丁-1、-2和-3的COOH末端细胞质结构域的单克隆和多克隆抗体。GST融合蛋白与克劳丁-1、-2和-3的COOH末端尾部的免疫印迹证实了这些抗体的特异性(图2A） ●●●●。然后，将编码claudin-1、-2和-3的cDNA转染到L成纤维细胞中，获得稳定的转染体（分别为C1L、C2L和C3L细胞）。当这些转染体的总细胞裂解物用抗氧化酶-1、-2和-3 pAbs进行免疫印迹时，可以清楚地检测到具有预期分子量的相应克劳丁条带(图2B） ●●●●。

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表达claudin-1、-2或-3的抗claudin抗体和L转染体。A、 用SDS-PAGE（CBB）分离带有克劳丁-1（GST-Cln-1）、克劳丁-2（GST-Cln-2）和克劳丁-3（GST-Cln-3）的COOH端胞质域的GST融合蛋白，并用豚鼠反义audin-1 pAb（抗Cln-1 pAb）、大鼠反义audian-1 mAb，大鼠抗凝血素-2mAb（抗-Cln-2mAb）和兔抗凝血素-3pAb（抗-Cln-3pAb）。每个GST融合蛋白由各自的pAb或mAb特异性检测。B、 通过SDS-PAGE分离表达claudin-1（C1L细胞）、claudin-2（C2L细胞）或claudin-3（C3L细胞）的L转染子的总细胞裂解物，并用抗凝血素-1pAb（抗Cln-1pAb）、抗凝血素-2pAb（抗Cln-2pAb）或抗凝血素-3pAb（抗Cln-3pAb）进行免疫印迹。分别检测到具有预期分子量的克劳丁条带。条形图表示从顶部开始的分子质量分别为31和21 kD。C、 用相应抗体（a、d、g、j和m）对C1L、C2L和C3L细胞进行免疫荧光染色。b、 e、h、k和n，对应的相位对比图像。表达型克劳丁特别集中在细胞-细胞边界处，呈平面状。高倍镜下，克劳丁在这些平面（c、f、i、l和o）中以精细的网络模式分布。棒材：（a、b、d、e、g、h、j、k、m和n）10μm；（c、f、i、l和o）3μm。

之前，我们获得了稳定表达claudin-1或-2的L转染体，在其COOH末端（分别为C1FL和C2FL细胞）标记有FLAG序列，并发现引入的FLAG-claudin-2以精细的网络模式集中在细胞-细胞接触面(Furuse等人，1998年b). 用免疫荧光显微镜对C1L、C2L和C3L细胞进行抗氧化酶-1、-2或-3抗体的检测，发现引入的无表位标记的克劳丁-1、-2和-3也高度集中在细胞-细胞边界，形成精细的网络(图2C） ●●●●。与C1FL和C2FL细胞相似，在C1L、C2L和C3L细胞的细胞-细胞接触面上诱导了发育良好的rTJ链/槽网络，如传统冷冻断裂EM所示（参见图5、g–i和图8、a和b）。从形态特征以及免疫荧光显微镜在细胞接触面检测到的网络大小判断(图2C、 C、f、i、l和o），这些网络中的每条线可以被视为代表单个rTJ股。这些免疫荧光观察进一步证实了本研究中使用的抗核蛋白-1、-2和-3单克隆抗体和单克隆抗体的特异性。

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C1C2L、C1C3L和C2C3L细胞中rTJ链的冷冻断裂复制图像。在这些细胞的细胞接触面上，观察到rTJ链的发达网络。如前所示，C1FL和C2FL电池(Furuse等人，1998年b)在戊二醛固定的C1L细胞中，claudin-1诱导的链主要与P面相关，主要是连续结构（数据未显示），E面有空腔（g；P面相关的TJ），而在C2L细胞中claudin-2诱导的链在P面不连续（数据未示出）E面上有由颗粒链占据的互补凹槽（h；参见图8a；E-face–相关TJ）。与C1L细胞类似，在C3L细胞中诱导了E面（i）上有空凹槽的P面相关TJ（参见图8b） ●●●●。C1C3L细胞具有典型的P面相关TJ（b），而C1C2L和C2C3L细胞在P面和E面相关TJs（a和c）之间表现出rTJ链/槽的中间形态；C1C3L细胞E面的凹槽完全是空的（E），而C1C2L和C2C3L细胞的凹槽则以均匀分散的颗粒（d和f）为特征。棒材：（a–c）200 nm；（d–i）100纳米。

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相邻C2L和C3L细胞之间细胞-细胞接触面的冷冻断裂复制图像。当C2L融合培养物中的细胞-细胞接触面断裂时，断裂面的特征是P面（P-C2L；a）上的不连续股线和E面（E-C2L；b）上被颗粒链占据的凹槽。相反，C3L融合培养物中接触区的断裂面在P面上显示出连续的链（P-C3L；b），在E面上显示出空槽（E-C3L；b）。在融合的C2L/C3L共培养中，除了这些C2L/C2L和C3L/C3L断裂面外，偶尔还发现了C2L/C2L和C3L/C3L断裂面，这些断裂面来自相邻C2L和C3L细胞之间的接触区域。如预期，在这些平面中，观察到E-C2L和P-C3L（c）或E-C3L和P-C2L的组合（数据未显示）。当断裂平面从E-面跳到P-面时，可以看到E-C2L的凹槽和P-C3L的链的网络图案的连续性被完全保持，这表明在这些平面中，C2L细胞中的单个claudin-2均聚物总是与相邻C3L细胞中的claudin-3均聚物横向结合。棒材：（a和b）200 nm；（c） 200纳米。

作为Claudins不同物种的异质聚合物的TJ链

Northern印迹显示，几个不同种类的克劳丁在单个器官中共存，例如肺、肝和肾(Furuse等人，1998年a；Morita等人，1999a). 由于claudin-1、-2和-3似乎在肝脏中表达，我们首先用豚鼠antocaudin-1 pAb/兔antocaudian-2 pAb或豚鼠antocAudin-1 p Ab/兔子antocauding-3 pAb对小鼠肝脏冰冻切片进行双重染色。如所示图3a–d、claudin-1、-2和-3在沿胆管的连接复合体区域共定位。这些发现表明，克劳丁-1、-2和-3在这些细胞中均匀混合，至少在免疫荧光显微镜下是这样。此外，从小鼠肝脏获得的冷冻骨折复制品用反式胆红素-1 pAb和反式胆囊收缩素-3 pAb双重标记(图3e） ●●●●。尽管由于未知原因，豚鼠抗凝血素-1 pAb对冷冻断裂复制品的标记能力很低，但分别代表claudin-1和-3定位的15-nm和5-nm金颗粒似乎沿着单个TJ链混合。因此，在TJ链的水平上，claudin-1、-2和-3很可能作为claudin的杂聚合物共聚到单个TJ链中（参见图1B、 型号C和D）。

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克劳丁-1、-2和-3在小鼠肝脏TJ中的共分布。a–d，肝脏冰冻切片用豚鼠抗核蛋白-1 pAb（a）/兔抗核蛋白-2 pAb。Claudin-1、-2和-3在结合复合体区域精确地共定位，尽管Claudin-1和-2的表达水平似乎有显著差异，这取决于肝细胞在小叶中的位置（数据未显示）。e、 将小鼠肝脏的冷冻断裂复制品用反义audin-1 pAb（15-nm金）和反义audian-3 pAb进行双重标记。5纳米金颗粒被包围。虽然抗核蛋白-1 pAb的标记能力很低，但这些图像表明，claudin-1和-3在肝脏中共聚成单个TJ链。棒材：（a–d）6μm；（e） 100纳米。

为了评估这种可能性，我们使用L转染剂作为模型系统。如前所示(Furuse等人，1998年b)和中图2C、 claudin-1、-2和-3可以在L转染体中形成均聚物。然后我们共同转染克劳丁-1和-2、克劳丁-1或克劳丁-3或克劳丁-2和-3，并获得稳定的转染体（分别为C1C2L、C1C3L或C2C3L细胞；图4A） ●●●●。当C1C2L细胞融合培养物用反转录酶-1单克隆抗体和反转录酶-2单克隆抗体双重染色时，两种克劳丁在细胞-细胞接触面上表现出相同的浓度模式(图4B、 a和B）。此外，在高倍镜下，反义audin-1单克隆抗体和反义audian-2单克隆抗体在细胞-细胞接触面上观察到几乎相同的染色网络模式(图4B、 g–i）。同样，claudin-1和-3以及claudin-2和-3也分别在C1C3L和C2C3L细胞中共定位(图4B、 c–f）。

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L转染体共表达claudin-1和-2（C1C2L细胞）、claudin-1and-3（C1C3L细胞）以及claudin-2和-3（C2C3细胞）。A、 C1C2L、C1C3L和C2C3L细胞的总细胞裂解物用抗凝血素-1pAb（抗Cln-1pAb）、抗凝血素-2pAb（抗Cln-2pAb）或抗凝血素-3pAb（抗Cln-3pAb）进行免疫印迹。检测到具有预期分子量的相应克劳丁。条形图表示从顶部开始的分子质量分别为31和21 kD。B、 将C1C2L、C1C3L和C2C3L细胞的半融合培养物分别用抗凝血素-1mAb（a）/抗凝血素-2pAb（B）、抗凝血素-1mAb（c）/抗凝血素-3pAb（d）和抗凝血素-2mAb（e）/抗凝血素-3pAb（f）双重染色。共表达的克劳丁被精确地共定位。在C1C2L细胞的更高放大倍数下，在细胞-细胞接触平面中，claudin-1和-2精确地共同集中在一个复杂的网络中（g–i），这表明claudin-1和-2共同结合到rTJ链中。棒材：（a–f）10μm；（g–i）3μm。

接下来，我们用常规冷冻断裂电镜观察了C1C2L、C1C3L和C2C3L细胞中rTJ链的形态。如前所示，C1FL和C2FL细胞(Furuse等人，1998年b)在戊二醛固定的C1L细胞中，claudin-1诱导的链主要与原生质（P）面相关，作为细胞外（E）面（P面相关TJ；参见图5g） 而在C2L细胞中，claudin-2诱导的链在P面是不连续的，在E面有互补的凹槽，这些凹槽被颗粒链占据（E面相关的TJ；参见图5h和8a；Tsukita and Furuse 1999年). 与C1L细胞相似，在C3L细胞中诱导了P-face相关的TJ（参见图5i和8 b）。有趣的是，C1C3L细胞具有典型的P面相关TJ(图5b） 而C1C2L和C2C3L细胞在P面和E面相关TJ之间表现出rTJ链/槽的中间形态(图5、a和c）；C1C3L细胞E面上的凹槽完全是空的(图5e） 而C1C2L和C2C3L细胞中的颗粒分布均匀(图5d和图f). 这些发现表明，在这些L转染体中，两种不同的克劳丁完全混合在单个rTJ链中。

为了证实这一推测，从融合的C1C2L细胞中获得的冷冻断裂复制品用豚鼠抗核蛋白-1 pAb和兔抗核蛋白-2 pAb进行双重免疫标记。如所示图6a、 分别代表claudin-1和claudin-2定位的15纳米和5纳米金颗粒似乎沿着单个rTJ链混合。在C1C3L细胞中也获得了类似的结果(图6b） ●●●●。然而，如上所述，抗坏血酸-1 pAb对冷冻断裂复制品的标记能力相当低（参见图3e） ●●●●。因此，我们获得了共表达claudin-2和FLAG-tagged claudin-1的L转染体（C1FC2L细胞），从融合的C1FC2L细胞中获得的冷冻断裂复制品用抗FLAG mAb（15-nm金颗粒）和反式audin-2 pAb（5-nm金颗粒；图6c和图d). 在这些图像中，大量的15纳米和5纳米金颗粒似乎均匀地分布在单个rTJ链上。与一起使用图5，我们得出结论，在L转染剂的模型系统中，不同种类的克劳丁可以共聚形成rTJ链作为异质聚合物（参见图1B、 型号C或D）。

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C1C2L和C1C3L细胞的免疫复制EM。a和b，C1C2L和C1C3L细胞的Freeze-fracture复制品分别用豚鼠antocaudin-1 pAb（15-nm gold）/兔antocaudian-2 pAb。5纳米金颗粒被包围。尽管反式audin-1 pAb的标记能力相当低，但15纳米和5纳米金颗粒似乎沿着单个rTJ链混合。c和d，C1FC2L细胞的冷冻断裂复制品用小鼠抗FLAG单克隆抗体（15-nm金）和兔抗黄曲霉素-2单抗（5-nm金）双重标记。在选定的rTJ链上（两个箭头之间）环绕5纳米金颗粒。大量的15纳米和5纳米金颗粒均匀地分布在单个rTJ链上。棒：（a和b）100 nm；（c和d）150纳米。

不同种类克劳丁在TJ链间横向结合中的异嗜性相互作用

如中所述图1A、 在TJs中，每个TJ链与附着膜中的另一个TJ链横向结合，后者负责TJs处的细胞间粘附。下一个问题是，这种横向联系，即TJ处的细胞粘附，是否归因于克劳丁细胞外区域的亲同或亲异相互作用。由于成对的rTJ链在C1L、C2L和C3L细胞中被诱导，如模型A所述，claudins的同源相互作用(图1B） 可以在这些单元格中预期。接下来，我们研究了克劳丁在均聚物之间的异嗜性相互作用的可能性(图1B、 模型B）通过共培养C1L、C2L和C3L细胞对。

如所示图7a–c，当C1L和C3L细胞共同培养，并用反转录素-1单克隆抗体和反转录素-3单克隆抗体双重染色时，根据免疫荧光染色区分三种类型的细胞-细胞接触面：claudin-1阳性/claudin-3阴性面，这将在相邻的C1L细胞之间形成；claudin-1–阴性/claudin-3–阳性平面，在相邻C3L细胞之间形成；以及在相邻的C1L和C3L细胞之间形成的claudin-1阳性/claudin-3阳性平面。高倍镜下，在claudin-1阳性/claudin-3阳性平面中，C1L和C3L细胞中的claudin1和claudin3分别集中在一个精细的网状结构中(图7j和图k)，其网络大多重叠(图7l） ●●●●。C2L和C3L细胞的共培养也获得了相同的结果(图7、d–f和m–o）。这些发现表明，基于克劳丁-3的均聚物（rTJ链）可以分别通过克劳丁-3与克劳丁-1和克劳丁-2的异嗜相互作用与基于克劳丁-1的均聚体横向结合。相反，当C1L和C2L细胞共同培养，并用反转录素-1单克隆抗体和反转录素-2单克隆抗体双重染色时，未形成claudin-1阳性/claudin-2阳性平面(图7，g–i）。因此，很可能，至少在L转染体中，克劳丁-1不能以异嗜性方式与克劳丁-2相互作用。总之，在L转染体中，除了克劳丁的某些组合外，成对的链不仅可以通过亲同相互作用形成，还可以通过克劳丁的异亲相互作用形成。

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表达claudin-1（C1L细胞）、-2（C2L细胞）或-3（C3L细胞）的两个L转染体的共培养实验。C1L/C3L（a–c，j–l）、C2L/C3L（d–f，m–o）或C1L/C2L（g–i）共培养细胞片分别用反义audin-1 mAb（绿色）/反义audian-3 pAb（红色）、反义audan-2 mAb。C1L/C3L（c）和C2L/C3L共同培养的融合图像通过免疫荧光染色确定了三种类型的细胞-细胞接触面；绿色、红色和黄色。相邻的C1L/C3L细胞或C2L/C3L之间形成黄色平面。在更高倍镜下，可以看到不同种类的克劳丁被招募到这些平面上，精确地集中在复杂的网络模式中（j–l，m–o）。然而，在C1L/C2L（i）的共培养中，没有观察到这种黄色平面。我们观察了50个田地进行C1L/C3L、C2L/C3L和C1L/C2L共培养实验，并分别在50、50和0个田地中识别出黄色平面。棒材：（a–i）10μm；（j–o）3μm。

为了进一步证实这一结论，C2L和C3L细胞的融合共培养物用戊二醛固定，并用常规冷冻断裂电镜检查(图8). 如上所述，C2L和C3L细胞中诱导的TJ分别与E面和P面相关，即C2L/C2L接触面的断裂面在P面上显示出不连续的股线（P-C2L图8a） 和E面上被颗粒链占据的凹槽（E-C2L in图8a） ，而C3L/C3L接触面处的断裂面在P面上显示出连续的线束（图8b） 和E面上的空槽（E-C3L英寸图8b） ●●●●。在C2L/C3L共培养中，除了这些C2L/C2L和C3L/C3L断裂面之外，偶尔也会发现断裂面，这些断裂面可能来自相邻C2L细胞和C3L细胞之间的接触区域。在这些平面中，正如预期的那样，E-C2L和P-C3L(图8c） 或E-C3L和P-C2L（数据未显示）配对。有趣的是，如图8c、 当断裂面从E-跳跃到P-面时，E-C2L凹槽和P-C3L链的网络模式的连续性得到了完全保持，这最终表明在这些平面中，C2L细胞中的单个claudin-2均聚物总是与claudin-3均聚物横向结合，在相邻的C3L细胞中形成TJ。

缺失COOH端细胞质结构域的Claudin-1聚合形成TJ链

在本研究中，我们从克劳丁-克劳丁相互作用的角度讨论了TJ链的形成。然而，我们应该考虑外周膜蛋白可能参与TJ链的形成。由于claudins的COOH末端细胞质域被认为负责与外周膜蛋白的相互作用，我们构建了一个缺乏其COOH端细胞质域的claudin-1突变体（claudin-1-ΔC），获得了表达FLAG-tagged claudin-1-ΔC（C1ΔCFL细胞；图9A） ●●●●。这些克劳丁突变体集中在细胞-细胞边界，如免疫荧光所示图9B.从C1ΔCFL细胞获得的冷冻断裂复制品表明，该claudin-1突变体仍然具有发达的rTJ链网络(图9C） 有趣的是，这些rTJ股主要与P面相关，主要是连续结构，E面有空槽。这些发现表明，克劳丁和外周膜蛋白之间的相互作用对于TJ链的形成及其P面结合本身并不是必需的。

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从L细胞中缺乏其COOH末端结构域的claudin-1突变体中形成rTJ链。A、 表达claudin-1的L转染体（C1L细胞）或缺乏其COOH末端结构域的FLAG-tagged claudin-1突变体（C1ΔCFL细胞）的总细胞裂解物分别用反式audin-1 pAb和抗FLAG mAb进行免疫印迹。条形表示从顶部开始的分子质量分别为31、21和14 kD。B、 用抗FLAG单克隆抗体（a）对C1ΔCFL细胞的半融合培养物进行染色。表达的claudin-1突变体高度集中在细胞-细胞边界，呈平面状。b、 相控图像。C、 C1ΔCFL细胞中诱导rTJ链的冷冻断裂复制图像。缺乏COOH末端结构域的FLAG-tagged claudin-1突变体可以在L细胞的P面（P）上形成发育良好的rTJ链网络。E、 E面。棒材：（B）10μm；（C） 200纳米。

讨论

先前的研究表明，克劳丁在质膜内聚合，构成TJ链的主干(Furuse等人，1998年a，Furuse等人，1998年b). 此外，可以接受的是，每个TJ链在对置膜中与另一个TJ链横向结合，形成成对链。因此，克劳丁之间有两种互动方式；聚合形成TJ链的并排相互作用，以及每对链之间的头对头相互作用，以实现细胞粘附。因为克劳丁是一个多基因家族(Furuse等人，1998年a；Morita等人，1999a；Tsukita and Furuse 1999年)，上述每种相互作用方法都可以进一步细分为亲同性和亲异性相互作用(图1B） ●●●●。因此，成对TJ链的可能分子组织可分为四种模型(图1B、 型号A至D）。在本研究中，我们使用单独或联合表达claudin-1、-2和-3的L转染剂评估了这些模型。首先，单种克劳丁足以重组TJ链，表明这些细胞中形成了均聚物（参见图2；Furuse等人，1998年b). 此外，这些均聚物是横向缔合的，两者都是亲同性的（参见图2)以及异性恋方式（参见图7). 因此，L转染体中的TJ可以采用A型和B型中的两种组织(图1B） ●●●●。另一方面，杂多聚物也在L转染子中被诱导（参见图4). C型和D型(图1B） 在L转染系统中没有区分，但由于模型A和B都是可能的，因此模型C和D也可能(图1B） ●●●●。

在冷冻断裂复制图像中，TJ链的厚度为～10-nm(施泰赫林1973，施泰赫林1974). 有趣的是，由六个连接蛋白组成的缝隙连接通道的直径也为～10-nm(Kumar和Gilula，1996年；江和Goodenough 1996). 由于连接蛋白也有四个跨膜结构域，与克劳丁具有相同的膜拓扑结构，因此很容易推测克劳丁的低聚物也是TJ中的单元结构，并且这些单元结构是线性排列的，形成单独的TJ链。这就提出了一个新的问题，即这些单位结构本身是同质还是异体，进一步细分了上述四种模型；杂聚合物可以由线性排列的异聚单元结构以及不同的同聚单元结构形成。这种类型的讨论已经详细报道了缝隙连接，其中单元结构已经确定(Kumar和Gilula，1996年；江和Goodenough 1996)但在TJ股中，单元结构的澄清是进一步讨论的先决条件。

Northern印迹显示，大多数组织表达两种以上的克劳丁(Furuse等人，1998年a；Morita等人，1999a). 免疫荧光显微镜显示TJs原位在肾脏中含有克劳丁-4和-8(Morita等人，1999a)肝脏中的克劳丁-1、-2和-3(图3). 因此，取共转染实验的结果（参见图5和图6)，虽然少突胶质细胞髓鞘和睾丸支持细胞中的特化TJ链似乎主要由一种克劳丁，即克劳丁-11组成，但原位大多数TJ链很可能是克劳丁的异质聚合物(Morita等人，1999b). 如本研究所示，每对TJ链之间不仅允许克劳丁的亲同性相互作用，也允许克劳丁与异亲性相互作用。因此，在杂聚合物的成对TJ链中，各种克劳丁物种的原位亲同相互作用以及克劳丁物种各种组合之间的亲异相互作用预计会发生，如模型D所示(图1B） ●●●●。可以合理地假设，这些相互作用的强度取决于所涉及的克劳丁物种及其组合，每个TJ链的紧密性是由克劳丁物种的数量/类型及其在链中的混合比决定的。例如，MDCK I细胞具有比MDCK II细胞更紧密的TJ屏障，但在这两个不同的MDCK细胞克隆之间，TJ链的数量没有发现差异(史蒂文森等人，1988年). 这些观察结果表明，这两个克隆之间的配对TJ链在紧密性方面存在着质的差异，这种差异可以按照上述假设进行解释。

为了避免进一步的复杂性，我们没有讨论闭塞素。免疫复制分析表明，在大多数类型的上皮细胞中，闭塞素也原位并入TJ链(藤本1995；Furuse等人，1996年；Saitou等人，1997年). 当闭塞素与克劳丁-1共同转染到L细胞中时，它们被合并成rTJ链（当然也成对地转染rTJ；Furuse等人，1998年b). 单独导入L细胞的闭塞素以点状方式集中在细胞-细胞边界，表明闭塞素在相邻细胞之间以亲同方式相互作用(Furuse等人，1998年b). 此外，当表达闭塞素的L转染体与C1L细胞共培养时，闭塞素或克劳丁-1均未在细胞-细胞边界富集，这表明闭塞素不会在相邻细胞之间以异嗜性方式与克劳丁-1相互作用（Furuse，M.和S.Tsukita，未发表的数据）。因此，目前很难推测闭塞素是如何原位并入克劳丁（TJ链）的成对杂聚合物中的。闭塞素可以以与克劳丁相同的方式并入基于克劳丁的TJ链中，在成对的TJ序列中，闭塞素可以与闭塞素相对放置，从而允许闭塞素-闭塞素相互作用(Furuse等人，1998年b). 或者，可以将其放置在克劳丁对面，这可能会导致形成小孔。也可能是闭塞素参与TJ链形成的方式与克劳丁不同。

最后，我们应该讨论外周膜蛋白的可能作用，例如ZO-1(史蒂文森等人，1986年)、ZO-2(Gumbiner等人，1991年)、和ZO-3(Balda等人，1993年；Haskins等人，1998年)形成TJ股。ZO-1（而非ZO-2或ZO-3）在L细胞中内源性表达，这种内源性ZO-1在C1L和C2L细胞中分别与claudin-1和-2在细胞-细胞边界共同富集，形成精细的网络（Itoh，M.，M.Furuse，K.Morita和S.Tsukita，未发表的数据）。在我们之前的研究中(Furuse等人，1998年b)，我们报道在L转染体中，COOH末端带有FLAG标记的claudin-1和-2也形成了rTJ链的发达网络。然而，有趣的是，内源性ZO-1没有被招募到这些基于FLAG-claudin-1或FLAG-claudin-2的rTJ链中，这可能是因为FLAG序列影响了claudin/ZO-1的相互作用（Furuse，M.和S.Tsukita，未发表的数据）。这些发现表明，L转染体中rTJ链的形成不需要ZO-1（以及ZO-2和ZO-3）。此外，图9结果表明，一个缺乏几乎所有COOH末端细胞质结构域的claudin-1缺失突变体在L转染体中仍然形成了一个发育良好的rTJ链网络，这支持了外周膜蛋白不参与质膜内claudins聚合的观点。因此，我们在没有考虑外周膜蛋白可能参与的情况下解释了本研究中的数据。

本研究中使用的L转染剂模型系统对于分析每个克劳丁物种的特性非常有用。迄今为止，克劳丁家族已有15名成员被确认身份，但未来将有多少克劳丁被确认身份尚不清楚。因此，通过使用上皮细胞来阐明每种克劳丁的性质和功能是非常困难的，部分原因是我们不能准确地确定某些上皮细胞中表达的所有类型的克劳丁。因此，为了进一步了解克劳丁和TJ链的结构和功能，L转染系统将继续用于重建TJ，作为敲除每个克劳丁基因的补充技术。

在证明中添加注释。位置克隆已确定克劳丁家族的一个新成员（副细胞素-1/克劳丁-16），其突变可导致人类遗传性肾低镁血症（Simon，D.B.，Y.Lu，K.a.Choate，H.Velazquez，E.Al-Sabban，M.Praga，G.Casari，a.Bettinelli，G.Colussi，J.Rodriguez-Soriano，et Al.1999）。副细胞蛋白-1，一种副细胞镁所需的肾紧密连接蛋白2+再吸收。科学类. 285:103–106). 这一发现支持克劳丁可能参与TJ链内水孔形成的观点。

致谢

我们感谢我们实验室（京都大学医学院细胞生物学系）的所有成员进行了有益的讨论。我们还要感谢吉田女士、福井康夫女士和福鲁斯女士提供的出色技术援助，以及森田康夫博士和索诺达博士（京都大学）分别构建claudin-3表达载体和生产单克隆抗体。

本研究部分由日本教育、科学和文化部向S.Tsukita提供的癌症研究赠款和科学研究赠款（a）支持，部分由Kazato研究基金会向M.Furuse提供的赠款支持。

脚注

本文中使用的缩写：E面、细胞外面；pAb，多克隆抗体；P面，原生质面；rTJ股，重组紧密连接股；TJ，紧密连接。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社