生物化学杂志。作者手稿；PMC 2009年8月20日提供。
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美国国立卫生研究院：尼姆斯23462
PTIP与含MLL3和MLL4的组蛋白H3赖氨酸4甲基转移酶复合物的相关性*…◆
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Young-Wook Cho（音）
†马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK临床内分泌科核受体生物学科20892
特蕾莎·洪
§加利福尼亚州杜阿尔特市免疫科希望之城贝克曼研究所，邮编：91010
孙华红
†马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK临床内分泌科核受体生物学科20892
洪国
†马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK临床内分泌科核受体生物学科20892
洪宇
†美国国立卫生研究院临床内分泌学分院核受体生物学科，马里兰州贝塞斯达，邮编20892
Doyeob Kim先生
¶密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48109
塔德·古斯琴斯基
∥马里兰州弗雷德里克国立卫生研究院NCI-Frederick蛋白质动力学和信号实验室，邮编：21702
格雷戈里·德雷斯勒
¶密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48109
特里·科普兰
∥美国国立卫生研究院弗雷德里克国家癌症研究所蛋白质动力学和信号实验室，马里兰州弗雷德里克21702
马库斯·卡尔库姆
§加利福尼亚州杜阿尔特市免疫科希望之城贝克曼研究所，邮编：91010
Kai Ge公司
†马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK临床内分泌科核受体生物学科20892
†马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK临床内分泌科核受体生物学科20892
§加利福尼亚州杜阿尔特市免疫科希望之城贝克曼研究所，邮编：91010
¶密歇根大学病理学系，密歇根州安阿伯48109
∥马里兰州弗雷德里克国立卫生研究院NCI-Frederick蛋白质动力学和信号实验室，邮编：21702
1这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2通信地址：马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK临床内分泌科核受体生物学科，邮编：20892。电话：301-451-1998；传真：301-480-1021；电子邮件：vog.hin.kddin@giak公司. - 补充资料
补充数据。
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摘要
PTIP是一种具有串联BRCT结构域的蛋白质，与DNA损伤反应有关。然而，其正常细胞功能尚不清楚。在这里，我们发现，虽然异位表达的PTIP能够与包括53BP1在内的DNA损伤反应蛋白相互作用，但内源性PTIP和新蛋白PA1都是Set1样组蛋白甲基转移酶（HMT）复合物的成分，该复合物也包含ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、NCOA6、含有SET结构域的HMT MLL3和MLL4，和含有JmjC结构域的假定组蛋白脱甲基酶UTX的亚化学计量量。PTIP复合物具有强大的HMT活性，特别是在组蛋白H3上甲基化赖氨酸4（K4）。此外，PA1直接结合PTIP，并需要PTIP与复合物的其余部分进行交互。此外，我们证明hDPY-30直接与ASH2L结合。进化上保守的hDPY-30、ASH2L、RBBP5和WDR5可能构成一个由所有人类Set1-like HMT复合物共享的亚复合物。相反，PTIP、PA1和UTX与PTIP复合体特别相关。因此，在没有DNA损伤剂处理的细胞中，内源性PTIP与具有独特亚基组成的Set1样HMT复合物结合。由于组蛋白H3 K4甲基化与活性基因相关，我们的研究表明PTIP在基因表达调控中具有潜在作用。
染色质水平的转录调控需要多个染色质重塑复合物和组蛋白修饰复合物的协同作用。组蛋白的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，已被证明在全局、组织和发育阶段特异性基因表达的调节中发挥重要作用。组蛋白赖氨酸甲基化涉及基因激活和抑制，取决于甲基化的特定赖氨酸残基。例如，组蛋白H3赖氨酸27的甲基化与基因阻遏有关，而组蛋白H3赖氨酸4（K4）的二甲基化和三甲基化则与基因激活有关(1,2).
在酵母中，含有果蝇已经证明，三联体相关蛋白Set1负责组蛋白H3 K4的单甲基化、双甲基化和三甲基化(三-7). 在人类中，已分离出多个具有强健组蛋白H3 K4甲基转移酶活性的类Set1复合物(8). 每个复合物都包含一个或两个含有SET结构域的酵母同源物Set1和果蝇三胸，如hSet1（人类Set1）(9)，MLL（混合谱系白血病，也称为MLL1、HRX、ALL1）(10-13)，MLL2（混合型白血病2）(8,10,14-17)、MLL3（混合白血病3）和MLL4（混合白血病4，也称为ALR）(15,18,19)，具有相关复合物的酶活性。ASH2L、RBBP5和WDR5分别是酵母COMPASS/Set1复合亚基Bre2、Swd1和Swd3的同源物，由各种人类类Set1组蛋白甲基转移酶（HMT）共享三复合物。此外，每个复合物都包含不同但重叠的亚单位(8,10). 例如，hSwd2和CXXC1是酵母COMPASS/Set1复合物的Swd2亚基和Spp1亚基的同源物，并且已经证明与hSet1复合物相关(20). Menin是一种与任何酵母COMPASS/Set1复合物成分都没有同源性的蛋白质，已证明在MLL和MLL2复合物中都存在(8,10). MLL和MLL2复合物已被证明可以调节转录活性基因子集的表达，包括聚集基因同源盒(霍克斯)基因(8,10,15,21).
PTIP（Pax transactivation domain-interacting protein）是一种广泛表达的核蛋白，通过酵母双杂交分析首次鉴定为Pax2反式激活域相互作用蛋白(22). PTIP携带六个串联BRCT（BRCA1羧基末端）结构域，这些结构域主要存在于参与DNA损伤反应的蛋白质中(). 由于广泛的细胞死亡，小鼠PTIP的缺失导致E9.5早期胚胎死亡(23).体外PTIP中的串联BRCT域作为磷酸肽结合模块发挥作用，识别由DNA损伤激活的共济失调毛细血管扩张-突变（ATM）和共济失调-毛细血管扩张和RAD3-相关（ATR）蛋白激酶磷酸化的底物。电离辐射后，体外表达的PTIP与DNA损伤检查点蛋白53BP1的相关性显著增加，易位到DNA损伤诱导的病灶，并与磷酸化组蛋白H2AX（DNA双链断裂的标记物）共定位(24,25). 然而，未经DNA损伤剂处理的细胞内内源性PTIP的功能尚不清楚。
外源表达的PTIP与细胞中两组功能不同的蛋白质相关A类，包含1056个氨基酸的全长小鼠PTIP蛋白的示意图。六个BRCT结构域标记在红色富含谷氨酰胺（富含Q）的区域用蓝色标记。B类亲和纯化PTIP相关蛋白的银染。稳定表达FLAG标记PTIP的HeLaS细胞核提取物(F-PTIP)或仅矢量(Vec公司)与抗FLAG M2-糖孵育。经过大量洗涤后，结合的蛋白质在4-15%SDS-PAGE上解析，并按照“实验程序”中的描述通过质谱分析进行分析IP（IP），免疫沉淀。米，蛋白质标记物。C类Western blot确认质谱结果。纯化的PTIP相关蛋白B类通过Western blot分析，抗体显示在正确的.
为了了解PTIP的正常细胞功能，我们从没有DNA损伤剂处理的HeLaS细胞制备的核提取物中亲和纯化了PTIP相关蛋白。质谱分析和随后的纯化表明，PTIP与ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、NCOA6、新蛋白PA1、SET结构域组蛋白甲基转移酶MLL3和MLL4、，以及具有强健组蛋白H3赖氨酸4（K4）甲基转移酶活性的类Set1复合物中含有JmjC结构域的假定组蛋白去甲基化酶UTX的亚化学计量量。
实验程序
抗体
生成兔抗MLL3、抗MLL4、抗PA1和抗WDR5抗体，并用以下肽进行亲和纯化：DKRPRGRPRKDGASPFQ和TDKIKKRYRKRKNKLEET（分别为人类MLL3残基33-49和小鼠MLL3残留基1334-1351），FVHSKSSQYRRLRTEWKN和EGDEKKKQQRRGRKRSKL（人类MLL4残基分别为5105–5122和1472–1489）、RSQKREARLDKVLSD（人类PA1残基193–207）和MATEEKKPETEAARAQP（人类WDR5残基1–17）。针对GST融合小鼠PTIP残基1–316产生兔抗PTIP抗体(22)并用蛋白A-琼脂糖纯化。小鼠IgG（目录号sc-2025）、抗BAF170（sc-10757）和抗-α-微管蛋白（sc-5286）来自圣克鲁斯生物技术公司。兔IgG（I-5006）、抗FLAG（F3165）和抗FLAG M2-糖（A2220）来自Sigma。抗-53BP1（A300-272A）、抗美宁（A300-105A）、抗人NCOA6（A300-410A）、抗血清ASH2L（A300-107A）、反RBBP5（A300-109A）和抗hSet1（A300–289A）均来自贝塞尔实验室。抗MLL-COOH末端（05-765）来自Upstate Biotechnology。抗-MRE11（GTX70212）和抗RAD50（GTX700228）来自GeneTex。抗-NBS1（611870）和抗CXXC1（612334）来自BD Biosciences。
细胞培养与逆转录病毒介导的基因转移
所有细胞均常规培养于Dulbecco改良Eagle's培养基加10%胎牛血清中。主要巴基斯坦国家石油公司flox/flox公司从PTIP条件敲除小鼠E13.5胚胎中分离出MEF(26)并按照3T3方案转染表达SV40T的pcDNA3使其永生化(27). 如前所述，对永生化MEF进行逆转录病毒感染(28). 通过逆转录病毒介导的基因转移建立稳定表达FLAG标记全长小鼠PTIP、人PA1和hDPY-30（分别为F-PTIP、F-PA1和F-hDPY-30）的HeLaS细胞。简单地说，凤凰双嗜性逆转录病毒包装细胞以1.1×10的密度接种6每6厘米培养皿4毫升培养基中的细胞。隔夜培养后，细胞被转染8μg pWZLneo-based质粒，使用lipofectAmine2000（Invitrogen）。48h后，将细胞换成新鲜培养基。12 h后收集含病毒上清液，通过0.45 mm滤膜过滤，并补充8μg/ml聚乙烯，并添加到以3.5×10密度电镀的HeLaS细胞中5每6厘米培养皿培养1天。两天后，在含有1 mg/ml G418（Invitrogen）的培养基中连续稀释细胞。14天后，菌落扩大，用抗FLAG抗体的Western blot鉴定那些表达FLAG标记PTIP的菌落。
PTIP HMT复合物的纯化
表达FLAG-标记PTIP或仅表达载体的HeLaS细胞在含有8%牛血清和2%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中于200×15 cm培养皿上生长汇合。为了分离PTIP相关蛋白，按照说明制备300 mg核提取物(28)用0.6 ml小鼠IgG-琼脂糖（Sigma）在缓冲液A（20 m）中预分离2 h米HEPES（pH 7.9），180米米氯化钾，0.2米米EGTA，1.5米米氯化镁2，20%甘油，1米米二硫苏糖醇，0.5 m米苯甲基磺酰氟和0.1%Nonide P-40）补充1μg/ml抑肽酶，2μg/ml leupeptin和0.7μg/ml胃蛋白酶抑制素（Roche Applied Science），然后在4°C下用0.5ml抗FLAG M2-糖过夜免疫沉淀。在用缓冲液A洗涤12次后，用0.25 mg/ml FLAG肽（Sigma）洗脱结合蛋白两次，用微克隆柱（Millipore）浓缩，在4–15%SDS-PAGE（Bio-Rad）上解析，并用质谱法分析。为了纯化PTIP-HMT复合物，使用二琥珀酸二亚胺酯（Pierce）将抗RBBP5抗体交联到蛋白A-琼脂糖（Amersham Biosciences）。如上所述纯化的PTIP相关蛋白与固定化抗RBBP5在4°C下培养过夜。用含300m的缓冲液A冲洗后米KCl五次，结合蛋白用100 m洗脱两次米三乙胺（pH 11.5）10分钟，用1米Tris（pH 7.5），用微子柱浓缩，并在4–15%SDS-PAGE上溶解。为了一步纯化PTIP HMT复合物，用小鼠IgG-琼脂糖在缓冲液A中两次预处理由表达FLAG-标记PA1的HeLaS细胞制备的核提取物，然后在4°C下用抗FLAG M2-琼脂糖进行过夜免疫沉淀。用缓冲液A大量洗涤后，用0.25 mg/ml FLAG肽洗脱结合蛋白两次。
质谱蛋白质鉴定
为了进行质谱蛋白质鉴定，将切下的凝胶条带放置在V形96-well微量滴定板（Greiner）中，底部采用针刺，并在Proteam 100 Genesis液体处理系统（Tecan）上进行机器人处理。机器人程序包括在50%乙腈中进行凝胶脱色，100 m米碳酸氢铵，蛋白质减少10米米三（羧乙基膦）（皮尔斯），50 m米碳酸氢铵，与碘乙酰胺烷基化，并在37°C下用牛胰蛋白酶（罗氏应用科学）消化8小时。凝胶释放的肽被捕获在Poros 20 R 2珠（应用生物系统）上，转移到ZipTips（Millipore）中，用作熔块，然后用60%乙腈洗脱到不锈钢样品板上，20%甲醇，0.1%三氟乙酸水溶液中，与MALDI基质共结晶α-氰基-4-羟基肉桂酸。在Protof2000 MALDI-四极飞行时间仪器（PerkinElmer/Siex）上进行了单级质谱分析，并在自建的MALDI--四极离子阱上获得了多级质谱裂解光谱，如前所述(29). 使用Xproteo、Profound和TheGPM X！通过数据库搜索分析光谱！串联。
协同免疫沉淀、Western Blot和GST下拉试验
对于联合免疫沉淀，1-5 mg HeLaS核提取物与2-5孵育μg抗体。用缓冲液A洗涤沉淀五次。Western blot和GST下拉在体外翻译的蛋白质基本上按照描述进行(28).
HMT测定和Edman降解
如前所述，进行HMT分析和Edman降解以绘制组蛋白H3上的甲基化位点(8).
结果
PTIP相关蛋白的亲和纯化
为了了解PTIP的正常细胞功能，我们试图从没有DNA损伤剂处理的培养细胞中分离PTIP相关蛋白。为此，利用逆转录病毒介导的基因转移建立了稳定表达FLAG标记全长小鼠PTIP（F-PTIP）的HeLaS细胞系。制备核提取物，并与抗FLAG M2-糖孵育。大量洗涤后，用FLAG肽洗脱结合蛋白，并在4–15%SDS-PAGE上进行解析，然后进行质谱分析(和补充表S1). 与之前关于PTIP和53BP1之间相互作用的报告一致(25)，一个大于250kDa的高分子质量带被鉴定为53BP1。一条159-kDa带被鉴定为BLM（Bloom Syndrome蛋白），这是一种RecQ家族DNA解旋酶，已被证明与53BP1相关以应对DNA损伤(30). 此外，两条带被鉴定为MRE11和RAD50，这两条带是MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物的组成部分，在DNA损伤检测和修复中起关键作用(31). 质谱结果经Western blot分析证实(,底部面板).
令人惊讶的是，剩下的乐队()被鉴定为ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、SET域组蛋白甲基转移酶MLL3和MLL4，以及NCOA6（核受体辅激活子6，也称为NRC/AIB3/ASC-2/PRIP/TRBP/RAP250(32))，据报道为各种Set1-like HMT复合物亚单位的蛋白质(8-10,33,34). 此外，一条42-kDa带被鉴定为一种新的蛋白质，我们将其命名为PA1(P（P）提示-一有关联的1). 产生了针对PA1、WDR5、MLL3和MLL4的多克隆抗体。使用可用抗体的Western blot证实质谱结果(,顶部面板). 综上所述，我们的亲和纯化导致鉴定了两组功能不同的蛋白质，它们与细胞核中外源性表达的PTIP相关：那些参与DNA损伤反应和修复的蛋白质（53BP1、BLM、MRE11、RAD50和NBS1）以及那些通过组蛋白H3 K4（ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、NCOA6、MLL3和MLL4）上的染色质甲基化参与基因表达调控的人。
PTIP联合公司与ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、NCOA6、MLL3、MLL4和PA1合一综合体
上述分离的PTIP相关蛋白被调整为含有300 m米KCl并在Superose 6凝胶过滤柱上分馏，然后进行Western blot分析。如所示底部面板，部分PTIP在高分子质量分数中与两组PTIP相关蛋白共同洗脱，在～1.8 MDa分数处达到峰值。与ASH2L和RBBP5的存在一致，这些含PTIP的高分子量组分与未修饰组蛋白H3肽上的强健HMT活性相关(,顶部面板). 这些数据表明PTIP和相关蛋白可能会形成具有HMT活性的高分子量蛋白质复合物。
PTIP与ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、NCOA6、MLL3、MLL4和PA1联合在一起A类，PTIP存在于与HMT活性相关的高分子量复合物中。PTIP相关蛋白的分离在Superose 6凝胶过滤柱（Amersham Biosciences）上，在含有300 m米KCl公司。通过Western blot分析分数，并在左侧显示抗体(下部面板)并通过HMT分析未修饰组蛋白H3肽（残基1–20）(上部面板). 蛋白质标准的位置在底部注意，仅通过凝胶过滤纯化的PTIP蛋白不具有任何HMT活性。B类，两组功能不同的PTIP相关蛋白不存在于同一复合物中。纯化的PTIP相关蛋白用抗53BP1或抗RBBP5抗体进行免疫完善，然后用右图所示抗体进行Western blot。没有抗体，就没有抗体。C类PTIP复合物的纯化。PTIP相关蛋白的分离与固定化抗RBBP5抗体在4℃孵育过夜。用含有300m的缓冲液A洗涤后米用100 m洗脱KCl结合蛋白米三乙胺（pH 11.5），用1中和米Tris（pH 7.5），用微子柱浓缩，在4–15%SDS-PAGE上溶解，并用银染色。通过质谱和/或Western blot证实了蛋白质的特性。PTIP.com网站，PTIP复合体。IgG重链(IgG H)和轻链(IgG L)标有星号.
为了确定两组功能不同的PTIP相关蛋白是否共存于一个复合物中，用抗53BP1或抗RBBP5抗体对PTIP相关蛋白质进行免疫完善。如所示抗RBBP5抗体几乎完全耗尽RBBP5、ASH2L、MLL3和NCOA6，而对53BP1水平的影响最小。相反，抗53BP1抗体耗尽53BP1而不影响RBBP5、ASH2L、MLL3和NCOA6的水平，这表明PTIP相关蛋白的两个功能不同的组在同一复合物中并不共存。抗53BP1抗体和抗RBBP5抗体都不能显著减少过度表达的PTIP，因为凝胶过滤显示大多数PTIP以单体或低聚物的形式存在(). 虽然DNA损伤反应和修复蛋白如何与PTIP相关尚待确定，但凝胶过滤和免疫完成实验的数据强烈表明，PTIP与RBBP5、ASH2L、MLL3和NCOA6在一个高分子量复合物中相关。
为了纯化与HMT活性相关的PTIP复合物，通过F-PTIP分离PTIP相关蛋白，如与固定化抗RBBP5抗体孵育。用含有300 m的缓冲液A进行大量清洗后米用100 m洗脱KCl结合蛋白米三乙胺（pH 11.5）并在SDS-PAGE上溶解(). 银染显示了几个显著的条带，其迁移的分子量与MLL4（～520–540 kDa）、MLL3（～520-540 kDa通过质谱和/或Western blotting（数据未显示）确认每个显著条带中的蛋白质的身份。与免疫完成结果一致()抗RBBP5抗体未沉淀出可检测到的53BP1（～300kDa）。因此，PTIP与ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30、NCOA6、MLL3、MLL4和PA1在一个复合物中结合。
利用标记的PA1一步法纯化PTIP复合物
人类PA1（GenBank™登录号{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”EF195235“，”term_id“：”123187074“}}EF195235型)含有254个氨基酸，没有可识别的保守结构域(). 小鼠PA1蛋白（GenBank™登录号{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“AAH03932”，“term_id”：“13278178”}}AAH03932型)含有253个氨基酸，在氨基酸水平上与人类同源基因具有87%的同源性。PA1蛋白的理论分子质量为28kDa。可能是由于其相对较低的pI（等电点）为4.4，PA1蛋白在SDS-PAGE上以约42kDa的速度运行（图。,、和). 当体外表达于HeLa细胞时，PA1定位于细胞核（数据未显示）。在GST下拉分析中，GST-fused PA1与在体外翻译后的PTIP，但不包括ASH2L、RBBP5、WDR5和NCOA6().
利用FLAG-tagged PA1一步纯化PTIP复合物A类，新人类蛋白PA1的氨基酸序列。图例中描述的通过PTIP相关蛋白的质谱分析鉴定的肽序列是下划线的.B类，PA1直接绑定到PTIP。GST或GST-PA1与在体外翻译[35S] GST下拉分析中蛋氨酸标记的PTIP、ASH2L、RBBP5、WDR5和NCOA6。C类，通过FLAG标记的PA1一步纯化PTIP复合物。表达FLAG标记PA1的HeLaS细胞制备的核提取物(F-PA1型)或仅矢量(Vec公司)与抗FLAG M2-糖孵育。大量洗涤后，结合蛋白在4–15%SDS-PAGE上溶解，然后进行银染色(右侧面板)或使用锌染色和去污试剂盒（Bio-Read）染色(左侧面板). 通过质谱分析确定蛋白质的身份。匹配的胰蛋白酶肽的数量如所示圆括号。与UTX匹配的胰蛋白酶肽的序列和位置列于右侧银色凝胶。注意，含有MLL3和MLL4的～540-kDa条带可以被锌而不是银很好地染色。D类，PA1需要PTIP与其余PTIP复合体进行交互。SV40T永生化巴基斯坦国家石油公司条件敲除MEF细胞系巴基斯坦国家石油公司flox/flox公司感染了表达F-PA1的逆转录病毒载体pMSCVhygro。用潮霉素筛选后，随后用逆转录病毒pMSCVpuro表达载体感染细胞(Vec公司)或Cre重组酶删除巴基斯坦国家石油公司基因。用嘌呤霉素筛选后，细胞扩增，制备核提取物，并用抗FLAG M2-糖进行免疫沉淀。免疫沉淀物通过Western blot分析，抗体显示在左边.
PA1和PTIP之间的直接相互作用促使我们测试是否也可以通过PA1纯化PTIP复合物。为此，采用逆转录病毒基因转移方法建立了稳定表达FLAG-tagged PA1（F-PA1）的HeLaS细胞系。制备核提取物，并使用抗FLAG M2琼脂糖进行免疫沉淀。在大量洗涤后，用FLAG肽洗脱结合蛋白，浓缩并在4–15%SDS-PAGE上解析。SDS-PAGE凝胶分别用银染色法和不太敏感的锌染色法染色，因为200 kDa以上的高分子量蛋白带用银染色方法染色不好（与之相比左面板与右面板在里面). 质谱分析显示，F-PA1可拉下整个PTIP复合物，包括SET结构域组蛋白甲基转移酶MLL3和MLL4、NCOA6、PTIP、ASH2L、RBBP5、WDR5和hDPY-30(和数据未显示）。因此，PTIP复合物可以通过FLAG-标记的PA1在一步纯化中分离出来。
为了了解PA1如何与PTIP复合体相互作用，SV40T-不朽巴基斯坦国家石油公司条件敲除小鼠胚胎成纤维细胞系巴基斯坦国家石油公司flox/flox公司感染了表达F-PA1的逆转录病毒载体pMSCVhygro。用潮霉素筛选后，随后用表达Cre重组酶的逆转录病毒pMSCVpuro感染细胞以删除巴基斯坦国家石油公司基因。用嘌呤霉素筛选后，细胞扩增，制备核提取物，并用抗FLAG M2-糖进行免疫沉淀，然后进行Western blot分析。如所示，Cre表达消除了PTIP表达巴基斯坦国家石油公司flox/flox公司细胞。F-PA1无法从巴基斯坦国家石油公司基因缺失细胞，表明PA1需要PTIP与复合物的其余部分相互作用。
有趣的是，通过F-PA1分离的PTIP复合物的质谱分析还鉴定出9个肽与UTX的蛋白质序列相匹配，UTX是一种JmjC结构域假定的组蛋白去甲基化酶(35) (). 从HeLaS细胞分离的PTIP复合体中UTX存在于亚化学计量水平，可能是因为HeLaS中UTX表达水平相对较低，仅为定量逆转录酶PCR测定的293细胞中UTX的9.6%。通过Western blot分析证实UTX和PTIP复合物之间的特异性关联().
PA1和含有JmjC结构域的假定组蛋白去甲基化酶UTX与PTIP复合物特异性相关A类，通过F-PA1分离的PTIP复合物亚单位组成的Western blot表征。从稳定表达F-PA1的HeLaS细胞制备的核提取物与抗FLAG M2-糖孵育。免疫沉淀物使用左侧所示抗体通过Western blot进行分析。B类，从表达FLAG标记UTX的HeLaS细胞制备的核提取物(F-UTX公司)与抗FLAG M2-糖孵育。通过Western blot分析免疫沉淀物对不同亚基（hSet1、Menin和PTIP）或各种人类Set1样复合物的共享RBBP5亚基的影响。
在未经DNA损伤剂处理的细胞中，内源性PTIP与DNA损伤反应蛋白不相关
内源性PTIP复合物亚单位之间的相互作用通过使用针对选定PTIP复合成分的抗体从HeLaS核提取物中进行相互免疫沉淀得到证实(). 抗-PTIP抗体容易沉淀内源性ASH2L、RBBP5和NCOA6(,车道3). 相反，抗ASH2L、RBBP5、WDR5、PA1、NCOA6和含有SET结构域的MLL3和MLL4的抗体有效地降低了内源性PTIP(,车道4–6,). 相反，相互联合免疫沉淀未能检测到PTIP复合亚单位（PTIP、ASH2L、RBBP5和NCOA6）与DNA损伤反应蛋白（53BP1、MRE11和RAD50）之间的内源性相互作用(,3–9车道). 这些数据表明，至少在未经DNA损伤剂处理的正常条件下培养的细胞中，内源性PTIP与DNA损伤反应蛋白没有显著关联。然而，这些数据并不排除在用DNA损伤剂处理的细胞中，内源性PTIP和PTIP复合体的潜在其他亚单位可能与DNA损伤反应和修复蛋白（包括53BP1）相互作用的可能性。事实上，最近的一份报告描述了电离辐射后内源性PTIP和53BP1之间增加的联系(24).
在未经DNA损伤剂处理的细胞中，内源性PTIP复合物成分与53BP1和其他DNA损伤反应蛋白无关A类用1 mg HeLaS核提取物培养兔IgG（作为对照）、抗PTIP、ASH2L、RBBP5、NCOA6、53BP1、MRE11和RAD50抗体。免疫沉淀物用左侧所示抗体进行Western blot。B-D公司，PTIP复合物成分之间的内源性相互作用。实验按照描述进行A类.
与我们的观察一致，内源性PTIP与未经DNA损伤剂处理的细胞中的DNA损伤反应蛋白无关，使用FLAG标记的PA1分离的PTIP复合物不包含大量53BP1和其他DNA损伤反应蛋白质(和,底部面板).
K4上的PTIP复合物甲基化组蛋白H3
使用组蛋白H3或核心组蛋白作为底物，在HMT分析中分析纯化的PTIP复合物。如所示，PTIP复合物在分离形式和核心组蛋白上下文中有效地甲基化组蛋白H3。相反，仅通过凝胶过滤纯化的PTIP蛋白不具有任何HMT活性(). 为了确定组蛋白H3中的哪个残基被甲基化，在PTIP复合物的HMT分析中对重组组蛋白H三进行放射标记，然后进行40个周期的Edman降解和闪烁计数。如所示，PTIP复合物在组蛋白H3上特异性甲基化K4。与此结果一致，PTIP复合物可以甲基化未修饰的组蛋白H3肽，但不能甲基化K4上的三甲基化组蛋白或K4突变为精氨酸的组蛋白（数据未显示）。此外，HeLaS核提取物中抗PTIP、ASH2L和RBBP5抗体产生的免疫沉淀物具有较强的HMT活性，表明内源性PTIP复合物与HMT活性强健相关(). 同样，PA1与细胞中HMT活性的强健有关(). 综上所述，这些数据表明PTIP复合物是一种Set1-like HMT复合物，具有强大的组蛋白H3 K4甲基转移酶活性在体外和细胞内。
K4上的PTIP复合物甲基化组蛋白H3A类，PTIP复合物甲基化组蛋白H3。表达F-PTIP的HeLaS细胞核提取物中抗FLAG M2-糖免疫沉淀蛋白(左侧面板)或F-PA1(右侧面板)以重组组蛋白H3或核心组蛋白为底物进行HMT分析。在SDS-PAGE上分离测定产物，用考马斯蓝染色，然后进行荧光分析。B类，PTIP复合物甲基化K4上的组蛋白H3。四个μg组蛋白H3甲基化A类进行了40次Edman降解和闪烁计数。组蛋白H3残基的位置在底部.C类，内源性PTIP复合体亚基与HMT活性强健相关。HeLaS核提取物与所示抗体进行免疫沉淀。对免疫沉淀物进行未修饰组蛋白H3肽（残基1-20）的HMT测定。D类用表达F-PA1或载体的HeLaS细胞制备的核提取物用抗FLAG M2-糖免疫沉淀，然后进行HMT分析。E类，相关HMT复合物的酶活性不需要PTIP。SV40T永生化巴基斯坦国家石油公司flox/flox公司MEF细胞系感染逆转录病毒表达载体(Vec公司)或Cre删除巴基斯坦国家石油公司基因。制备核提取物，并用所示抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物对未修饰组蛋白H3肽（残基1–20）进行HMT分析(左侧面板)和Western blot分析(右侧面板).
为了研究相关的含有MLL3/MLL4的HMT复合物的酶活性是否需要PTIP，使用抗MLL3抗体从野生型或PTIP缺陷细胞制备的核提取物中免疫沉淀。免疫沉淀物经HMT分析和Western blot分析。如所示，相关HMT复合物的组蛋白H3甲基转移酶活性不需要PTIP。抗-MLL3抗体仍能降低内源性RBBP5和WDR5，表明PTIP缺陷细胞中剩余的复合物基本上完好无损。使用抗MLL4抗体时也获得了类似的结果（数据未显示）。这种观察结果与以下事实一致，即该复合物只有MLL3和MLL4亚单位包含催化SET结构域，该结构域已被证明对几乎所有组蛋白赖氨酸甲基转移酶都具有酶活性，包括酵母Set1和人类MLL和MLL3(4,13,33).
PTIP HMT复合体具有独特的亚单位组成
除了共享亚基ASH2L、RBBP5和WDR5，以及独特的含SET结构域的酶亚基外，每个人类Set1-like HMT复合物都包含不同的亚基() (8,10). 通过Western blot分析检测PTIP HMT复合物的亚基组成(和). MLL、梅宁、hSet1、CXXC1、，α-微管蛋白和BAF170是相应的人类Set1-like HMT复合物的独特亚单位(8-10,33,34). 然而，它们都与PTIP或PA1无关（图。和,中间面板)，表明PTIP和PA1是PTIP HMT复合体所特有的。这种结果也与F-PTIP和F-PA1相关蛋白的质谱分析中缺少MLL、Menin、hSet1和CXXC1的匹配肽相一致(补充表S1和数据未显示）。
表1
人Set1-样组蛋白H3 K4甲基转移酶复合物的亚单位组成
酵母
COMPASS/Set1（罗盘/设置1）
复杂的 | 人类Set1样组蛋白H3 K4
甲基转移酶复合物
|
|---|
h设置1
复杂的 | MLL公司
复杂的 | MLL2级
复杂的 | MLL3/MLL4
复杂的 |
|---|
| 集合1 | h设置1 | MLL公司 | 百万分之二 | MLL3/MLL4 |
| 布雷2 | 灰2升 | 灰2升 | 灰2升 | 灰2升 |
| 瑞士1 | RBBP5型 | RBBP5型 | RBBP5型 | RBBP5型 |
| 瑞士盾3 | 西部数据5 | 西部数据5 | 西部数据5 | 西部数据5 |
| Sdc1公司 | hDPY-30型 | hDPY-30型 | hDPY-30型 | hDPY-30型 |
| 瑞士2 | h开关2 | | | |
| Spp1型 | CXXC1系列 | | | |
| HCF1型 | 梅宁 | 梅宁 | 巴基斯坦国家石油公司 |
| | HCF1/HCF2 | | PA1公司 |
| | | | NCOA6公司 |
| | | | UTX公司 |
通过F-PA1相关蛋白的质谱分析证实UTX和PTIP复合物之间的相互作用()为了确定UTX是否也存在于其他Set1-like HMT复合物中，使用逆转录病毒基因转移方法建立了表达FLAG-tagged UTX的HeLaS细胞系。制备核提取物，并使用抗FLAG M2-糖进行免疫沉淀，然后进行Western blot分析。如所示，UTX与PTIP特别相关，但与hSet1和Menin无关，这表明UTX是PTIP复合体所特有的(). 综上所述，我们的数据表明PTIP复合物不同于任何先前报道的Set1-like HMT复合物，并且具有独特的亚基组成。
hDPY-30直接结合ASH2L是所有类人Set1 HMT复合物的共同亚单位
为了研究PTIP-HMT复合物成分之间的蛋白-蛋白质相互作用，GST下拉分析通过将GST融合的ASH2L、RBBP5、WDR5和hDPY-30与在体外PTIP HMT复合物的翻译选择亚单位(). 以前已经证明ASH2L、RBBP5和WDR5构成一个亚复合物，直接与MLL复合物中酶亚单位MLL的SET域COOH末端片段结合(13). 我们证实了ASH2L、RBBP5和WDR5之间的直接相互作用，发现WDR5直接与MLL3（3993–4911个氨基酸）和MLL4（4289–5262个氨基酸）的COOH末端SET结构域片段结合。此外，发现WDR5与MLL3上的FYRN和FYRC域控制区域相互作用().
hDPY-30直接与ASH2L结合，并被所有人类Set1样复合物共享A类，hDPY-30直接与ASH2L结合。为了表征PTIP复合物成分之间的直接相互作用，GST或GST-ASH2L、-RBBP5、-WDR5和-hDPY-30与在体外翻译[35S] GST下拉分析中蛋氨酸标记的ASH2L、RBBP5、WDR5、hDPY-30和MLL3和MLL4的COOH末端SET结构域片段。B类，WDR5与MLL3的FYRN和FYRC域包含区域相互作用。顶部面板，MLL3的COOH末端3993–4911个氨基酸的缺失突变示意图。下部面板GST或GST-WDR5与在体外翻译[35S] GST下拉试验中MLL3的COOH末端片段的蛋氨酸标记缺失突变。C类，hDPY-30由所有人类类Set1复合体共享。从稳定表达FLAG标记hDPY-30（F-hDPY-30）的HeLaS细胞制备的核提取物与抗FLAG M2-糖孵育。使用针对不同人类Set1-like复合物的不同亚单位（hSet1、MLL、Menin、NCOA6、PTIP和PA1）或共享亚单位（ASH2L、RBBP5和WDR5）的抗体，通过Western blot分析免疫沉淀物。
hDPY-30是酵母COMPASS/Set1复合物Sdc1亚单位的人类同源物，已证明与MLL2复合物相关(8). 在GST下拉分析中，hDPY-30直接与ASH2L相互作用，但与RBBP5或WDR5没有相互作用，这表明hDPY-三十可能由多个人类类Set1 HMT复合物共享(). 为了验证这种可能性，采用逆转录病毒基因转移方法建立了稳定表达FLAG标记hDPY-30的HeLaS细胞系。制备核提取物，并使用抗FLAG M2-糖进行免疫沉淀，然后进行Western blot分析。如所示，发现hDPY-30与细胞中的hSet1、MLL、Menin、PTIP、NCOA6、PA1以及ASH2L、RBBP5和WDR5相关，表明进化保守的hDPY-30是所有人Set1样复合物的共享亚基。
讨论
作为理解BRCT结构域蛋白PTIP正常细胞功能的第一步，我们从没有DNA损伤剂处理的培养细胞中分离出PTIP相关蛋白。我们表明（i）虽然体外表达的PTIP能够与53BP1和其他DNA损伤反应蛋白相互作用，但内源性PTIP与含有MLL3和MLL4的Set1样复合物相关；（ii）PTIP复合体具有强大的HMT活性在体外和细胞内。通过Edman降解分析，我们明确显示PTIP复合物甲基化组蛋白H3的K4残基；（iii）一种新的核蛋白PA1直接与PTIP结合，并且PTIP HMT复合物可以通过FLAG标记的PA1一步分离出来；（iv）PTIP、PA1和UTX，一种含有JmjC结构域的假定组蛋白脱甲基酶，与PTIP HMT复合物特异性相关；（v） 除ASH2L、RBBP5和WDR5外，hDPY-30是所有人类Set1-like HMT复合物共有的一个共同亚基，从而进一步确立了人类Set1-loke复合物和酵母COMPASS/Set1复合物之间的进化保守性；（vi）PTIP HMT复合物具有独特的亚基组成。组蛋白H3 K4甲基化与活性基因相关爪蟾PTIP与转录调控有关(36)我们的数据表明，PTIP和相关的Set1-like HMT复合物可能通过调节组蛋白H3 K4甲基化参与基因表达的调控。
与以前的报告一致(24,25)我们表明，在正常条件下培养的HeLaS细胞中，体外表达的F-PTIP能够与53BP1和其他DNA损伤反应蛋白相互作用(). 然而，这种相互作用显然是由于F-PTIP的过度表达，因为内源性PTIP在未经DNA损伤剂处理的细胞中与53BP1和其他DNA损伤反应蛋白没有显著的相互作用(). 与此一致，通过FLAG标记的PA1纯化的PTIP HMT复合物含有少量DNA损伤反应蛋白(,底部面板). 确定内源性PTIP和PTIP HMT复合体的其他亚单位是否与53BP1相互作用以响应DNA损伤剂治疗将是一件有趣的事情。
在酵母中，单个COMPASS/Set1复合物负责组蛋白H3 K4的单、二和三甲基化(4). 然而，在人类中，存在多个具有重叠但不同亚单位组成的类Set1组蛋白H3 K4甲基转移酶复合物（总结于). 这些类人Set1 HMT复合物中的每一个都包含一个或两个携带标志性SET结构域的酶亚单位，例如hSet1、MLL和MLL2。PTIP复合物包含两个含有SET结构域的大蛋白，MLL3（4911个残基）和MLL4（5262个残基），尽管它们中的每一个对整个复合物的HMT活性和功能的具体贡献仍有待确定。最近，Lee等. (19)显示的数据表明，MLL3和MLL4可能存在于单独的HMT复合物中。我们不能排除PTIP复合物由两个HMT复合物组成的可能性，其中一个含有MLL3，另一个含有MLL4。然而，PTIP和PA1明显与细胞中的MLL3和MLL4相关（图。和).
PTIP复合物还包含ASH2L、RBBP5和WDR5，这三个亚基是所有人类类Set1复合物共有的。PTIP复合体中酵母COMPASS/Set1复合体的Sdc1亚基同源物hDPY-30的鉴定进一步表明，PTIP复合物是一种真诚地类集合1复杂。hDPY-30直接与ASH2L结合()与在酵母COMPASS/Set1复合物中观察到的结果一致，Sdc1直接与ASH2L的酵母同源物Bre2相互作用(37). ASH2L、RBBP5和WDR5已被证明与MLL的SET域COOH终端相互作用形成一个子复合体(12,13). 我们发现hDPY-30也被各种人类类Set1 HMT复合物共享，WDR5直接与MLL3和MLL4的COOH末端SET结构域片段结合(). 这些数据表明，hDPY-30、ASH2L、RBBP5和WDR5可能形成一个四亚单位亚复合物，该亚复合物可能通过WDR5亚单位与Set1-like复合物的SET域组蛋白甲基转移酶直接相互作用，并调节这些复合物的酶活。
除了含有SET结构域的酶亚基和共享的ASH2L、RBBP5、WDR5和hDPY-30亚基外，每个人类Set1-like HMT复合物都包含独特或不同的亚基(). 例如，hSwd2和CXXC1已被证明与人类Set1（hSet1）复合体特别相关，而Menin仅由MLL和MLL2复合体共享(8,10). PTIP、PA1、NCOA6和UTX与PTIP复合体特异性相关（图。和). MLL、hSet1和CXXC1、Menin、，α-微管蛋白和BAF170，它们是先前报道的人类Set1样HMT复合物所特有的亚基(8-10,20,33,34)，不存在于PTIP复合体中，表明PTIP复合物不同于任何先前分离的Set1-like HMT复合体，并且具有独特的亚单位组成().
PTIP复合体与同样包含MLL3和MLL4的ASC-2复合体共享几个亚单位(33). 然而，这两个复合体之间有着明显的区别。首先，hDPY-30、PTIP、PA1和UTX存在于PTIP复合体中，但不存在于ASC-2复合体中。第二，α-和β-微管蛋白是ASC-2复合物的组成部分(33). 然而，PTIP复合体中显然不存在它们。最后也是最重要的是，PTIP复合物显示出强大的组蛋白H3 K4甲基转移酶活性(). 相反，ASC-2复合物对组蛋白H3的甲基转移酶活性很弱，甲基化残基仍不明确(33).
最近，发现一种部分纯化的复合物与雌激素受体相互作用，该复合物最少含有MLL4、ASH2L、RBBP5和WDR5α调节雌激素受体的转录活性α(38). 尚不清楚该复合物中是否存在PTIP和PTIP HMT复合物的其他亚单位，以及该复合物是否具有HMT活性。
PTIP及其串联BRCT结构域在复合物中的作用尚待研究。相关HMT复合物的酶活性显然不需要PTIP。此外，在没有PTIP的情况下，剩下的综合体似乎基本上完好无损(). PTIP被克隆为Pax2反式激活域相互作用蛋白(22).爪蟾PTIP已被证明通过其BRCT结构域与Smad2进行物理相互作用，并作为Smad2的转录辅激活子发挥作用(36). 我们推测PTIP可能与直接与启动子结合的转录因子相互作用，并促进PTIP HMT复合物向靶基因启动子的募集。PTIP中的串联BRCT结构域已被证明与磷酸肽结合(25). 可以想象，PTIP可能与复合物中的其他亚单位或以磷酸化依赖的方式与PTIP复合物相关的其他蛋白质相互作用。
大量证据表明，人类Set1样HMT复合物之间存在功能差异。首先，这些复合物包含与多种生物功能相关的不同亚单位。然而，不同的子单元如何单独或组合帮助定义相关复合体的特定功能尚待确定。其次，除了COOH末端催化SET结构域外，这些复合物的含SET结构区的酶亚基还具有不同的结构域。例如，识别乙酰化组蛋白赖氨酸残基的BROMO结构域仅在MLL蛋白中发现，表明组蛋白乙酰化事件与MLL复合物之间存在潜在联系。酵母Set1蛋白包含组蛋白H3 K4三甲基化而非二甲基化所需的RNA识别基序(39). 在人类中，RNA识别基序仅存在于hSet1中，而不存在于MLL、MLL2、MLL3和MLL4中，这表明这些复合物在组蛋白H3 K4上进行单甲基化、双甲基化和三甲基化的能力可能不同。
最近，酵母COMPASS/Set1复合体也通过动粒蛋白Dam1的甲基化参与有丝分裂过程中染色体分离的调节(40)，一种独立于组蛋白甲基化和转录调控的功能。外源表达的PTIP与53BP1相互作用，53BP1是细胞对DNA损伤反应的主要调节因子，并在电离辐射下转位到DNA双链断裂焦点，提示PTIP可能参与DNA损伤反应和修复(24,25). 测试内源性PTIP复合体和相关HMT活性是否参与DNA损伤反应，这将是一个有趣的功能，不同于其在转录调控中的潜在作用。
致谢
我们感谢J.Reddy提供的NCOA6/PRIP cDNA，G.Nolan提供的凤凰逆转录病毒包装细胞系，S.Agarwal提供的共享试剂，以及T.Blankenstein提供的pBabeCREpuro。我们感谢D.Forrest和S.Simons对手稿的批判性阅读。
脚注
*这项工作得到了国家卫生研究院和NIDDK（K.G.）的校内研究计划的支持。
三使用的缩写如下：
- HMT公司
- 组蛋白甲基转移酶
- BRCT公司
- BRCA1羧基端子
- 消费税
- 谷胱甘肽S公司-转移酶
- 中小企业基金
- 小鼠胚胎成纤维细胞
- 巴基斯坦国家石油公司
- Pax反式激活域相互作用蛋白
- 马尔迪
- 基质辅助激光解吸电离
◆这篇文章被选为本周论文。
…本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充表S1.
附录-伊萨耶娃等《分子细胞生物学》（2007）27最近报道MLL4（ALR）HMT复合体含有PTIP。
参考文献
1Bernstein BE、Humphrey EL、Erlich RL、Schneider R、Bouman P、Liu JS、Kouzarides T、Schreiber SL。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2002;99:8695–8700. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Santos-Rosa H、Schneider R、Bannister AJ、Sherriff J、Bernstein BE、Emre NC、Schreiber SL、Mellor J、Kouzarides T。自然。2002;419:407–411.[公共医学][谷歌学者] 三。Miller T、Krogan NJ、Dover J、Erdjument-Bromage H、Tempst P、Johnston M、Greenblatt JF、Shilatifard A。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2001;98:12902–12907. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Briggs SD、Bryk M、Strahl BD、Cheung WL、Davie JK、Dent SY、Winston F、Allis CD。基因发育。2001;15：3286–3295。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Roguev A、Schaft D、Shevchenko A、Pijnappel WW、Wilm M、Aasland R、Stewart AF。EMBO J。2001;20:7137–7148. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Noma K，Grewal SI。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2002;99（补充4）：16438–16445。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Nagy PL、Griesenbeck J、Kornberg RD、Cleary ML。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2002;99:90–94. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Hughes CM、Rozenblatt Rosen O、Milne TA、Copeland TD、Levine SS、Lee JC、Hayes DN、Shanmugam KS、Bhattacharjee A、Biondi CA、Kay GF、Hayward NK、Hess JL、Meyerson M。分子细胞。2004年；13:587–597.[公共医学][谷歌学者] 9Wysocka J、Myers议员、Laherty CD、Eisenman RN、Herr W。基因发育。2003;17:896–911. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10横山由纪夫A、王Z、威索卡J、三亚M、奥菲罗DJ、北桥一世、W先生、克利里ML。分子细胞。生物。2004年；24:5639–5649. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Milne TA、Briggs SD、Brock HW、Martin ME、Gibbs D、Allis CD、Hess JL。分子细胞。2002;10:1107–1117.[公共医学][谷歌学者] 12Steward MM、Lee J-S、O'Donovan A、Wyatt M、Bernstein BE、Shilatifard A。自然结构。分子生物学。2006;13:852–854.[公共医学][谷歌学者] 13Dou Y、Milne TA、Rustenburg AJ、Lee S、Lee JW、Verdine GL、Allis CD、Roeder RG。自然结构。分子生物学。2006;13:713–719.[公共医学][谷歌学者] 14Sierra J、Yoshida T、Joazeiro CA、Jones KA。基因发育。2006;20：586–600。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Glaser S、Schaft J、Lubitz S、Vintersten K、van der Hoeven F、Tufteland KR、Aasland R、Anastasiadis K、Ang SL、Stewart AF。开发（弧度）2006;133:1423–1432.[公共医学][谷歌学者] 16Wysocka J、Swigut T、Milne TA、Dou Y、Zhang X、Burlingame AL、Roeder RG、Brivanlou AH、Allis CD。单元格。2005;121:859–872.[公共医学][谷歌学者] 17洪博培DG、Chin SF、Muleris M、Batley SJ、Collins VP、Wiedemann LM、Aparicio S、Caldas C。致癌物。1999;18:7975–7984.[公共医学][谷歌学者] 18Prasad R、Zhadanov AB、Sedkov Y、Bullrich F、Druck T、Rallapalli R、Yano T、Alder H、Croce CM、Huebner K、Mazo A、Canaani E。致癌物。1997;15:549–560.[公共医学][谷歌学者] 19Lee S、Lee D-K、Dou Y、Lee J、Lee B、Kwak E、Kong Y-Y、Lee S-K、Roeder RG、Lee JW。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2006;103:15392–15397. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Lee JH，Skalnik总经理。生物学杂志。化学。2005;280:41725–41731.[公共医学][谷歌学者] 21Milne TA、Dou Y、Martin ME、Brock HW、Roeder RG、Hess JL。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2005;102:14765–14770. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Lechner MS、Levitan I、Dressler GR。核酸研究。2000;28:2741–2751. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Cho EA、Prindle MJ、Dressler GR。分子细胞。生物。2003;23:1666–1673. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Jowsey PA、Doherty AJ、Rouse J。生物学杂志。化学。2004年；279:55562–55569.[公共医学][谷歌学者] 25Manke IA、Lowery DM、Nguyen A、Yaffe MB。科学。2003;302:636–639.[公共医学][谷歌学者] 26Kim D、Wang M、Cai Q、Brooks H、Dressler GR。《美国肾脏学会杂志》。2007;18:1458–1465. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Ge K、Guermah M、Yuan CX、Ito M、Wallberg AE、Spiegelman BM、Roeder RG。自然。2002;417:563–567.[公共医学][谷歌学者] 29Kalkum M、Lyon GJ、Chait BT。程序。国家。阿卡德。科学。美国。2003;100:2795–2800. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Sengupta S、Robles AI、Linke SP、Sinogeeva NI、Zhang R、Pedeux R、Ward IM、Celeste A、Nussenzweig A、Chen J、Halazonetis TD、Harris CC。《细胞生物学杂志》。2004年；166:801–813. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31van den Bosch M、Bree RT、Lowndes NF。EMBO代表。2003;4:844–849. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Mahajan MA，Samuels HH。恩多克。版次。2005;26：583–597。[公共医学][谷歌学者] 33Goo YH、Sohn YC、Kim DH、Kim SW、Kang MJ、Jung DJ、Kwak E、Barlev NA、Berger SL、Chow VT、Roeder RG、Azorsa DO、Meltzer PS、Suh PG、Song EJ、Lee KJ、Lee YC、Lee JW。分子细胞。生物。2003;23:140–149. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Nakamura T、Mori T、Tada S、Krajewski W、Rozovskaia T、Wassell R、Dubois G、Mazo A、Croce CM、Canaani E。分子细胞。2002;10:1119–1128.[公共医学][谷歌学者] 35Klose RJ、Kallin EM、Zhang Y。Nat.Rev.基因。2006;7:715–727.[公共医学][谷歌学者] 36Shimizu K、Bourillot P-Y、Nielsen SJ、Zorn AM、Gurdon JB。分子细胞。生物。2001;21:3901–3912. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Dehe P-M、Dichtl B、Schaft D、Roguev A、Pamblanco M、Lebrun R、Rodriguez-Gil A、Mkandawire M、Landsberg K、Shevchenko A、Shevcenko A、Rosaleny LE、Tordera V、Chavez S、Stewart AF、Geli V。生物学杂志。化学。2006;281:35404–35412.[公共医学][谷歌学者] 38Mo R、Rao SM、Zhu Y-J。生物学杂志。化学。2006;281:15714–15720.[公共医学][谷歌学者] 40Zhang K、Lin W、Latham JA、Riefler GM、Schumacher JM、Chan C、Tatchell K、Hawke DH、Kobayashi R、Dent SY。单元格。2005;122:723–734. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
