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细胞生物学杂志。2003年5月12日；161(3): 653–660.
数字对象标识：10.1083/jcb.200302070
预防性维修识别码：PMC2172943型
PMID：12743111

克劳丁-5缺乏小鼠血脑屏障的尺寸选择性松动

武弘·尼塔,1,2 Masaki Hata先生,三 Shimpei Gotoh公司,1 Yoshiteru Seo先生,4 佐佐木裕久,三，5 桥本信夫,2 米基奥·福鲁斯,1和津田昭一郎1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

中枢神经系统中相邻血管内皮细胞之间紧密连接发达，在建立血脑屏障（BBB）中起着重要作用。Claudin-5是脑内皮细胞紧密连接的主要细胞粘附分子。为了检测其可能参与血脑屏障，产生了claudin-5缺陷小鼠。在这些小鼠的大脑中，血管的发育和形态没有改变，没有出血或水肿。然而，示踪实验和磁共振成像显示，在这些小鼠中，BBB对小分子（<800D）而非大分子有选择性地受到影响。这一出乎意料的发现（即BBB的大小选择性松动）不仅为BBB的基本分子生理学提供了新的见解，也为通过BBB向中枢神经系统输送潜在药物开辟了新的途径。

关键词：紧密连接；中枢神经系统；内皮细胞；血管；药物输送

介绍

血脑屏障（BBB）的存在*首先由描述埃利希（1885）100多年前。他发现注入静脉的染料染上了除大脑以外的所有器官。从那时起，BBB被认为可以保护大脑免受血液中循环的各种有害物质的伤害（有关评论，请参阅帕德里奇，1998年;Rubin和Staddon，1999年). 另一方面，BBB阻止许多潜在药物进入中枢神经系统（CNS）。因此，许多研究人员试图放松BBB以治疗各种中枢神经系统疾病（综述见米勒，2002;帕德里奇，2002年)，但关于BBB分子基础的有限信息阻碍了这些试验。

为了建立血脑屏障，除了血浆中的各种转运体外，相邻内皮细胞之间发育良好的紧密连接（TJ）也是必不可少的(Reese和Karnovsky，1967年; 有关评论，请参阅帕德里奇，1998年;鲁宾和斯塔顿，1999年;爱德华兹，2001;Wolburg和Lippoldt，2002年). TJ是细胞-细胞粘附的一种方式，在密封上皮细胞和内皮细胞板中的细胞间隙方面起着核心作用（例如屏障功能；有关综述，请参阅施尼伯格和林奇，1992年;Anderson和van Itallie，1995年;Tsukita等人，2001年). 在超薄切片电子显微镜上，TJ显示为相邻细胞的质膜局部完全接触的区域(法夸尔和帕拉德，1965年). 在冷冻断裂电子显微镜下，TJ被视为由膜内颗粒链（TJ链或纤维）和互补凹槽组成的连续网状结构(施泰赫林，1974年). 这些观察结果导致我们对TJ三维结构的当前理解：在TJ处，在每个膜的脂质双层内，一些特定的完整膜蛋白线性聚集，形成“TJ链”然后，单个TJ链与相邻细胞的对置膜中的TJ链横向紧密结合，形成成对链，其中细胞间距离几乎为零（TJ的所谓“接吻点”；有关审查，请参阅Tsukita等人，2001年).

据报道，一些外周膜蛋白（如ZO-1）集中在TJ的细胞质表面（综述见施尼伯格和林奇，1992年;Anderson和van Itallie，1995年;Balda and Matter，1998年;Tsukita等人，1999年,2001). 直到最近，关于TJ粘附分子的信息一直缺乏，但现在已知三种不同类型的完整膜蛋白定位于TJ：闭塞蛋白(Furuse等人，1993年)，连接粘附分子（JAM）(Martin-Padura等人，1998年)和克劳丁（Cld；Furuse等人，1998年a). Occludin是一种具有四个跨膜结构域的～65-kD整合膜蛋白，被鉴定为TJ链的第一组分(Furuse等人，1993年). 然而，包括基因敲除分析在内的几项研究表明，TJ链可以在无闭塞蛋白的情况下形成(Balda等人，1996年;Saitou等人，1998年). 最近研究表明，具有单个跨膜结构域的JAM与TJ链横向相关，但并不构成链本身(Itoh等人，2001年). 相比之下，现在认为Cld是TJ链的主要组成部分（有关审查，请参阅Tsukita等人，2001年). 分子量为～23 kD的Cld包含一个由20个以上成员组成的多基因家族(Morita等人，1999年a;Tsukita等人，2001年). Clds也有四个跨膜结构域，但与闭塞素没有任何序列相似性。有趣的是，当每种Cld在缺乏内源性Cld的小鼠L成纤维细胞中过度表达时，外源性表达的Cld分子在质膜内聚合，以在细胞-细胞接触区域重建“配对”TJ链(Furuse等人，1998年b). 此外，通过进一步详细的转染实验和免疫标记研究，现在广泛接受异质性Cld物种构成原位TJ链的主干；也就是说，TJ链是异质Cld物种的共聚物（以及闭塞素；Furuse等人，1999年;Tsukita等人，2001年).

最近，在内皮细胞中特别发现了大量的Cld-5，尤其是在脑内皮细胞中(Morita等人，1999b)这导致了Cld-5可能直接参与BBB的建立。在本文中，为了评估这一想法，我们通过同源重组产生了Cld-5缺陷小鼠，并发现在这些小鼠中，BBB以大规模选择性的方式松动。我们认为，这项工作标志着开发一种新的基于TJ的向中枢神经系统递送药物的方法的第一步。

结果

Cld-5缺乏小鼠的产生

我们生产了不能表达Cld-5的小鼠。核苷酸测序和限制性内切酶图谱仅鉴定出一个外显子，该外显子覆盖了Cld-5的整个开放阅读框架。我们构建了一个靶向载体，旨在破坏氯化物-5用新霉素抗性基因替换其外显子(图1a） 。两个不同的小鼠系由不同的胚胎干细胞克隆产生，其中氯化物-5基因被同源重组破坏。Southern杂交证实了氯化物-5杂合和纯合突变小鼠的基因(图1b） ，RT-PCR未检测到纯合子突变小鼠大脑中的Cld-5 mRNA(氯化物5 −/−老鼠；图1c） ●●●●。氯化物5 −/−小鼠出生时符合预期的孟德尔比率，宏观上看起来正常(图1d） ●●●●。然而，它们的活动逐渐停止，它们都在出生后10小时内死亡。由于两个品系的小鼠表现出相同的表型，我们将主要介绍从一个品系获得的数据。

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Cld-5缺陷小鼠的产生。（a） 小鼠野生型等位基因、靶向载体和靶向等位基因的限制性图谱氯化物-5基因。只有一个外显子覆盖了Cld-5的整个开放阅读框架。靶向载体的中部含有pgk-neo盒，用于删除靶向等位基因中的外显子。Southern印迹的5′和3′探针的位置以条形表示。E、 生态研究所；Sa、SacI；K、 KpnI；N、 NcoI；和S，Sse8387I。（b） 通过Southern blotting对野生型（+/+）、杂合型（+/-）和纯合型（−/-）小鼠Eco-RI消化的基因组DNA进行基因型分析氯化物-5基因等位基因。用5′和3′探针进行Southern杂交，从野生型等位基因中获得8.4kb条带，从靶基因中获得4.7kb和3.7kb条带子。（c） 大脑中Cld-5 mRNA的丢失氯化物-5 −/−RT-PCR检测小鼠。作为对照，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因在所有样本中均扩增。（d） 新生儿氯化物-5 +/+和氯化物-5 −/−老鼠。纯合子Cld-5缺陷小鼠出生时符合预期的孟德尔比例，宏观上看起来正常。然而，它们的活动逐渐停止，它们都在出生后10小时内死亡。

Cld-5缺乏小鼠脑血管的形态学

我们在氯化物5 −/−老鼠。如所示图2（a和a′），对9.5-d胚胎进行PECAM-1（内皮细胞标记物）的全套免疫染色，在氯化物5 −/−老鼠。此外，在18.5天胚胎脑切片的苏木精-伊红和抗PECAM-1单克隆抗体染色中，野生型和氯化物5 −/−老鼠(图2、b、b′、c和c′）。未发现出血或水肿迹象氯化物5 −/−大脑。新生儿野生型之间的脑组织含水量始终没有差异（85.6±0.38%，n个=11）和氯化物5 −/−小鼠（85.4±0.30%，n个= 12).

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血管生成与脑组织学氯化物5 −/− 老鼠。（a和a′）全套免疫染色。9.5-d野生型小鼠和氯化物5 −/−用抗PECAM-1单克隆抗体标记胚胎。在野生型和脊椎动物中观察到头部和脊椎动物部分血管的特征性树状和梯形染色模式氯化物5 −/−胚胎。（b、b′、c和c′）苏木精-伊红染色的野生型石蜡切片（b和b′）和抗PECAM-1染色的冷冻切片（c和c′）氯化物5 −/−18.5天胚胎的大脑。未检测到差异。棒材：（a和a′）300μm；（b和b′）100μm；（c和c′）40μm。

在电子显微镜下，新生儿大脑的血管氯化物5 −/−小鼠没有表现出明显的形态异常(图3)。仔细检查发现，即使在氯化物5 −/−小鼠的内皮细胞-细胞接触区出现了外观正常的TJ，显示了所谓的TJ亲吻点。考虑到Cld-5从内皮细胞中消失(图4)这一发现表明，在野生型脑的内皮细胞中，TJ链不仅由Cld-5组成，还包括其他Cld物种。我们使用现有和新生成的抗体研究了Cld-1–16中的内皮细胞特异性Cld，发现除了Cld-5外，Cld-12在野生型脑内皮细胞和氯化物5 −/−脑内皮细胞(图4). 因此，我们得出结论：氯化物5 −/−大脑，Cld-5只需从内皮细胞的TJ中去除，留下至少由Cld-12组成的TJ。

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脑血管的超微结构 氯 第5天 −/− 老鼠。在第5类 −/−18.5天胚胎的大脑，超薄切片电镜显示血管没有明显的形态异常。相邻内皮细胞之间观察到TJ，在高倍镜下，可以清楚地看到所谓的TJ吻点（箭头）。棒材：（左）4μm；（中部）0.2μm；（右）50 nm。

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脑血管中的Cld-12。（a） 新生成的抗Cld-12 pAb的特异性。总裂解物的免疫印迹大肠杆菌用Cld-1-16胞质域表达GST融合蛋白证实了其特异性。CBB、考马斯亮蓝染色；抗Cld-12单克隆抗体,用抗Cld-12单克隆抗体进行免疫印迹。（b） 野生型和第5类 −/−用抗ZO-1单克隆抗体和抗Cld-5单克隆抗体或抗Cld-12单克隆抗体对18.5天胚胎脑组织进行双重染色。Cld-5在氯化物5 −/−大脑。Cld-12不仅在野生型中，而且在野生型和野生型中都集中在ZO-1阳性TJ上氯化物5 −/−脑内皮细胞。当抗Cld-12 pAb与GST-Cld-12融合蛋白预孵育时，这些Cld-12信号被消除。野生型和野生型之间的Cld-12信号强度似乎没有显著差异第5类 −/−脑内皮细胞。内皮细胞TJ处的闭塞素浓度在氯化物5 −/−大脑（未发布的数据）。棒材，20μm。

Cld-5缺乏小鼠BBB的尺寸选择性松动

重要的问题是TJ（即BBB）的屏障功能在氯化物5 −/−脑内皮细胞。评估中的BBB氯化物5 −/−小鼠，我们进行了示踪实验：第5类 +/−胚胎第18.5天通过剖腹产获得交叉窝友，复苏，并从左心室灌注示踪剂。这些室友后来进行了基因分型。首先，我们使用一种初级胺反应生物素化试剂（443 D）作为示踪剂，该试剂与可接触的蛋白质共价交联。迄今为止，该示踪剂已成功用于评估上皮细胞TJ的通透性(Chen等人，1997年;Furuse等人，2002年). 灌注5分钟后，用HRP-结合链霉亲和素在全身矢状切面上检测生物素化试剂的定位(图5、a和a′）。在野生型胚胎中，该试剂被明确排除在中枢神经系统之外。这确实证实了埃利希的工作，该工作首先描述了BBB(埃利希，1885年). 相反，在氯化物5 −/−小鼠、大脑和脊髓显示出强烈且弥散的HRP活性。在野生型大脑中，在更高的放大倍数下，生物素化试剂保留在血管中，而在氯化物5 −/−大脑中，这种试剂在脑实质中扩散分布，在血管中有一定浓度(图5，b、b′、c和c′）。图6表示生物素化试剂从血管中泄漏的时间过程氯化物5 −/−大脑。灌注1分钟后，该试剂似乎已经通过BBB。这些发现清楚地表明，BBB在第5类 −/−老鼠。

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中BBB的减值 氯化物5 −/− 18.5天胚胎的大脑。从复苏胚胎的心脏灌注初级胺反应生物素化试剂（443 D）。孵育5分钟后，用HRP偶联链霉亲和素孵育全身（a和a′）或大脑（b，b′，c和c′）的矢状冷冻切片，通过过氧化物酶活性定位生物素化试剂。在低倍放大的野生型小鼠（a）中，试剂完全从大脑（箭头）和脊髓（箭头）中排除；形成鲜明对比的是氯化物5 −/−小鼠（a′），中枢神经系统表现出强烈的过氧化物酶活性。放大倍率较高时第5类 −/−（b′和c′）但在野生型脑（b和c）中，试剂大量渗入实质。棒材：（a和a′）2 mm；（b和b′）40μm；（c和c′）10μm。

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生物素化试剂从血管中泄漏的时间过程 氯化物5 −/− 大脑。从复苏胚胎的心脏灌注初级胺反应生物素化试剂（443 D）。经过1、3、5或10分钟的孵育后，用罗丹明结合的链霉亲和素孵育大脑冰冻切片，以观察注射的生物素化试剂的分布。棒材，50μm。

如果血清蛋白在脑内自由渗出，则应诱发血管源性水肿。然而，如中所述图2b、 没有水肿的迹象氯化物5 −/−大脑。我们检查了血清白蛋白（～68 kD）可能从氯化物5 −/−大脑(刘，1988;Vinores等人，1989年;图7a） 。有趣的是，用抗白蛋白多克隆抗体（pAb）进行免疫染色显示，血清白蛋白没有泄漏，而是完全保留在血管中。此外，我们使用微过氧化物酶（～1.9 kD）作为示踪剂进行了示踪实验(Knothe Tate等人，1998年). 如所示图7b、 在第5类 −/−大脑。这些发现表明氯化物5 −/−脑，BBB（即内皮细胞的TJ屏障）以大小选择性的方式松动。如果是这样氯化物5 −/−大脑是可以解释的。在图7c、 为了证实这一推测，我们通过心脏灌注四甲基罗丹明结合葡聚糖（～10 kD）和荧光染料的混合物进行核染色（Hoechst染色H 33258；562 D(Chang-Ling等人，1992年;Hu等人，2000). 培养5分钟后，在野生型大脑中，右旋糖酐和人33258残留在血管中。H33258号只对内皮细胞的细胞核进行染色。有趣的是，在氯化物5 −/−大脑，内皮细胞和周围神经元/胶质细胞的细胞核被H33258号而右旋糖酐仅在血管内检测到。

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BBB的尺寸选择性松动氯化物5 −/− 老鼠。（a） 取脑石蜡切片，用兔抗白蛋白pAb染色，然后用HRP结合的抗兔IgG pAb孵育。通过过氧化物酶活性观察结合的pAb。未观察到内源性血清白蛋白泄漏氯化物5 −/−大脑。棒材，40μm。（b） 将微过氧化物酶（～1.9 kD）注入复苏胚胎的心脏，经过5分钟的孵育后，固定大脑。通过冰冻切片中的过氧化物酶活性观察微过氧化物酶的定位。在氯化物5 −/−大脑。棒，40μm。（c） 四甲基罗丹明结合右旋糖酐（～10 kD）和核染色染料（Hoechst染色）的混合物H33258号; 灌注562 D），并在荧光显微镜下观察冰冻切片。在野生型大脑中，右旋糖酐（红色）和赫斯特染料（蓝色）均未渗出，而在氯化物5 −/−大脑（Hoechst染料，而非右旋糖酐）渗出，以染色周围神经元/胶质细胞的细胞核。棒材，30μm。

Cld-5缺乏小鼠血脑屏障损伤的磁共振成像（MRI）分析

最后，我们定量检测了活体血脑屏障的损伤氯化物5 −/−用MRI对小鼠进行纵向（T1)弛豫试剂钆-二亚乙基三胺-N个,N个,N个′,N个″,N个〃-五乙酸（Gd-DTPA；742 D；Abbott等人，1999年;Caravan等人，1999年;Seo等人，2002年). 我们将不同剂量的Gd-DTPA注入复苏的18.5天胚胎的心脏。矢状T1-野生型大脑的加权图像清楚地显示出BBB的存在；经Gd-DTPA灌注后，除中枢神经系统外，大多数器官的信号均显著增强。相反，在氯化物5 −/−小鼠，中枢神经系统各区域的信号均显著增强，增强程度取决于注射Gd-DTPA的剂量(图8a） 。在图8b、 我们检查了平均T之间的关系1脑中水的松弛速率和注射Gd-DTPA的剂量(Seo等人，2002年). 关于一个简单的两室交换模型的假设(Fabry和Eisenstadt，1978年;Schwarzbauer等人，1997年)，这种关系使我们能够估计Gd-DTPA——野生型和氯化物5 −/−大脑分别为1.2±0.8%和14.7±4.2%（回归系数±SD）。这一发现表明，在野生型大脑中，Gd-DTPA仅保留在血管内（约占总体积的1%），而在氯化物5 −/−脑，它渗出并弥散分布于神经元/胶质细胞的细胞外间隙（约占总体积的15%）。因此，可以肯定地说，从数量上讲，BBB对抗Gd-DTPA在第5类 −/−大脑。

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18.5天胚胎的MRI。（a） 中矢状T1-野生型和氯化物5 −/−经心注射Gd-DTPA（0.0、0.5和1.0 mmol/kg体重）后的大脑。由于T缩短1弛豫时间，Gd-DTPA可及区被表示为高信号强度。在野生型小鼠中，Gd-DTPA没有进入CNS的血管外空间，因此即使在高剂量的Gd-DTPA下，大脑实质（中上部，箭头）也保持恒定的图像强度。相比之下，在第5类 −/−大脑中，包括脊髓在内的CNS所有区域（中下部，箭头）的图像强度均被Gd-DTPA增强，增强程度取决于注射Gd-DTTA的剂量。（b） 水的松弛速率（1/T）之间的关系1)脑内注射Gd-DTPA的剂量。作为1/T1大脑的1/T1取皮层、丘脑、下丘脑、小脑和脑桥5个ROI（156×156×750 mm）的平均值。粗体线和虚线分别是拟合和95%置信限的结果。如文中所述，基于简单的两室交换模型的假设(Fabry和Eisenstadt，1978年;Schwarzbauer等人，1997年)这种关系使我们能够定量估计Gd-DTPA——大脑单位体积的可及空间。

讨论

血管里衬着一层内皮细胞膜。这些细胞膜起着屏障的作用，以维持血管的内部环境，但必须有选择地将各种材料运输到这些膜上。材料穿过内皮细胞膜有两种途径：跨细胞途径，包括通过细胞的跨细胞途径和通过TJ的细胞旁途径（有关综述，请参阅1998年春季;Tsukita等人，2001年). 在中枢神经系统的血管中，内皮细胞膜起着非常紧密的屏障作用，构成所谓的血脑屏障（有关综述，请参阅帕德里奇，1998年;鲁宾和斯塔顿，1999年). 为了建立血脑屏障，首先，应完全抑制材料通过跨细胞途径的运输，以便内皮细胞的质膜中需要专门的运输系统，以便中枢神经系统吸收葡萄糖和氨基酸等小分子（有关综述，请参阅帕德里奇，1998年,2002;爱德华兹，2001;米勒，2002). 此外，当一些物质泄漏到中枢神经系统的薄壁组织中时，多药耐药转运蛋白mdr1a（P-糖蛋白1）集中在内皮细胞质膜中，将其从脑实质重新分配到内皮细胞，从而返回血液(Cordon Cardo等人，1989年;Schinkel等人，1994年;爱德华兹，2001). 其次，细胞旁通路也应严密密封。与非神经元组织中的内皮细胞相比，TJ显著发育(Reese和Karnovsky，1967年;Wolburg和Lippoldt，2002年). 考虑到BBB的这些细胞基础，TJ被认为是各种中枢神经系统疾病治疗中BBB瞬时分解的有吸引力的靶点。

我们发现脑血管中的TJ主要由至少两种不同的Cld组成：Cld-5和-12。正如之前报道的那样，抗Cld-1单克隆抗体也染色了野生型大脑中的血管(Liebner等人，2000年)但在Cld-1缺乏小鼠中，这种染色仍呈阳性（未发表数据）。我们通过生成Cld-5缺陷小鼠来检测Cld-5在BBB中的作用。在第5类 −/−大脑，Cld-5被简单地从内皮细胞的TJ中去除，留下形态正常的血管以及基于Cld-12的TJ。然而，在屏障功能方面，这些内皮细胞TJ表现出一种特殊的异常。示踪实验和MRI显示，在这些小鼠中，BBB对小分子（小于～800 D）严重影响，但对大分子没有影响。换句话说，基于Cld-12的TJ氯化物5 −/−脑血管将起到分子筛的作用。它们只允许小分子（小于～800 D）通过TJ。当然，这种分子质量截止值（～800 D）是暂时的，因为本研究中使用的示踪剂具有不同的化学结构，并且电荷和亲水性不同。

TJ的规模选择性松动氯化物5 −/−脑血管与先前关于上皮性TJ的数据一致。MDCK I上皮细胞的TJ主要由Cld-1和-4组成，当使用Cld-4结合肽从这些TJ中去除Cld-4时，基于Cld-1的连续TJ仍然存在，泄漏了4 kD/10 kD右旋糖酐，而不是40 kD右旋糖苷(Sonoda等人，1999年). 此外，我们最近发现表皮中的TJ也由Cld-1和-4组成。在Cld-1缺陷小鼠中，表皮颗粒层中仍然存在连续的基于Cld-4的TJs，表皮角质形成细胞的分层组织没有受到影响(Furuse等人，2002年). 然而，有趣的是，表皮对水的屏障受到严重影响，导致新生小鼠脱水。因此，一般来说，可以放心地说，当TJ由两种以上不同的Cld组成时，去除一种Cld会显著改变TJ的屏障功能，同时保持其连续的结构完整性。

因此，在氯化物5 −/−大脑，基于Cld-12的TJ的存在将保持内皮细胞的结构完整性（和极性），不会出现出血。此外，基于Cld-12的TJ的大小选择性不允许大多数血清蛋白外渗，从而不会导致血管源性水肿。从给药的角度来看，无出血和水肿是非常重要和有利的。因此，Cld-5可被视为开发新的中枢神经系统疾病给药方法的潜在靶点。当然，血脑屏障的损伤，即使是暂时的或以大小选择性的方式，也可能在一定程度上对中枢神经系统的活动有害。的确，氯化物5 −/−小鼠出生后10小时内死亡。Cld-5在大脑中的所有血管段中都有大量表达，但在非神经组织的某些血管段中也检测到了Cld-5，如肺和肾(Morita等人，1999b). 在苏木精-伊红染色切片中对各种组织进行组织学检查氯化物5 −/−小鼠，但未检测到明显异常（未公布数据）。因此，目前不容易讨论BBB损伤和死亡之间的因果关系氯化物5 −/−老鼠。为了回答这个问题，以及更好地了解血脑屏障的基本生理学，我们应该在其中培养小鼠氯化物-5成年小鼠脑血管内皮细胞中的基因可以被条件性敲除。

材料和方法

抗体

购买大鼠抗PECAM-1 mAb（BD Biosciences）、大鼠抗小鼠ZO-1 mAb（CHEMICON International，Inc.）、兔抗Cld-5 pAb（Zymed Laboratories）和兔抗小鼠白蛋白pAb（Inter-Cell Technology，Inc.）。抗-Cld-12 pAb升高如下。与小鼠Cld-12的COOH末端细胞质结构域相对应的多肽（在其NH处添加半胱氨酸残基2末端）被合成并通过半胱氨酸残基偶联到锁孔帽贝血蓝蛋白。将这种肽作为抗原注射到兔子体内。兔抗血清在使用前在硝化纤维素膜上用GST融合蛋白与Cld-12亲和纯化。

的生成氯化物5 − /−老鼠

通过筛选129/Sv基因组文库，获得了两个编码小鼠Cld-5的重叠克隆。使用它们，构建目标载体，如所示图1a.将白喉毒素a表达盒（MC1pDT-a）置于3′同源臂外进行阴性选择。如所示图1a、 只有一个外显子覆盖了Cld-5的整个开放阅读框架。因此，该靶向载体被设计为通过替换pgk-neo盒来删除该外显子。用靶向载体电穿孔J1 ES细胞，并在G418存在下选择约9天。用5′和3′外探针通过Southern blotting去除并筛选G418耐药菌落(图1a） 。当用EcoRI消化时，通过5′探针的野生型等位基因的附加4.7-kbp带和8.4-kbp带，以及通过3′探针的野生型等位基因的附加3.7-kbp带和8.4-kb带，鉴定了正确靶向的ES克隆。将获得的靶向ES细胞注射到C57BL/6囊胚中，然后将其转移到BALB/c养母体内，获得嵌合小鼠。雄性嵌合体与C57BL/6雌性嵌合体交配，并对agouti子代进行基因分型，以确认目标等位基因的种系传递。通过Southern印迹法对窝友进行基因分型。接下来，将杂合小鼠进行杂交，以产生纯合小鼠。

免疫染色

为了进行全山染色，杀死小鼠9.5-d胚胎。样品在PBS中通过微波预处理20 s，并在4%PFA/PBS中固定30 min。它们在甲醇中脱水并用30%H漂白202然后将样品重新水化，用PBS-MT（0.2%Triton X-100和1%脱脂牛奶/PBS）封闭，并用大鼠抗-PECAM-1单克隆抗体和HRP结合的山羊抗鼠IgG孵育过夜（CHEMICON International，Inc.）。接下来，分别用PBS-MT和PBS-T（0.2%Triton X-100/PBS）清洗5 h。通过与0.025%DAB、0.08%NiCl孵育，观察结合抗体2和30%H202在PBS-T中。

如前所述，对冷冻切片和石蜡切片进行免疫荧光染色/过氧化物酶组织化学和超薄切片电子显微镜检查(Morita等人，1999b).

示踪物实验

氯化物5 +/−胚胎第18.5天通过剖腹产获得交叉窝产仔并复苏。在立体显微镜下使用低压灌注装置（Terumo）在1分钟内从左心室灌注以下溶液；含有1 mM CaCl的PBS中5μl/g体重的25 mg/ml微过氧化物酶（MP-11；1862 D；Sigma-Aldrich）2(Knothe Tate等人，1998年); 含有1 mM CaCl的PBS中1 ml/g体重的2 mg/ml EZ-LinkTM磺化-NHS-生物素（443 D；Pierce Chemical Co.）2(Chen等人，1997年;Furuse等人，2002年); 和100μg/ml Hoecht染色剂的1ml/g体重(H33258号; 562 D；含1 mM CaCl的PBS中的钙生物化学-新生物化学2含或不含1 mg/ml四甲基罗丹明结合赖氨酸固定葡聚糖（10 kD；分子探针；Chang-Ling等人，1992年;Hu等人，2000). 灌注后1～5min，取全脑，用3.7%甲醛固定，液氮冷冻。如前所述，在冰冻切片中，检测了微过氧化物酶、EZ-LinkTM磺化-NHS-生物素、Hoecht染色和葡聚糖的分布(Chang-Ling等人，1992年;Chen等人，1997年;Knothe Tate等人，1998年;Hu等人，2000;Furuse等人，2002年).

核磁共振成像

用戊巴比妥（50μg/g体重）复苏和麻醉小鼠18.5d的胚胎，并经心注射Gd-DTPA溶液（总量<7μl）。将小鼠头朝上放置在聚苯乙烯雪橇上，用胶带固定头部位置，并使用暖风流将雪橇温度保持在34±1°C。1使用核磁共振波谱仪（7.05 T；AMX-300wb型；Bruker）获得H磁共振图像，该波谱仪具有活性屏蔽梯度（micro2.5）和1H鸟笼谐振器（直径15 mm）。T型钢1-加权矢状梯度回波成像（重复时间[TR]=100ms，回声时间[TE]=4.4ms，翻转角度=45°），平面分辨率78μm，层厚0.75mm。T型钢1使用反转恢复快速成像序列测量弛豫时间(Haase等人，1989年)具有16个检测脉冲（12°翻转角）、10个反演恢复延迟（40–7030 ms）、156μm平面内分辨率、0.75 mm层厚、3000 ms TR、2.4 ms TE和2个累积。关于Gd-DTPA可及空间和不可及空间之间存在水交换的两室模型的假设(Fabry和Eisenstadt，1978年;Schwarzbauer等人，1997年)、缓慢松弛速率（RS公司)由R给出S公司=0.5（（R克+R（右）n个+k个n个/f） −{[右克−R（右）n个+k个n个（1−2f）/f]2+4公里n个 2（1−f）/f}0.5)，其中Rn个是固有1/T1大脑中的水，kn个是扩散水从Gd-DTPA–不可进入空间流入可进入空间的速率常数，f和R克是水的体积分数，1/T1Gd-DTPA中的水——可访问空间。R克根据Gd-DTPA的松弛度进行估算(Caravan等人，1999年)Gd-DTPA的剂量和细胞外液的体积分数。

致谢

我们感谢T.Noda博士和Y.Sugitani博士在生产和分析过程中提供的技术建议氯化物5 −/−和青木博士的有益讨论和鼓励。

这项工作得到了日本教育、科学和文化部对S.Tsukita的癌症研究补助金和科学研究补助金（a）的部分支持，以及日本促进未来项目科学研究协会对M.Furuse的支持。

脚注

*本文中使用的缩写：BBB，血脑屏障；Cld，克劳丁；中枢神经系统；ES，胚胎干；Gd-DTPA，钆-二乙烯三胺-N个,N个,N个′,N个″,N个〃-五乙酸；MRI、磁共振成像；pAb，多克隆抗体；TJ，紧密连接。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社