UTX介导的增强子和染色质重塑通过ETS和GATA程序的非催化逆调节抑制髓系白血病的发生

HSPC数量、功能和分化的解除调节犹他州损失

我们的发现表明Utx公司丢失使HSPC处于白血病前状态，其转化依赖于额外的突变。为了确定白血病前期的特征，我们在发病后早期对小鼠进行了分析Utx公司缺失（pIpC后4-5周）。如前所述²¹,Utx公司^-/-小鼠脾脏肿大(图2a-b). 接下来，我们研究了UTX对造血分化和HSPC室成分的影响，HSPC室可能是转化的初始靶细胞的庇护所。Utx公司^-/-小鼠HSPC祖细胞显著扩增（血统阴性，Lin^-)(图2c)，提高了长期和短期造血干细胞（分别为LT-HSC和ST-HSC）的频率(图2d和补充图2a)粒-单核祖细胞（GMP）和普通髓系祖细胞（CMP）增加，巨核红细胞祖细胞（MEP）亚群减少(图2e、f和补充图2b)以及常见淋巴祖细胞（CLP）的显著减少(图2g和补充图2c). 为了评估热休克蛋白C的功能，我们进行了一系列的再植分析，观察到细胞的自我更新和增殖潜能增强Utx公司^-/-祖先(图2h和补充图3a). 关于BM、脾脏和血液中成熟细胞数量，在pIpC后5周仅观察到外周血血小板减少(补充图3b-d). 然而，在随后的时间点（pIpC后36周），其他健康动物的外周血MAC1也增加⁺骨髓细胞和白细胞总数以及B细胞减少Utx公司^-/-与…相比Utx公司^+/+老鼠(补充图3e-g). 总的来说，这些结果表明双等位基因缺失Utx公司导致热休克蛋白细胞及其子代的组成、功能和分化发生显著和渐进性变化，包括自我更新增强、髓系扩张以及淋巴细胞和红系/巨核细胞分化受阻(图2i).

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图2

Utx公司失血会使造血干/祖细胞膨胀，并产生髓系偏倚，这些特征由尤蒂.

a–d，白血病前期脾脏(一)，脾脏重量（t=10.93，df=63）(b条)和林氏频率⁻细胞（HSPC）（t=6.908，df=9）(c（c）)、LT-HSC（t=3.712，df=9）和ST-HSC(d日)BM中的Utx公司^+/+和Utx公司^−/−小鼠（t=4.049，df=9）。电子，CMP、GMP和MEP的代表性流式细胞术图谱（对其他5只小鼠观察到类似的结果）。（f）、林的量化⁻Sca1类⁻c-套件⁺（LK）（t=2.927，df=14），CMP（t=3.518，df=14]），GMP（t=3.608，df=14]）和MEP（t=0.181，df=15]Utx公司^+/+和Utx公司^−/−老鼠。克，BM中的CLP频率Utx公司^+/+和Utx公司^−/−小鼠（t=3.534，df=5）。小时，来源于Utx公司^+/+，Utx公司^+/负极和Utx公司^−/−（用于Utx公司^+/+对Utx公司^−/−镀层中：1，t=7.164；df=19；2，t=3.991，df=19；3，t=0.7332，df=13；4，t=5.489，df=11；5，t=3.292，df=11）我，祖细胞分化示意图总结Utx公司^−/−.绿色箭头，优先区分；红线，分化块。MPP，多能祖细胞；LMPP，淋巴启动的多潜能祖细胞。j个，Kaplan–Meier生存曲线犹他州^−/年和Utx公司^+/Y（Y）与…相比Utx公司^−/−；P（P）=两者之间无显著差异Utx公司^−/年和Utx公司^+/年通过log-rank（Mantel–Cox）测试，df=1。k个垂死小鼠的组织病理学诊断。每个基因型都显示了被诊断患有癌症的小鼠数量和分析的总数。我，祖细胞分化示意图总结Utx公司^−/年.m、 n个，串行重放(米)和扩散(n个)表达Cas9的HSPC尤蒂编辑。每个基因型从n=3只小鼠中分离细胞；显示平均值±标准偏差；P（P）通过带Bonferroni校正的单向方差分析(P（P）为显示案例9，Utx^−/年gRNA-尤蒂对案例9，Utx^+/Y（Y）gRNA-尤蒂，镀层单位为m：3（t=4.313，df=8），4（t=5.522，df=9）；在里面n个培养天数：4天（t=3.176，df=8）；6，（t=3.994，df=8）；7，（t=4.537，df=7）。在c、 d、f和克，显示平均值±s.e.m；n、 小鼠数量；P（P）通过双侧t检验。在b条和小时，显示平均值±标准偏差；P（P）通过Bonferroni校正的单因素方差分析。

UTY还抑制白血病诱导并挽救UTX缺乏的白血病前表型

为了确定UTY在抑制白血病发生中的可能作用，我们还监测了半合子(Utx公司^-/Y（Y），缺少Utx公司但表达尤蒂)和控制(Utx公司^+/年)同一时间段的雄性小鼠。与之形成鲜明对比的是Utx公司^-/-女性，Utx公司^-/Y（Y）男性在生存率或血液学表型方面与Utx公司^+/年老鼠(图2j). 特别是，我们观察到脾脏和肝脏重量、白细胞计数、血小板和血红蛋白水平没有差异(补充图3h-l). 此外，没有Utx公司^-/Y（Y）小鼠发生AML，表明UTY也抑制髓系白血病的发生(图2k). 同样，除了MEP和CLP亚区的减少外，半合子男性中UTY的存在足以消除白血病前HSPC的异常(图2l和补充图4a-i). 重要的是，CRISPR-Cas9介导的基因敲除尤蒂在里面Utx公司^-/Y（Y）小鼠增加了热休克蛋白C的自我更新，从而重演了Utx公司^-/-雌性小鼠(图2m，n).

由于UTY和UTX蛋白之间唯一的显著差异是前者缺乏催化活性，这些发现表明催化活性对其抑癌功能来说是不必要的。为了进一步验证这一假设，我们鉴定了一种AML细胞系MONO-MAC6，其两种基因均缺失UTX公司和UTY大学.慢病毒表达UTX公司,UTY大学或是催化死亡UTX公司突变体(UTX-MT2型)²²在MONO-MAC6中证实了这一假设：所有结构均显著抑制增殖在体外(图3a-c). 在异种移植试验中，MONO-MAC6表达UTX公司,UTX-MT2型或UTY大学，与相比旗帜-表达对照细胞，显示生长较慢，受体存活时间显著延长(图3d-f). 总之，这些研究表明，UTX的抑癌功能不需要其催化活性，并且与其催化活性的副产物UTY共享。

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图3

通过UTX抑制肿瘤不需要H3K27去甲基化酶活性。

一，研究的实验方法UTX公司-FLAG、UTX、UTY和UTX-MT2表达后突变的MONO-MAC6细胞。b条与FLAG相比，UTX、UTY和UTX-MT2降低了MONO-MAC6的增殖；显示平均值±标准偏差；n、 独立文化数量；P（P）通过带Bonferroni校正的单向方差分析。第3天（与FLAG相比）：UTX（t=5633；df=8），UTY（t=3,95；df=9）；第4天：UTX（t=6.866；df=8），UTY（t=5.444；df=8）；第5天：UTX（t=4.976；df=8），UTY（t=4.216；df=8）。c（c），半固体培养基中菌落形成。顶部，在n=3个培养基中观察到类似结果；底部，菌落量化。显示平均值±标准误差；n=3种独立培养基；通过带Bonferroni校正的单向方差分析得出P；与FLAG相比：UTX t=10.19，df=8；UTX-MT2 t=10.36，df=8；UTY t=7.955；df=8。d、 e（电子）,体内移植到免疫缺陷小鼠后的生长。用荧光素酶表达载体转导细胞，并在移植后第6、20和27天对小鼠进行成像。d、 定量生物发光，显示为平均值±标准偏差。；P（P）通过带Bonferroni校正的单向方差分析：**P（P）（FLAG与UTX）=0.0131，t=3.317，df=16；P（P）（FLAG与UTY）=0.0242，t=3.025，df=16；P（P）（FLAG与UTX-MT2）=0.0095，t=3.469，df=16；*对（FLAG与UTX）=0.0013，t=4.408，df=16；P（P）（FLAG与UTY）=0.1284，t=2.2，df=16；对于P（FLAG与UTX-MT2）=0.0010，t=4.524；df=16。e中，小鼠生物发光成像。（f）、移植小鼠的Kaplan–Meier生存曲线；n、 小鼠数量，P（P）通过log-rank（Mantel–Cox）测试，报告与FLAG，df=1。克，AML细胞系中UTX的免疫印迹分析；在n=3实验中也观察到类似的结果。未裁剪的图像如所示补充图12.α-微管蛋白，负荷控制。h、 我，急性髓细胞白血病UTY的qRT-PCR(小时)以及UTX突变的非造血癌细胞系(我). 在小时和我，显示平均值±s.e.m；n=3个独立的细胞培养。

两者的伴随损失UTX公司和UTY大学肿瘤抑制发生在多种人类癌症类型中

我们的发现表明UTY可以抑制髓系白血病的发生；然而，与T-ALL不同¹⁴,UTX公司-突变AML病例没有性别偏见。因此，我们分析了UTY大学在携带UTX公司突变，通过COSMIC数据库识别(图3g). 我们确认损失UTY大学在所有四个研究的男性AML细胞系中表达UTX公司突变/缺失(图3h). 来自COSMIC的外显子组测序数据分析表明，所有株系都含有UTY大学微缺失。系统地扩展我们的分析，我们鉴定出另外7个男性造血细胞系UTX公司突变，其中四个品系UTY大学微缺失(补充表1). 引人注目的是，在信息性实体器官癌中，20/25（80%）UTX公司-突变雄性细胞系也证明UTY大学微缺失/突变(补充表1)，我们确认损失UTY大学子集中的表达式（10/13；图3i).

综合基因组尺度分析确定增强子功能改变是白血病发生的介导因素Utx公司损失

为了确定UTX介导的白血病抑制的分子基础，我们对年龄匹配的白血病前期HSPC进行了综合基因组分析、RNA-Seq、染色质免疫沉淀（ChIP）-Seq和转座酶可获得染色质测序（ATAC-Seq）分析Utx公司^-/-,Utx公司^-/Y（Y）和Utx公司^+/+老鼠。正如预期的那样，与对照组相比，差异表达基因的数量显著增加Utx公司^-/-比Utx公司^-/Y（Y）（4497对673个基因，P（P）< 0.05;补充表2-4). 因为失去了单身Utx公司等位基因不会导致半合子AMLUtx公司^-/Y（Y）男性，我们从随后的分析中删除了这673个基因。关注用对数差异表达的mRNA₂倍数变化（FC）高于0.5或低于-0.5，我们鉴定了2686个基因(图4a-b). 有趣的是，UTX仅仅是一种转录激活物，这与人们的直觉有些背道而驰，在UTX作用后，类似数量的基因上调（1517，57%），下调（1169，43%）Utx公司损失。重要的是，尽管其他基因在进化为frank AML时也有差异表达Utx公司^-/-保留了白血病前转录程序的实质性成分(图4c和补充表5). 在野生型小鼠中使用ChIP-Seq，我们记录了8304个UTX结合位点，对应于6734个基因(补充表6)其中大多数发现于启动子或基因体内(图4d). 与基因表达的相关性表明，581/1169（50%）下调的基因座和614/1517（40%）上调的基因座与UTX结合(补充表7)从而表明大约一半的解除调控的基因是UTX的直接靶点(图4e)支持UTX可以是转录激活物或阻遏物的观点。

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图4

Utx公司损失主要通过影响H3K27乙酰化来驱动基因表达的上下调节

一，白血病前HSPC基因表达变化Utx公司^−/−雌性（n=2只小鼠）和Utx公司^−/年雄性（n=2只小鼠）与性别匹配的野生型对照组（n=2只小鼠）进行比较；调整后的基因P（P）显示<0.05。减去男性与女性差异表达的基因定义了一个有趣的差异转录程序；日志₂折叠变化（FC）（-0.5>对数₂FC>0.5）。b条、原木火山图₂FC（–0.5>日志₂FC>0.5）并进行调整P（P）<0.05（仅具有P（P）值介于0.05和1×10之间⁻³⁸（如图所示）。在一和b条,P（P）值是用负二项广义线性模型（DESeq2）生成的。c（c），中差异表达基因之间的重叠Utx公司^−/−白血病前HSPC（2只小鼠）和AML（3只小鼠），分别与Utx公司^+/+HSPCs（n=2只小鼠）；P（P）通过超几何检验。基因下降、减少或峰值；向上，基因或峰值增加。d日，UTX ChIP–seq在基因组注释区域的分布达到峰值。电子，白血病前期差异表达人群中UTX结合基因的高度富集Utx公司^−/−HSPC；P通过超几何检验。f–小时，H3K27me3(（f）)，H3K27ac(克)和H3K4me1(小时)所有（全局变化）或差异修改区域（局部变化）的密度图（左）和平均读取计数（右）。H3K27me3信号密度显示只有302个基因组区域被差异修饰，而类似的图显示H3K17ac有5120个差异修饰，H3K4me1有4552个差异修饰Utx公司^−/−对Utx公司^+/+HSPC。箭头显示每个基因型的每个复制（小鼠）。使用DiffBind工具计算错误发现率（FDR）；n=2只小鼠/基因型。曲线以峰值为中心，按比例绘制，每个位点±1 kb。中折线图中的阴影区域f–h指示标准错误。

与我们的发现一致，H3 Lys27-脱甲基酶活性在肿瘤抑制中是多余的，在两组中仅观察到302个差异修饰的H3K27Me3峰Utx公司^-/-和Utx公司^+/+HSPC公司。进一步证实了这一观点，大多数（200/302，67%）也表明修饰减少而不是增加(图4f和补充表8). 与此形成鲜明对比的是，同一赖氨酸残基H3-Lys27的配位乙酰化在Utx公司^-/-与…相比Utx公司^+/+老鼠。我们观察到5121个区域在两个方向上存在差异H3K27Ac（对应于2916个基因位点），其中3442个峰值（2054个基因位点(图4g和补充表9和10). 将这些假定的增强子区域与最近发表的造血干细胞和祖细胞系HPC7中基于启动子的捕获-HiC数据集进行比较（参考文献。23)，我们观察到23%的上调区域和32%的下调区域与启动子相互作用(补充图5a-c)，从而提示UTX损失的实质性增强子重塑。观察到的变化是位点特异性的，因为H3K27Ac和H3K27 Me3的全球水平在Utx公司^+/+和Utx公司^-/-BM公司(补充图5d). 为了定义染色质上的直接共现，我们重叠了UTX峰和差异H3K27Ac区域。然而，我们发现只有适度的共现现象，只有282/5121个区域（6%）是共同的(补充图5e). 然后将具有差异H3K27Ac的UTX峰和区域注释为其相关/相邻基因，定义更大的基因组区域进行比较。与有限的峰对峰共现相反，当我们比较显示差异H3K27Ac和UTX结合的全基因位点时，我们发现1396/2916个区域的高度显著重叠（48%，补充图5f和补充表11)从而表明UTX间接调节与其结合相邻区域的乙酰化。为了进一步探讨UTX对增强子功能的影响，我们对白血病前期的典型增强子定义标记H3K4Me1进行了ChIP-SeqUtx公司^-/-和Utx公司^+/+HSPC。特别有趣的是，H3K4Me1由KMT2C/D存放，KMT2C/D是已知UTX交互伙伴的COMPASS复合体组件²⁴。我们观察到4552个差异修饰的H3K4Me1峰(图4h和补充表12); 其中大多数（3898）在Utx公司^-/-老鼠。不同下调的H3K4Me1区域与同样丢失H3K27Ac的峰高度相关（1589个共有峰，46%重叠）。UTX在这些位点没有直接结合，因此提示UTX和COMPASS复合体在早期增强子规范中的间接作用。总之，这些数据证实了H3K27去甲基化酶活性对肿瘤抑制是不必要的，确定了UTX既是转录激活物又是阻遏物，并表明UTX/COMPASS介导的增强子间接调控对转化很重要。

损失Utx公司在白血病发展过程中激活致癌ETS转录程序

正如我们的基因组数据显示的那样，激活染色质标记的丢失和增加以及基因表达的上调和下调Utx公司我们推测这两个过程对白血病的发展都是必要的，但可能由不同的机制介导。因此，我们分别分析了上调和下调的基因程序。值得注意的是，一些ETS转录因子，包括精灵4,其他版本6,爱尔兰,飞行1,Ets2、Spi1和麋鹿3之后立即上调犹他州白血病前期损失(图5a). 重要的是，这些ETS因子的过度表达持续存在于Utx公司^-/-反洗钱(图5b). 基因集富集分析（GSEA）也表明白血病前期转录程序上调与肿瘤ETS因子融合EWSR1-FLI1基因敲除后抑制的基因之间存在显著相关性(图5c). 此外，614个UTX结合和上调基因的基序分析表明，ETS结合基序显著富集(图5d和补充表30). 为了直接将ETS程序与白血病发生联系起来，我们绘制了ETS因子SPI1（PU.1）在小鼠体内的全球染色质占有率Utx公司^-/-和Utx公司^+/+HSPC。我们在Utx公司^-/-(补充表13). 许多编码ETS因子的基因在Utx公司^-/-并在野生型细胞中直接与UTX结合，包括其他2和飞行1在没有UTX的情况下，PU.1启动子占有率较高(补充图5g). 这些数据表明，在缺乏Utx公司然而，在全球范围内，UTX结合与PU.1染色质占有率没有共定位（只有115个峰/14198，0.8%），因此表明PU.1结合的广泛再分配可能与其过度表达有关。已知ETS因子可招募组蛋白乙酰转移酶²⁵，从而增加H3K27Ac的沉积。因此，我们接下来询问是否在Utx公司^-/-可能与PU.1结合的UTX依赖性再分配有关。事实上，我们观察到51%的H3K4Me1（335/654）峰和30%的H3K27Ac（470/1679）峰也表明PU.1结合增加(补充图6a、b). 这些直接结合数据为增强标记的增加提供了一个机制性解释Utx公司损失。

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图5

Utx公司缺失激活致癌ETS转录程序，同时抑制GATA程序

a、 b、，白血病前期（n=2只小鼠）（a）和AML差异表达基因的火山图Utx公司^−/−（n=3只小鼠）(b条)与野生型对照组（n=2只小鼠）相比，显示多种ETS因子（红点）过度表达。FC（-0.5<对数₂FC>0.5）并进行调整P（P）<0.05（仅具有P（P）值介于0.05和1×10之间⁻³⁸如图所示）；P（P）值在DESeq2中生成。c（c）GSEA图显示与EWSR1–FLI1融合驱动的已知ETS致癌程序有显著重叠。前缀“si”表示短干扰RNA。Kinsey数据来自GSEA数据库（URL）。d日与过度表达基因重叠的UTX ChIP–seq峰的Motif分析；数字表示基序等级。电子编辑指定基因后，MONO-MAC6增殖。将BFP阳性分数与未转导人群进行比较，并将每个gRNA归一化到第4天。显示平均值±标准差；n、 独立细胞培养的数量；P（P）通过带Bonferroni校正的单向方差分析；P（P）显示第19天与对照组gRNA（空）的比较：ELF4（t=32.32）、ETV6（t=10.03）、FLI1（t=41.1）、ETS1（t=15.85）、SPI1（t=33.56）、ELF1（t=3.967）和ERG（t=12.35）；df=16。（f），GSEA图显示差异表达的基因在Utx公司^−/−HSPC具有GATA2目标的已发布数据集。克，对3442个下调的H3K27ac峰值（FDR<1%，FC<–1.5）进行Motif分析Utx公司^−/−HSPCs；数字表示基序等级。Huang数据来自GSEA数据库（URL）。小时，从小鼠髓系细胞（416B）免疫沉淀内源性UTX后通过质谱鉴定的选定蛋白质（n=2个独立细胞培养物）。主题和统计分析d日和克在HOMER软件中确定(方法和补充表30).

为了研究放松调控的ETS因子的功能重要性，我们使用CRISPR-Cas9基因组编辑来清除其中几个因子案例9-表达，UTX公司/UTY大学突变体，MONO-MAC6细胞。重要的是，我们在编辑相同的ETS因子后立即观察到显著的生长抑制Utx公司损失：FLI1公司,ERG公司,SPI1号机组(聚氨酯1）,ETS1型、和ELF4级(图5e). 这些数据表明，ETS因素在UTX公司/UTY大学损失。

Utx公司缺失影响BRG1（SMARCA4）依赖性染色质重塑，从而在白血病发展过程中抑制肿瘤抑制GATA程序

下调基因表达计划的GSEA证明GATA2靶点富集(图5f). 此外，3442个区域的基序分析显示H3K27Ac在Utx公司这一损失显示了GATA结合主题的显著且几乎是唯一的丰富性(图5g和补充表30). 与ETS基序类似，H3K27Ac的缺失与UTX结合没有直接重叠(补充图6c、d)但发生在附近，可能影响到相同的基因(补充图6e和补充表14). 为了更好地了解UTX对GATA和ETS位点乙酰化变化的间接影响，我们对小鼠骨髓细胞系416B进行了内源性UTX的下拉，并随后进行了质谱分析。我们没有观察到UTX与ETS因子或GATA2的相互作用，但我们确实发现了多个已知的UTX相互作用者，包括KMT2C/D和其他COMPASS成员(图5h和补充表15和16). 有趣的是，我们的蛋白质组分析还显示了UTX与ATP依赖的染色质重塑复合物成员SMARCA4（BRG1）和CHD4之间的低水平相互作用，我们进一步验证了这一点(补充图6f). 推测乙酰化和GATA结合的变化是通过染色质可及性的改变而发生的，我们对白血病前期患者进行了ATAC-Seq分析Utx公司^-/-HSPC和Utx公司^+/+控制。引人注目的是，我们观察到染色质可及性发生了显著的双向变化，包括7200个染色质可获性降低的位点和5244个在Utx公司损失(补充表17和18). 染色质可及性的丧失与H3K27Ac（2274/3442峰，73%）和H3K4Me1沉积（2264/3898，58%）的减少密切相关(补充图7a、d)基因表达减少(补充图7b和补充表19). 此外，对封闭染色质位点的分析表明，GATA基序显著富集(图6a和补充图7a，b). HPC-7中GATA2峰的比较（参考。26)具有差异染色质可及性Utx公司^-/-HSPC仅与封闭的染色质区域直接相关（15%，409/2796个峰），因为只有0.7%（19/2796个峰）与开放的染色质重叠。和以前一样，在闭合染色质和UTX结合之间只发现有限的重叠(补充图7c). 接下来我们询问UTX是否与染色质上的BRG1和CHD4结合。重要的是，我们观察到一个高度显著的重叠，91%（7541/8304个峰）的UTX位点与发表的ChIP-Seq中的BRG1和CHD4结合²⁷(图6c-e). 为了验证共现性，我们采用了CRISPR-Cas9基因组编辑Utx公司416B细胞靶向Utx公司外显子3，重述我们的小鼠模型。我们观察到样本位点BRG1和CHD4的染色质结合显著降低(事件1和Lrrc8c公司)在没有UTX的情况下，与UTX在包含这些蛋白质的复合物的招募中的作用一致(补充图7e-g).

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图6

UTX与染色质修饰剂相互作用以保持染色质的可及性。

a、 b条，ATAC的Motif分析–seq已关闭(一)并打开(b条)山峰，显示出前者的GATA主题和后者的ETS主题以及其他主题的戏剧性丰富。数字表示图案等级。在HOMER软件中进行主题和统计分析(补充表30).c、 日期：，GATA2、UTX、ATAC–seq和H3K27ac ChIP–seq的基因组快照Utx公司^+/+和Utx公司^−/−HSPC位于其他2（c） 和蒸汽3位点(d日). 未发现GATA2与动态闭合染色质结合的结肠化和UTX丢失后H3K27ac的丢失，也没有发现GATA2-UTX共结合的证据。相比之下，染色质重塑物SMARCA4和CHD4的结合直接与UTX结合共定位（下两条轨道）。在其他2在UTX丢失后，在未被UTX或染色质重塑物直接结合的区域也可以看到新的染色质。电子UTX结合基因组位点上UTX、SMARCA4和CHD4 ChIP–seq的密度图；维恩图显示了所有UTX、SMARCA4和CHD4 ChIP–seq峰值之间的重叠；P（P）通过Fisher对ChIP的精确测试-序列：UTX与SMARCA4/CHD4。f、，PU.1占位的示意图主要出现在闭合染色质上。克与增强PU.1结合相关的基因重叠Utx公司^−/−)从白血病前期（PL）到急性髓细胞白血病（AML），染色质封闭，基因表达发生变化。对于PU.1 ChIP–seq，n=3只小鼠；ATAC–seq，n=3只小鼠；PL RNA-seq，n=2只小鼠；AML RNA-seq，n=3只小鼠。P（P）通过超几何检验。小时，基因组快照显示PU.1在Utx公司^−/−HSPC发生在拉布11a基因座及其与PL和AML RNA-seq的相关性。拉布11a表达仅在AML进展后增加。

为了进一步探讨UTX依赖性染色质重塑的分子机制，我们分析了BRG1和CHD4在Utx公司^-/-和Utx公司^+/+HSPC。我们过去了Utx公司^{飞行/飞行}；Mx1-芯小鼠案例9-表达小鼠²⁸和诱导Utx公司删除。基因缺失五周后，我们分离出HSPC，并使用CRISPR-Cas9基因组编辑来靶向Smarca4型和变更4，使用空引导RNA（gRNA）构建作为对照。然后我们通过ATAC-Seq分析染色质可及性，假设斯马卡4和/或变更4将至少部分模拟UTX丢失的影响。我们发现1150个网站的可访问性在斯马卡4编辑，只有16个位点的可及性增加，因此表明SMARCA4主要参与特定开放染色质基因座的开放或维持(补充表20). 然后我们将这些站点与不同区域重叠Utx公司^+/+对Utx公司^-/-细胞，使用相同的培养条件（2871个峰；补充表21). 我们发现21%（244/1150）的地区斯马卡4-编辑的单元格与之后关闭的站点重叠Utx公司删除(补充图8a-b). 值得注意的是，当斯马卡4在中编辑Utx公司^-/-单元格(补充表22). 这表明UTX和SMARCA4在染色质可及性方面存在一定程度的功能冗余。通过对这244个位点进行基序分析，我们再次观察到GATA基序的高度富集(补充图8a-b). CHD4的类似分析表明Utx公司损失(补充图8c和补充表23). 这些发现以及我们的蛋白质组数据表明，UTX与SMARCA4相互作用，随后在GATA结合区域保持染色质可及性。

细胞系

293FT（Invitrogen）在补充有10%FBS的DMEM（Invitrogen）中培养。416B细胞在RPMI1640（Invitrogen）、10%FBS中培养。SN12C、KU-19-19、KYSE-180和HCC2998在补充有10%FBS（Invitrogen）的RPMI（Invitrogen）中培养；J82、UM-UC-3和FADU在10%FBS的EMEM（Invitrogen）中培养；CAL-27和VM-CUB-1在DMEM（Invitrogen）、10%FBS中培养。SW684在L15、10%FBS中培养。LB996-RCC在IMDM（Invit罗gen）和10%FBS（Invitorgen）中培养。D-423MG在Gibco Zin-Option（Invitrogen），10%FBS中培养；RPMI和Ham’s F12中的KYSE-270，2%FBS。每个培养基补充1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG，Invitrogen）。AML细胞系：MV4-11、MONO-MAC6和THP1在添加10%FBS和1%PSG的RPMI1640（Invitrogen）中培养。OCI-AML2和OCI-AML3在alpha-MEM（Lonza）、20%FBS和1%PSG中培养。所有癌细胞系均来自桑格研究所肿瘤细胞收集中心。

cDNA合成、PCR和qRT-PCR

根据制造商的说明，使用qScript cDNA SuperMix（Quanta Biosciences）进行cDNA合成。根据制造商的说明，使用REDTaq ReadyMix PCR反应混合物（Sigma）进行PCR。qRT-PCR使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）和Universal Probe Library系统（Roche）进行。TBP管家基因用于数据归一化。qRT–PCR引物序列见补充表27.

蛋白质提取、免疫印迹和共免疫沉淀

细胞在添加有1 mM DTT、蛋白酶抑制剂（Sigma）和磷酸酶抑制剂（Simma）的全细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8，150 mM NaCl，0.1%NP-40和1 mM EDTA）中进行裂解。蛋白质浓度通过Bradford分析（Bio-Rad）进行评估，每条轨道装载等量的蛋白质。装载前，用SDS–PAGE样品缓冲液补充样品，并向每个样品中添加DTT。在10%SDS–PAGE凝胶上分离10–40µg蛋白质，并将其印在聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上。使用以下初级抗体：抗UTX（Bethyl，A302-374A）、抗UTX（GeneTex，GTX121246）和抗IgG（Santa Cruz Biotechnology，sc-2027）；抗α-微管蛋白（Sigma，T6074）或抗肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology，sc-1616）用作负荷控制。研究中使用的二级抗体如下：HRP-连锁驴抗兔抗体（英国GE Healthcare，NA934）和ECL HRP-关联抗鼠抗体（圣克鲁斯生物技术，sc-2005）。使用LumiGLO化学发光基板（KPL，54-61-00）进行可视化。对用细胞裂解缓冲液（如上所述）分离的提取物进行协同免疫沉淀。将2-6μg抗体与20μl Dynabeads Protein g（Thermo Fisher Scientific）结合，并与500-1000μg新提取的蛋白质在4°C下旋转培养1.5小时。用添加蛋白酶抑制剂（Sigma）的IP洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8，150 mM NaCl，0.1%NP-40和1 mM EDTA）洗涤免疫沉淀物四次。然后将带有小球的免疫沉淀样品重新悬浮在1×NuPAGE LDS样品缓冲液（赛默飞世尔科学公司）中，并添加NuPAGE样品还原剂（赛默飞世尔科学）。以下抗体用于免疫沉淀；抗CHD4（Abcam，ab72418）、抗BRG1（Santa Cruz Biotechnology，sc-10768）、抗UTX（Bethyl，A302-374A）和IgG（Santa Cruz Biotechnology，sc-2027）。

小鼠组织的组织学分析

将组织固定在10%甲醛中，然后石蜡包埋。使用0.38 M EDTA pH=7脱钙骨骼。用苏木精和伊红（Thermo Fisher Scientific）对组织切片（4µm）进行染色。采用Bethesda标准对小鼠血液肿瘤进行组织学评估^51,52.

血球计数分析

在VetabC分析仪（Horiba ABX）上进行血液计数测量。

小鼠造血祖细胞的分离

根据制造商的说明，将新鲜分离的骨髓悬浮在红细胞裂解溶液（BD PharmLyse，BD Bioscience）中，然后使用谱系细胞消耗试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号130-090-858）对Lin细胞进行磁珠选择。干细胞生长因子⁺根据制造商的说明，用小鼠CD117 MicroBeads（Miltenyi Biotec，#130-091-224）选择祖细胞。

小鼠造血祖细胞的培养

将小鼠原代细胞培养在补充有5%血清（干细胞技术）、10ng/ml IL3（Peprotech）、10ng/ml IL6（Peprotech）、50ng ml/ml SCF（Peproech）和1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（Gibco）的X-VIVO 20培养基（Lonza）中。

流式细胞仪分析

BM细胞在红细胞裂解缓冲液（0.85%NH4Cl；Sigma）中培养，并用抗小鼠CD16/32（BD Pharmigen，553142）和10%小鼠血清（Sigma M5905）封闭，用于LSK和CLP染色，或仅用10%小鼠血清进行LK染色。使用CD4（BioLegend，100514）、CD5（BioRegend，100 610）、CD8a（Bio联想，100 710）、CD11b（BioLugend，101210）、B220（Bio图例，103210）、TER-119（BioHegend，116210）、GR-1（BioElgend，108410）、SCA-1（BioSgend，122520）、CD117（eBioscience，47-1171）、，CD48（BioLegend，103411）、CD150（BioRegend，115913）、CD34（BD Pharmigen，553733）和FLT3（eBioscience，12-1351）。用以下生物素结合血统标记物进行GMP、MEP和CMP染色：MAC1、GR1、CD3、B220、TER119（BD Pharmigen，559971）、IL7Ra（BioLegend，121103）和链霉亲和素（BioRegend，40520）以及CD34（BD Pharmigen，5503733）、CD16/32（BD Pharmigen）、c-KIT（BioLegend，105812）和SCA-1（Bio联想，122520）。为了检测CLP人群，对细胞进行Flt3（eBioscience，12-1351）、IL7Ra（BioLegend，135008）和谱系生物素结合标记MAC1、GR1、CD3、B220和TER119（BD Pharmigen，559971）以及NK（LSBio，LS）染色-{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C62548”，“term_id”：“2421253”，“term_text”：“C62548”}}62548元)c-KIT（BioLegend，105812）和SCA-1（BioRegend，122520）。分化的BM、脾脏和外周血细胞用CD45（BD Pharmigen，563891）、CD11b（BD Pharmigen，557657）、B220（BioLegend，103210）、GR1（BD Pharmigen（560603）、c-KIT（BioRegend，105812）、TER119（BD Farmigen（557915）和CD3e（eBioscience，12-0031-82）染色。LT-HSC被定义为Lin–c-KIT+SCA1+FLT3–CD48–CD150+CD34–。ST-HSC被定义为Lin–c-KIT+SCA1+FLT3–CD48–CD150+CD34+。MPP定义为Lin–c-KIT+SCA1+FLT3+。LMPP被定义为Lin–c-KIT+SCA1+FLT3hi。CLP定义为Lin–FLT3hiIL7Ra+c-KITloSCA-1lo。GMP定义为Lin–IL7Ra–c-KIT+SCA1–CD34+CD16/32+。CMP定义为Lin–IL7Ra–c-KIT+SCA1–CD34+CD16/32–。MEP被定义为Lin–IL7Ra–c-KIT+SA1–CD34–CD16/32–。使用LSRFortessa仪器（BD）进行流式细胞术分析，并在FlowJo软件中分析数据。

连续重播分析

为了进行重新镀膜分析，在M3434甲基纤维素（干细胞技术）的两个6孔板孔中镀膜50000个骨髓细胞。7天后对菌落进行计数，一周后再次对30000个细胞进行计数，直到没有观察到菌落为止。

增殖试验

10⁴细胞/微孔被镀到96个平板上，并根据制造商的说明，每天使用CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验（Promega）进行生长分析。

质粒和克隆

用于表达FLAG标记版本UTX、UTY、UTX-MT2的质粒购自Addgene（pCS2-UTX-F 24168、pCS2-UTY-F 17439和pCS2-UTX-F-MT2 40619）。慢病毒UTX、UTY、UTX-MT2和FLAG表达载体在pKLV-puro中构建如下。首先，慢病毒主干载体pKLV-U6（Flip）gRNA（BbsI）-PGKpuro2ABFP⁵³用BbsI和KpnI消化以去除U6gRNA（BbsI）-PGKpuro2ABFP盒。采用Gibson克隆（NEB）技术克隆EF1α启动子、UTX/UTY/UTX-MT2/FLAG cDNA和嘌呤霉素（Puro）抗性基因的PCR产物补充表28EF1α启动子是从pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1构建物中进行PCR-扩增的（Clontech，631982）。从pKLV-U6（Flip）gRNA（BbsI）-PGKpuro2ABFP构建物中扩增出Puro抗性基因。吉布森克隆是根据制造商的规范进行的。萤火虫荧光素酶表达质粒（EF1α-GFP-T2A-luciferase）来自System Biosciences（BLIV503-MC-1-SBI）。AML–ETO9a质粒如前所述⁵⁴在CRISPR–Cas9实验中，将gRNA克隆到BbsI消化的pKLV2-U6gRNA（BbsI）PGKpuro2ABFP主干中²⁸研究中使用的gRNAs序列见补充表29.

慢病毒载体的产生和转导

根据制造商的说明，使用ViraPower慢病毒表达系统（Invitrogen）在HEK293细胞中产生慢病毒。病毒上清液在4°C、6000g、16h离心浓缩。在补充有4µg/ml聚brene（Millipore）的培养基中，通过旋转接种（60 min，800 g，32°C）转导细胞，并在37°C下进一步培养过夜。第二天，转导的细胞用嘌呤霉素（1.5ug/ml，Sigma）筛选3天。

移植和体内成像和量化

用慢病毒载体转导MONO-MAC6细胞以表达UTX、UTY、UTX-MT2或FLAG对照，并选择嘌呤霉素4天。然后通过静脉尾注射将0.8×106细胞移植到免疫受损受体小鼠（Il2rg−/−；Rag2−/–）。每组注射5只小鼠。为了进行生物发光检测，向小鼠注射D-荧光素（BioVision；3 mg/20 g腹腔注射），然后用异氟醚麻醉。根据制造商的说明，使用体内成像系统IVIS Lumina II（卡尺）和Living Image 4.3.1版软件（PerkinElmer）对生物发光进行量化。

RNA提取和RNA-Seq分析

根据制造商的说明，使用Arcturus Picopure RNA分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）从HSPC/Lin–BM细胞中提取RNA。用TRIzol试剂（赛默飞世尔科学公司）提取小鼠原发性AML样品的RNA。根据制造商的说明，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取人类细胞系的RNA。使用TruSeq Straded mRNA Sample Prep Kit（Illumina）生成RNA-seq文库，并在Illuminia HiSeq2000 v4平台上用75-bp配对测序进行测序。使用TopHat 2.0.13版对每个文库的RNA-seq读取进行了映射，以对照小鼠基因组构建GRCm38.68，通过Ensembl BioMart数据挖掘工具下载。HiSeq库与以下选项一致：--keep-fasta-order--no-sort-bam-r 100-p 12--library-type fr-firstrand--no-coverage-search--microxon-search--transcriptome-index=GRCm38.known，其中GRCm38.known是在没有输入读取的初始单个TopHat运行中预先准备的GTF格式的转录组索引文件。基因组参考联盟基因组组装（GRCm38.68）中每个基因的原始计数是通过生物导体软件包GenomicAlignments版本1.2.2以“Union”模式获得的。利用生物导体软件包DESeq2（1.6.3版）中的这些计数进行差异表达分析，采用不依赖于BH的过滤方法，FDR为1%；这两个包都是根据他们的小插曲使用的。校正文库大小差异后，在DESeq2中计算表达的折叠变化。

ChIP序列和ChIP qPCR

在原代HSPC细胞上进行ChIP–seq实验。对于组蛋白ChIP–seq，在室温下将细胞固定在1%甲醛（FA，Thermo Fisher Scientific，28906）中5分钟。通过添加甘氨酸（0.125 M，Sigma）停止反应，并在冰镇PBS中清洗细胞。然后用iDeal ChIP–seq组蛋白试剂盒（Diagenode）处理细胞，试剂盒中含有以下蛋白的抗体：H3K4me1（Diagenide，pAb-194-050）、H3K27me3（Abcam，Ab6002）和H3K17ac（Diagende，pAb-196-050）。对于PU.1 ChIP–seq，细胞在室温下用1%的FA固定10分钟，并根据制造商的说明用iDeal ChIP–seq转录因子试剂盒（Diagenode）处理，带有抗PU.1抗体（Santa Cruz Biotechnology，sc-352x）。在HSPC中进行UTX的ChIP–seq。在RT下用2 mM二丁二酰戊二酸二亚胺酯（Sigma）交联细胞30分钟，然后在4°C下用1%FA再次交联30分钟。然后用iDeal ChIP–seq转录因子试剂盒和抗UTX抗体（Bethyl，A302-374A）处理细胞。用于ChIP–qPCR的引物序列列于补充表27.

对于SMARCA4、CHD4和UTX ChIP–qPCR，416B细胞在RT时用2 mM二丁二酰戊二酸（Sigma）交联30分钟，然后在RT时再用1%FA交联10分钟。通过添加125 mM甘氨酸停止交联。将细胞重新悬浮在ChIP裂解缓冲液（1%SDS、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH 8和蛋白酶抑制剂）中，并在Biorruptor Pico仪器（Diagenode）中进行十个周期的超声处理。在改良的RIPA缓冲液（1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸盐、90 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 8和无EDTA蛋白酶抑制剂）中以1:10的比例稀释超声染色质，并与3μg抗SMARCA4（Santa Cruz Biotechnology，sc-10768x）或抗CHD4（Abcam，ab72418）孵育过夜。接下来，将蛋白质A/G（50%A50%G）Dynabeads（Invitrogen）添加到染色质中，并在4°C下培养2 h，然后进行磁性分离。随后，用混合的微孔缓冲液（150 mM NaCl、0.2%SDS、20 mM Tris-Cl、pH 8.0、5 mM EDTA、5.2%蔗糖和1%Triton X-100）、高盐缓冲液（250 mM NaCl、5 mmM Tris-C1、pH 8.0%、0.5 mM EDTA、0.05%脱氧胆酸钠、25 mM HEPES、PH8.0和0.5%Triton X-100%）洗涤珠子两次和LiCl缓冲液（250 mM LiCl、10 mM Tris-Cl、pH 8.0、10 mmM EDTA、0.5%NP-40和0.5%脱氧胆酸钠），然后用洗脱缓冲液（1%SDS和100 mM NaHCO3）进行一次。然后将珠状物重新悬浮在补充有无DNA酶RNase的洗脱缓冲液中（Roche，11119915001）。通过在37°C下孵育30分钟，然后在65°C下过夜，可恢复交联。用芯片DNA纯化试剂盒（Zymo）纯化DNA。

芯片序列、模体分析和GSEA数据可视化

对所有配对末端读数的衔接子序列进行修剪，并用Bowtie2对照mm10参考基因组进行定位（参考文献。55). 所有样本均独立处理，并保留唯一映射的读取。峰值被SICER调用⁵⁶宽峰为W200和G600，窄峰为W200/G200。分别对每个复制执行峰值调用。母题分析和峰用HOMER35注释。HOMER基序分析的详细输出包括在补充表30如果基因间区域的峰值位于TSS的100-kb窗口内，则将其分配给基因。使用DiffBind进行差异绑定分析⁵⁷通过将复制分组在一起。使用床上工具的交叉点进行重叠峰分析⁵⁸.重叠峰的统计分析采用床具中的Fisher精确检验。除PU.1 ChIP–seq外，每个ChIP–seq实验都是在生物复制品中进行的。PU.1 ChIP–seq为生物三份。GSEA工具从The Broad Institute获得⁵⁹.ChIP–seq、RNA-seq和ATAC–seq数据在UCSC基因组浏览器中可视化⁶⁰维恩图是使用BioVenn web应用程序生成的⁶¹。除非另有规定，否则所有图形都是在GraphPad Prism中生成的。

启动子-增强子相互作用分析

在之前的研究中，使用启动子捕获Hi-C（PCHi-C）方法生成了多能干造血祖细胞系7（HPC-7）的启动子相关相互作用矩阵，并使用CHiCAGO软件包对数据进行了分析²³相互作用矩阵的基因组坐标从mm9转换为mm10。总的来说，54339个与启动子诱饵形成显著相互作用（CHiCAGO得分≥5）的区域被定义为启动子相互作用区域（PIR）。差分H3K27Ac峰值Utx公司^-/-对Utx公司^+/+被分组为增加（UP）或减少（DOWN）峰值，并使用床具与PIR相交。在WashU表观基因组浏览器中显示特定基因位点的相互作用。

ATAC公司

ATAC-Seq方法是基于已建立的协议使用的⁶²经过修改⁶³简单地说，在0.3 mL冰镇的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（不含钙和镁）中清洗200000个细胞。然后在300g下离心3分钟，然后再将其重新放入400µL新鲜制作的冰镇蔗糖缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.5，3 mM CaCl₂，2 mM氯化镁₂和0.32 M蔗糖），并在冰上培养12分钟。将10%的Triton®声波风廓线仪X-100添加到0.5%的最终浓度，并在冰上培养6分钟以接近细胞核之前短暂地旋转细胞。再次短暂旋转细胞核，然后在4°C下以300g离心3分钟。移除蔗糖/氚裂解缓冲液，然后立即在50µL Nextera标记主混合液中重新悬浮细胞核颗粒，其中包含25µL 2x标记DNA缓冲液、20µL无核酸酶水和5µL标记DNA酶1（Illumina FC-121-1030）。将标记反应混合物立即转移到1.5 mL低结合微量离心管中，并在37°C下培养30分钟。通过添加500µL缓冲液PB（Qiagen）停止标记反应。根据制造商的说明，使用MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen 28004）纯化标记的染色质，在10µL缓冲液EB（Qiangen）中洗脱。将10µL标记染色质与2.5µL Nextera PCR引物混合物和7.5µL Nextera PCR母料混合物（Illumina FC-121-1030）在0.2 mL低结合PCR管中混合。每个PCR添加2.5µL i5引物和2.5µL i7引物（Illumina FC-121-1011），总计25µL。PCR扩增按如下方式进行：72℃3分钟，98℃30秒，然后进行12个98℃循环10秒，63℃30秒和72℃3 min。在1%琼脂糖TAE凝胶上选择文库大小，收集120 bp至1 kb的文库片段。用MinElute凝胶提取试剂盒（Qiagen 28604）提取凝胶片，在20µL洗脱缓冲液中洗脱。根据制造商的说明，使用Agencourt AMPure XP磁珠（Beckman Coulter A63880）以1.2 AMPure磁珠：1 PCR样品（v/v）的比例进一步纯化样品，在20µL缓冲液EB（Qiagen）中洗脱。测序前，使用高灵敏度DNA芯片（安捷伦科技5067-4626）在安捷伦2100生物分析仪上评估每个ATAC-seq库。

ATAC-序列分析

与ChIP-Seq分析类似，使用Bowtie2根据mm10参考基因组对ATAC-Seq配对末端读取的所有适配器序列进行修剪和映射。所有样本都经过独立处理，并保留了唯一映射的读数。用MACS2调用峰值（参考。64)使用–nomodel和–nolambda参数。对每个复制分别执行峰值调用。使用DiffBind进行差异结合分析⁵⁷通过一起摸索复制。使用床上工具的交叉点进行重叠峰分析⁵⁸使用床具的fisher精确检验对重叠峰进行统计分析。HSPC中的ATAC-Seq以生物三倍体进行，重塑者的ATAC-Sq实验以生物副本进行。

公开数据集的GEO登录代码

数据以加入码从GEO数据库下载{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM552234”，“term_id”：“552234“}}GSM552234型（GATA2）；{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM1296403”，“term_id”：“1296403”}}GSM1296403标准和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM1296404”，“term_id”：“1296404”}}GSM1296404标准（CHD4）；和{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSM1296402”，“term_id”：“1296402”}}GSM1296402标准（SMARCA4）。

MS IP样品的制备

10⁷416B细胞在全细胞裂解缓冲液中进行裂解（50 mM Tris-HCl pH=8，150 mM NaCl，0.1%NP-40，1 mM EDTA），补充有1 mM DTT，蛋白酶抑制剂（Sigma）和磷酸酶抑制剂（Simma）。通过离心使细胞均质并清除裂解液。在全细胞裂解缓冲液中进行UTX免疫沉淀，其中16 ug抗体与100 ul Dynabeads蛋白G（Thermo Fisher Scientific）结合，并在4°C下旋转培养1.5 h。用IP洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl pH=8，150 mM NaCl，0.1%NP-40，1 mM EDTA）洗涤IP五次，补充蛋白酶抑制剂（Sigma）。UTX免疫沉淀物在1x LDS负载缓冲液中煮沸洗脱，用5 mM TCEP还原，用10 mM碘乙酰胺烷基化，并在Novex NuPAGE Bis-Tris 4%–12%凝胶中电泳（Life Technologies）。凝胶用胶体考马斯（Sigma）染色。如前所述，将整个泳道切成切片，并对样品进行MS分析⁶⁵.

样品制备和LC-MS/MS分析

亲和纯化材料在4-12%Bis-Tris NuPAGE凝胶中电泳（Life Technologies）。如前所述，将凝胶固定并用考马斯染色⁶⁵.将整个凝胶层切割成五个部分，并丢弃IgG条带。如前所述，用胰蛋白酶和提取的肽消化凝胶片⁶⁵肽在0.5%甲酸中重新溶解，并在LTQ Orbitrap Velos质谱仪上使用在线纳米液相色谱（Ultimate 3000 RSLCnano系统）串联质谱进行分析。将样品在PepMap C18纳米陷阱（100µm i.d.x 20 mm，100¦Μm，5µm）上脱盐，然后在PepMap RSLC C18柱（75µm i.d.x 250 mm，100µ，2µm，线性梯度4-32%CH）上分离_三CN/0.1%甲酸90分钟。HPLC、色谱柱和质谱仪均来自赛默飞世尔科技公司。Orbitrap质谱仪在标准的“前15位”数据相关采集模式下运行，而预览模式被禁用。MS全扫描设置为m/z 380–1600，m/z 400时分辨率为30000，AGC为1x10⁶最大注入时间为200毫秒。使用445.120030的硅氧烷离子作为锁定质量。动态选择15个最丰富的多电荷前体离子（z≥2），最小信号超过3000计数，用于CID(C类碰撞我诱导的D类解离）离子阱中的碎片，AGC设置为5000，最大注入时间为100毫秒。前驱体隔离宽度设置为2 Da。CID MS/MS的归一化碰撞能量设置为35%。MS/MS所选离子的动态排除持续时间设置为60秒，排除质量宽度为±10 ppm。

MS数据分析

原始MS文件在Proteome Discoverer v 1.4（Thermo Fisher Scientific）中处理。在Mascot（2.5版，Matrix Science）中对老鼠Swiss-Prot数据库（2015年12月，16942序列）进行数据库搜索，并辅以内部污染物数据库。搜索参数如下：胰蛋白酶消化，两次缺失的裂解，前体离子的质量耐受性为10-p.p.m.，片段离子的质量容忍度为0.5-Da，氨基甲酰（C）、N-乙酰化（蛋白质）、甲酰基（N-末端）、氧化（m）、脱酰胺（NQ）和焦-谷氨酸（N-末端Q）的可变修饰。使用Percolator进一步处理数据库搜索结果^66–68蛋白质组发现者。蛋白质鉴定需要至少一个高置信肽（根据q值，FDR<1%）和20分的最低吉祥物蛋白质评分。在SAINTexpress中使用默认设置比较诱饵和对照实验（分别重复两次和三次）的蛋白质列表⁶⁹在进一步数据分析之前，将外部蛋白质污染物（如白蛋白、酪蛋白和角蛋白）从蛋白质识别列表中删除。SAINT概率得分≥0.99的猎物被报告在最终的高置信交互作用物列表中。补体蛋白C1qc被手动从列表中删除，因为尽管SAINT概率为1，但在诱饵和对照样品中检测到的肽数量非常相似(补充表15和16).

外显子组测序

来自7的DNAUtx公司^-/-pIpC介导前从尾尖提取AML病例和匹配正常DNAUtx公司根据制造商的说明，使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）提取缺失。对提取的DNA进行量化（使用Invitrogen的dsDNA Quant-IT PicoGreen），然后将每个样品标准化为4.17ng/ul（120ul），为文库创建做准备。文库制备的第一步包括将DNA剪切成150bp的片段（使用Covaris LC220和Agilent Bravo自动化工作站进行液体处理），然后使用独特的索引标签和适配器创建文库并进行PCR（Agilent的SureSelectXT自动化文库制造和捕获试剂盒和MJ Tetrad）。然后纯化扩增的文库（使用Agencourt AMPure XP和Beckman Coulter Biomek NX96进行液体处理），并在无核酸酶的水中洗脱，然后进行另一轮定量（使用Caliper GX）。然后将量化的、规模选定的文库稀释至适当浓度，以引入外显子组捕获阶段。使用Mouse-All-Exon RNA-baits（由安捷伦设计，供应商编号：S0276129）在65°C下进行23小时的外显子下拉（或杂交）。作为商定的复用策略的一部分，在单个池中诱饵并捕获八个索引唯一的样本。然后使用链霉亲和素涂层的Dynal珠纯化并洗脱下拉物，准备使用PCR（MJ Tetrad）进行扩增。然后使用Agencourt AMPure XP（和Beckman Coulter Biomek NX96用于液体处理）进一步纯化PCR，然后使用安捷伦生物分析仪定量扩增的下拉产物。使用Illumina HiSeq v4流式细胞化学，将样本作为配对的75bp插入物进行外显子序列测定。

外显子数据分析

体细胞变异-点突变和indels-是用Caveman命名的⁷⁰和平德尔^71,72分别对管道和人工制品进行过滤（包括足够的肿瘤分数、链偏倚、正常人中肿瘤等位基因的存在、正常样本组中肿瘤等位基因的存在也在Sanger测序）。使用Control Freek调用全基因组拷贝数变异⁷³软件包。此软件包接受配对的肿瘤/正常序列文件。我们注意到，在我们的一些样本中，测序配对法线在测序深度上显示出人为噪音，并选择使用单个“静态”法线（MD5280a）作为所有样本的恒定比较器。Control Freek使用以下参数运行：步骤=1000000，窗口=5000000，断点类型=4，断点阈值=1.2，读取计数阈值=50。copy-number图显示ControlFreek生成的归一化bam深度比率（黑点），以及标记为CopyNumber=2的区域的标记（红点）。Copy-number variation for a focal change at the exon 3 ofUtx公司使用不匹配的普通MD5280a以及以下参数运行（如前所述）：step=250，window=500，breakpointthreshold=0.6，breakpointtype=4，readcountthreshold=50。

本研究主要由B.J.P.H.和G.S.V.的联合血液透析项目拨款（17006）资助。B.J.P.H实验室的工作也由ERC整合者奖（拨款647685 COMAL）、英国癌症研究计划奖、医学研究委员会（MRC）、威康信托（WT）和剑桥NIHR BRC资助。我们感谢WT/MRC中心的拨款（097922/Z/11/Z）以及WT战略奖100140的支持。G.S.V.由英国癌症研究高级癌症研究奖学金（C22324/A23015）资助。G.S.V.实验室还得到了Kay Kendall白血病基金和桑格研究所（WT098051）的核心资助。