KDM6脱甲基酶非依赖性组蛋白H3赖氨酸27三甲基化在胚胎早期发育中的丢失

没有KDM6 H3K27me3去甲基化的ES细胞具有女性特异性分化缺陷

我们建立了ES细胞分化模型，以研究在缺乏UTX和JMJD3的情况下H3K27me3去甲基化的时间过程。我们利用了CAGGCre-ER公司添加三苯氧胺诱导等位基因重组的转基因系统[41]在接受他莫昔芬治疗（+TX）2天后，Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室男性或Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室雌性ES株表现出floxed外显子完全缺失和内源性蛋白丢失(图S4A和S4B). 140-KD背景带位于图S4B和不会迷失在Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES+TX。确保这不是一种替代方案Utx公司产品，我们分析了它在Utx公司^GT1/年胚胎干细胞[31]，其中任何替代产品都应该被基因捕获。尽管Utx公司^GT1/年ES细胞确实陷阱Utx公司阻止跨JmjC域表达的转录物(图S4C)它不会影响背景带的水平(图S4B)表明这些确实是非特异性带。此外，带有第二个独立UTX抗体的western blot产生了一个干净的blot，其中没有UTX带Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES+TX样本(图S4D).

我们诱导胚胎体（EB）分化，如图2A.培养4天，Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室+TX EB看起来与未经处理的对照组相同(图2B).Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室雌性EB+TX较小，外胚层紊乱，细胞突出或脱落(图2B). 与聚集EB分化相比，悬滴EB分化在规定的滴体积内利用较小的起始ES细胞数，但仍产生相似的EB表型(图S5A). 随着分化的进展，类胚体的全球H3K27me3水平呈现特征性下降[32],[42]从EB中提取组蛋白，以确定此过程是否在没有UTX和JMJD3去甲基化的情况下发生。相对于ES细胞中H3K27me3的全球水平，所有EB，甚至Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室女性EB+TX显示H3K27me3降低(图3C). 荧光定量western blotting证实雄性和雌性+TX EB都表现出H3K27me3水平的丢失(图S5B、C). 因此，在没有所有KDM6的情况下，早期EB分化事件与H3K27me3水平的下调一致。

在单独的窗口中打开

图2

男女EB分化犹他州和Jmjd3号机组突变ES细胞系。

（A）犹他州^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室或Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞系未经处理（−TX）或用三苯氧胺处理3天（+TX），然后在聚合悬浮培养（EB）中分化。（B） 第4天EB的图像。（C） 组蛋白提取自Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室或Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（分化ES）或第4天EB（分化EB。（D） 定量RT-PCRUtx公司,Jmjd3号机组，或尤蒂从第0天开始Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室或Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（分化−）或第8天EB（分化+）未经治疗（−TX，浅灰色）或预处理三苯氧胺（+TX，黑色）。RT-PCR交叉删除Utx公司和Jmjd3型外显子。N个 = 每次治疗3个样本。所有样本均相对于单个雄性或雌性品系中的−TX分化+进行了标准化。（E） 定量RT-PCRFgf5型（EB第4天），Brachyury T公司(T型，EB第4天），Gata6公司（EB第8天），或法兰1（EB第8天）从犹他州^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室或Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（Diff−）或指示的EB时间点（Diff+）未经治疗（−TX，浅灰色）或用三苯氧胺（+TX，黑色）预处理。所有样本均相对于单个雄性或雌性品系中的−TX分化+进行了标准化。表达显著减少（T检验p值* = 0.02, ** = 0.005, *** = 0.006，牛顿 = 每次处理3个样品）。

在单独的窗口中打开

图3

在没有KDM6去甲基化的情况下，近端Hox基因显示RA治疗后H3K27me3丢失。

（A）犹他州^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞未经处理（WT）或用TX预处理3天（KO），恢复，并通过2天的维甲酸处理分化为神经表皮。在D0 ES细胞和D2 RA处理的细胞上进行H3K27me3和H3K4me3 ChIP-seq。（B） 通过edgeR比较ES和RA处理细胞中所有启动子（+/-1 KB）的标准化序列读数，以确定在任一WT中H3K27me3降低的启动子(Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室−TX）或KO(Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室+TX）电池。对数倍变化（logFC）是根据每百万次读取的平均日志计数（平均logCPM）绘制的。在该图中，54个WT和109个KO启动子在RA处理下表现出H3K27me3降低（logFC阴性，FDR<0.05，ES细胞中确定的H3K17me3 MACS峰值）。（C） UCSC基因组浏览器查看ChIP-seq的轨迹草酸铂集群。图中所示为输入（黑色）、WT ES H3K27me3 ChIP（深绿色）、KO ES H3G27me3 ChIP（深红色）、WT-RA H3K17me3 ChIP（浅绿色）、KI RA H3K24me3 ChIP（浅红色）、WI RA H3Ch4me3 ChIP。底部标注了ChIP-qPCR检测的RARE区域。

跨缺失外显子的RT-PCR证实，即使在培养8天后，野生型Utx公司和Jmjd3号机组表情缺失乌蒂TX处理细胞的表达没有减少(图2D). 男性Utx公司^飞行/年;Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室EBs+TX显示原始外胚层正常激活(Fgf5型表达），中胚层(法兰1)和内胚层(Gata6公司,图2E). 相反，Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室雌性EBs+TX启动分化并诱导原始外胚层(Fgf5型)，但未能指定中胚层（BrachyuryT型，如图所示T型)，中胚层(法兰1)，和内胚层(Gata6公司,图2E).Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室将ES+TX电镀以获得突变克隆的单细胞集落，该突变ES系在数周内的组成性繁殖不会影响细胞分化为EB的能力(图S5D、E). 总的来说，EB分化严重不足Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室+TX细胞不能重现Utx公司^Δ/Δ;Jmjd3号机组^Δ/Δ雌性胚胎(图1E〃).

ES细胞H3K27me3的去除和基因激活不需要KDM6脱甲基酶

为了研究KDM6在H3K27me3脱甲基中的作用，我们利用ES细胞的维甲酸（+RA）分化。作为Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室EB+TX似乎能够启动外胚层规范，可以在该细胞模型中研究RA向神经外胚层谱系的分化，从而去除KMD6成员的所有活性去甲基化。我们使用了中概述的2天RA分化时间过程图3A.H3K27me3 ChIP在4个WT ES个体重复上进行(犹他州^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室西班牙−德克萨斯州），KO ES(Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES+TX），WT RA(Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室RA−TX）和KO RA(Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室RA+TX）。每组4个重复中的两个合并在一起，每组产生的2个重复进行高通量测序。H3K4me3 ChIP-seq也在WT RA和KO RA的2个重复上进行。基于模型的ChIP-seq（MACS）算法分析确定了各组中H3K27me3和H3K4me3的富集峰，edgeR统计分析软件确定了WT（WT ES vs.WT RA）和KO（KO ES vs.KO RA）RA分化中经历H3K27me3去甲基化的基因。总的来说，1044个WT ES启动子（转录起始位点：TSS+/-1KB）和1141个KO ES启动子都显示出H3K27me3峰值。在这些启动子中，945和1055（WT和KO）也有RA H3K4me3峰，表明这些启动子大多数是二价的。

EdgeR鉴定出54个WT启动子（来自50个独特基因，一些具有替代启动子）和109个KO启动子(图3B和表S1)两个数据集中有许多基因重叠。许多霍克斯基因在WT和KO-RA分化中都丢失了H3K27me3。H3K27me3和H3K4me3 ChIP-seq的轨迹上传到UCSC基因组浏览器。RA分化时，近端草酸铂群集(图3C)来自霍克萨1通过霍克萨6WT和KO细胞从ES向RA分化时H3K27me3广泛丢失。组蛋白谱的这种改变与近端H3K4me3的大峰值相关草酸铂启动子，显示基因激活事件。H3K27me3也从近端大量丢失霍克斯布(Hoxb1-Hoxb6型),霍克斯(Hoxc4-Hoxc6型),和Hoxd(Hoxd1-Hoxd4型)集群(图S6A、B、C). 除了霍克斯基因，许多其他转录因子，如福克斯1,加塔3,美2、和编号2f2KO-RA治疗中证实启动子H3K27me3缺失(图4A和表S1). H3K27me3 ChIP-qPCR证实了在没有KDM6脱甲基的情况下H3K17me3的丢失(图4B). 值得注意的是，所有测试的基因在RA分化时都表现出类似的H3K27me3的WT和KO损失。仅限霍克斯b1与WT RA相比，KO RA的H3K27me3略有显著增加，但总体上霍克斯b1与KO ES相比，KO RA中H3K27me3的表达量明显减少。此外，RT-PCR表达分析证实，H3K17me3缺失的基因可有效诱导RA KO细胞的转录激活(图4C).Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室将ES+TX电镀以获得突变克隆的单细胞集落，该突变ES系在数周内的组成性繁殖不会影响细胞激活转录的能力(图S5F). H3K27脱甲基酶与H3K4甲基转移酶的MLL复合物家族有物理关联。该复合物的两个成员（ASH2L和RBBP5）在KO细胞中以正常水平表达(图S7A). 在没有去甲基化的情况下，H3K27me3缺失的一种替代解释是PRC2 H3K27甲基化复合物在分化细胞中下调或以非甲基化酶依赖的方式从靶向启动子中移位。而EZH2 H3K27甲基转移酶在RA分化细胞中保持高表达(图S7B)在没有KDM6去甲基化的情况下，蛋白质从H3K27me3缺失的启动子中转移（）。总之，被抑制的基因可以证明H3K27me3的丢失，并在没有KDM6的情况下启动表达。

在单独的窗口中打开

图4

在没有KDM6去甲基化的情况下，一些发育基因在RA治疗中表现出H3K27me3丢失。

（A） UCSC基因组浏览器视图福克斯1,加塔3,梅斯2、和编号2f2图中所示为Input（黑色）、WT ES H3K27me3 ChIP（深绿色）、KO ES H3G27me3 ChIP（深红色）、WT-RA H3K17me3 ChIP（浅绿）、KO-RA H3C27me3 ChIP（浅红）、WT-RA H3K4me3 ChIP。底部标注了ChIP-qPCR检测的区域。（B） 通过ChIP-qPCR验证H3K27me3损失。H3K27me3的ChIPUtx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（深绿色和红色，Diff−）或RA治疗2天后（浅绿色或红色，Diff+）未经治疗（绿色）或用三苯氧胺（红色）预处理。IgG控件ChIP显示为白色条。H3K27me3阴性基因座的定量PCR(Slc2a8系列发起人，阴性)用于与霍克斯簇状维甲酸反应元件(罕见),霍克斯1,Hoxc4型,霍克萨6,福克斯1,加塔3,梅斯2、和编号2f2发起人。N个 = 每次处理4个样本。所有测试的基因在WT和KO细胞中都表现出去甲基化，只有Hoxb1在KO-RA治疗中表现出轻微但显著的增加（p值 = 0.03). （C） 定量RT-PCRUtx公司,Jmjd3号机组，并指示霍克斯基因，福克斯1,美2、和编号2f2从Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（Diff−）或RA治疗2天后（Diff+）未经治疗（−TX，浅灰色）或预先用他莫昔芬（+TX，黑色）治疗。N个 = 每次治疗3个样本。所有样本均相对于−TX分化+RA治疗进行了归一化。未检测到基因在KO-RA细胞中的表达显著降低。

KDM6的缺失减少了H3K4me3调节基因的一小部分中H3K4甲基化和转录激活

对WT RA和KO RA细胞的H3K4me3 ChIP-seq进行MAC分析，确定在19140和19367个各自的启动子处出现富集峰（TSS+/-1KB）。WT RA与KO RA的EdgeR比较发现161个启动子（147个基因）在KO H3K4me3中表现出显著降低（FDR<0.05）(图5B,表S2). 其中大多数是整个峰值强度范围内的小褶皱变化。在这161个启动子中，只有27个（26个基因）具有ES WT或KO H3K27me3峰值，因此大多数基因不受H3K27甲基化的调控。UCSC基因组浏览器图片中显示了一些表现出KO H3K4me3减少和H3K27me3峰值的基因图5ART-PCR证实，几个KO H3K4me3减少的基因表达减少(螃蟹2,第6页,重量6,抄送2,图5C). 在KO RA样本中，几个基因被表示为经历了正常的H3K27me3丢失和基因激活(霍克斯b1,福克斯1)经历了与ES细胞状态相关的正常KO RA H3K4me3上调(图5D). 然而，ChIP-qPCR确实证实了ChIP-seq中鉴定的基因在RA KO H3K4me3中存在缺陷(螃蟹2,重量6,图5D). 我们接下来研究了KO RA H3K4me3受影响的基因是否与H3K27me3的增加相关。的ChIP qPCR螃蟹2和重量6证明KO RA H3K27me3增加至ES可比水平(图5E).

在单独的窗口中打开

图5

一组基因表现出H3K4me3减少，UTX和JMJD3丢失。

（A） UCSC基因组浏览器视图螃蟹2,第6页,重量6、和抄送2图中所示为Input（黑色）、WT ES H3K27me3 ChIP（深绿色）、KO ES H3G27me3 ChIP（深红色）、WT-RA H3K17me3 ChIP（浅绿）、KO-RA H3C27me3 ChIP（浅红）、WT-RA H3K4me3 ChIP。底部标注了ChIP-qPCR检测的区域。（B） 在WT上执行H3K4me3 ChIP-seq(Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室−TX）或KO(犹他州^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室+TX）细胞经RA处理。通过edgeR比较RA处理细胞中所有启动子（+/-1 KB）的标准化序列读数，以确定KO细胞中H3K4me3减少的启动子。对数倍变化（logFC）是根据每百万次读取的平均日志计数（平均logCPM）绘制的。在该图中，161个KO启动子显示RA处理后H3K27me3降低（logFC阴性，FDR<0.05，WT RA细胞中确定的H3K4me3 MACS峰值）。（C） 定量RT-PCR螃蟹2,第6页,重量6、和抄送2从Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（Diff−）或RA治疗2天后（Diff+）未经治疗（−TX，浅灰色）或预先用他莫昔芬（+TX，黑色）治疗。N个 = 每次治疗3个样本。所有样本均相对于−TX分化+RA治疗进行了归一化。表达显著减少（p-vale = *0.01, **0.03, ***0.001, ****0.004). （D） 通过ChIP-qPCR验证KO-RA细胞中H3K4me3的减少。H3K4me3的ChIPUtx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞（深绿色，Diff−）或RA治疗2天后（浅绿色或红色，Diff+）未经处理（绿色）或用三苯氧胺预处理（红色）。IgG控件ChIP显示为白色条。H3K4me3阴性基因座（基因沙漠地区，阴性)用于与Npm1号机组（阳性对照），显示正常KO基因激活的基因(Foxa1 Hoxb1)和KO H3K4me3减少的基因(Crabp2，重量6). 仅限螃蟹2和重量6KO-RA治疗显示减少（p值 = *0.01, **0.07). （E） H3K27me3的ChIP螃蟹2和重量6相对于阴性对照（Slc2a8）。两个基因均显示RA KO细胞中H3K27me3增加（浅红色条，p值 = *0.003, **0.03).

对分类基因亚群的Meta分析显示，在没有KDM6去甲基化的情况下，H3K27me3发生低水平变化

为了更好地分析H3K27me3和K3K4me3的分布，我们进行了一项荟萃分析，以检查这些组蛋白修饰在所有启动子中的总体分布，以及相应的MACS峰。这些元分析(图6A-G)以平均归一化读取计数为中心绘制95%置信区间。ES细胞和RA分化细胞在启动子中都有广泛的K27me3分布，在TSS附近有下降(图6A、B). TSS下游H3K4me3富集达到峰值(图6C)H3K27me3和H3K4me3的WT和KO剖面之间有非常紧密的重叠。RA分化后H3K27me3显著降低的基因，在WT和KO的ES和RA样本之间的相对H3K26me3序列读数有明显差异(图6D). 在比较WT RA和KO RA时，TSS附近有非常紧密的重叠（+/-1 KB）；然而，TSS上游（−2 KB至−1 KB）KO RA在每个基因的平均H3K27me3水平上表现出显著富集。同一地区WT ES与KO ES的比较也表明H3K27me3水平显著升高(图6D). 虽然这些KO启动子的H3K27me3升高，但H3K4me3分布完全重叠(图6E)，进一步支持该基因类别在KO-RA细胞中有效激活转录的数据(图4C). 因此，随着RA的分化，KO细胞可以在特定启动子处经历H3K27me3的显著降低，尽管TSS上游有少量H3K26me3积累，但转录没有受到影响。

在单独的窗口中打开

图6

H3K27me3和H3K4me3在雌性KDM6 WT和KO启动子中分布的Meta分析。

（A） 荟萃分析绘制了所有具有H3K27me3 MACS峰的雌性KDM6 WT和KO ES启动子相对于所有没有MACS峰的启动子的标准化H3K27me3序列读数和相应的95%置信区间。基因分布跨越转录起始位点上游的−2000碱基对到下游的+2000碱基对。（B） 对所有具有H3K27me3 MACS峰值的WT和KO RA启动子进行标准化H3K17me3序列读取，而对所有没有MACS峰的启动子进行检测。（C） 所有具有H3K4me3 MACS峰的WT和KO RA启动子相对于所有没有MACS峰的启动子的标准化H3K4me3序列读数。（D） 经标准化的H3K27me3序列读取edgeR识别的启动子，以经历RA分化的H3K27me3缺失。图中显示了ES WT和KO与RA WT和GO的对比。虽然WT和KO-RA计数都有大幅度下降，但在−1000到−2000年间，KO-ES和KO-RA分别相对于WT-ES和WT-RA略有升高（所有给定启动子的平均值T检验，p值 = *0.036，**0.019）（E）标准化H3K4me3序列读取edgeR识别的启动子，以经历RA分化的H3K27me3丢失。图中显示了RA WT和KO。（F） 通过edgeR识别的启动子读取标准化的H3K4me3序列，以在KO RA中相对于WT RA经历H3K4me3缺失。图中显示了RA WT和KO。KO RA在0到+1000之间显著降低（p值 = *0.009). （G） 经标准化的H3K27me3序列读取edgeR识别的启动子，在KO RA中相对于WT RA出现H3K4me3缺失。图中显示了ES WT和KO与RA WT和GO的对比。KO RA相对于WT RA在+500至+1500范围内显著升高（p值 = *0.040).

对KO RA细胞中显示H3K4me3减少的启动子的Meta分析证实，该数据集在TSS下游的H3K4me3中显著不足(图6F). 该数据集的H3K27me3图谱显示，在WT ES到WT RA的分化过程中，这些基因没有发生显著的K3K27me3丢失(图6G). 然而，RA KO相对于RA WT的H3K27me3有一个小而显著的升高，从TSS+0.5 KB到+1.5 KB。因为从图表中识别一小部分数据用于统计分析相当于樱桃采摘，而且并非没有偏见，所以我们使用edgeR对WT RA和KO RA H3K27me3水平进行了全基因组比较。WT RA与KO RA的全基因组交叉比较没有发现任何启动子（TSS+/-1 KB）显示KO H3K27me3显著增加。我们还比较了所有KO RA H3K27me3 MACS峰（峰中心+/-0.5 KB），包括在TSS中未发现的峰，以便在WT RA上进行归一化序列读取富集。该分析确定了74个KO RA H3K27me3 MACS峰（共4504个MACS峰），这些峰在WT的序列读取中富集(表S3). 这些峰值位于64个独特基因的不同附近；然而，由于TSS H3K4me3水平降低，这些基因中只有7个表现出转录受损(表S3). 总的来说，随着KDM6去甲基化的丧失，一小部分基因的H3K4me3略有减少，转录也减少，其中一部分基因升高了H3K27me3。

细胞培养

Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室和Utx公司^{飞行/飞行};Jmjd3号机组^{飞行/飞行};Cre公司^急诊室ES细胞系是利用E3.5囊胚在杂交中产生的CAGGCre-ER公司转基因小鼠系[41]ES细胞按所述进行培养[36]将ES细胞从饲养者MEF中分离出来，用1µg/mL 4-羟基三苯氧胺（4-OHT）处理3天，然后恢复1天。在EB分化实验中，10⁶在琼脂糖包被的培养皿上，将ES细胞培养在10 mL不含LIF的ES培养基中。用25µL滴ES细胞以20000细胞/mL的浓度建立悬滴EB。在RA分化实验中，ES细胞在三苯氧胺回收后被镀上，第二天在1µM维甲酸中培养不含LIF的ES细胞。E13.5 MEF按说明生成[31]将MEF传代1次，用0.5µM 4-OHT处理2天，然后再传代培养3天。

RT-PCR、western blotting和ChIP

用Trizol分离RNA，用Multiscribe逆转录酶合成cDNA。通过qRT-PCR（Bio-Rad SsoFast EvaGreen，CFX96实时系统）分析基因表达。所有RT-PCR均归一化为Gapdh公司与对照样品相关的表达式和图形。所有引物序列列于表S4按照所述进行核裂解物、组蛋白提取物和蛋白质印迹[31]利用抗RBBP5（Bethyl Labs A300-109A，1∶5000）、抗ASH2L（Bethlyl Labs A300-107A，1：3000）、抗H3K27me3（Millipore 07-449，1∶2000）、抗-H3（Abcam ab1791，1∶10000）、抗GAPDH（Sigma G9545，1∶1000）、抗UTX[29]或抗UTX（Bethyl Labs A302-374A，1∶4000）抗体。按照所述执行ChIP[74]并绘制每个免疫沉淀的ChIP总输入DNA的百分比。5×10⁶电池由Branson Sonifier以15%的占空比（0.7 s开启0.3 s关闭）进行声波处理。在一些实验中，在冷水浴中用生物破坏者超声发生器在高设置下对染色质进行30 s的超声处理，休息60 s。使用兔IgG（Sigma，I5006）、抗H3K27me3（Abcam ab6002，2.5µl）、抗-H3K4me3（Abcam ab8580，2µl。所有ChIP引物均列于表S4.免疫荧光实验按所述进行[31]抗H3K27me3（细胞信号9733S，1∶500）或ISL1（DSHB 39.4D5-S，1：200）

我们要感谢马格努森实验室对这份手稿的审查，感谢克里斯蒂安·赫林对UTX抗体的慷慨贡献。