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分子细胞。作者手稿；PMC 2011年11月24日发布。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2010年11月24日；40(4): 594–605.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2010.10.028
预防性维修识别码：项目经理3032266
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院249513
PMID：21095589

Jmjd3和UTX在染色质重塑中发挥脱甲基酶依赖性作用，以调节T盒家族成员依赖性基因的表达

萨拉·米勒,1 莎拉·莫恩,2和艾米·温曼1,2,*
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摘要

稳定和可遗传的H3K27甲基标记抑制祖细胞中谱系特异性基因的转录。在发育过渡期间，组蛋白去甲基化酶需要显著改变表观遗传和基因表达状态，以创建新的细胞特异性图谱。尚不清楚为什么拮抗多结合介导阻遏作用的去甲基化酶蛋白继续在终末分化细胞中表达，而H3K27甲基化的进一步变化可能是有害的。在本研究中，我们发现H3K27脱甲基酶Jmjd3和UTX介导了谱系定义的T盒转录因子家族和含Brg1的SWI/SNF重塑复合物之间的功能性相互作用。重要的是，Brg1与T-box因子T-bet的共沉淀需要Jmjd3，这种相互作用对于分化Th1细胞中的Ifng重塑是必要的。因此，Jmjd3在一般染色质重塑中具有必需的作用，该作用独立于其H3K27去甲基化酶电位。H3K27脱甲基酶蛋白的这种功能可能解释了它们在分化细胞中的存在，而分化细胞中已经建立了表观遗传图谱。

关键词：T-box蛋白、T-bet、脱甲基酶、染色质、Brg1、Jmjd3

H3K27甲基标记抑制祖细胞中谱系特异性基因的转录(Mikkelsen等人，2007年). 随着组蛋白去甲基化酶（包括LSD1和Jumonji家族）的发现，组蛋白甲基化（包括H3K27甲基化）的动态本质得到了阐明(Agger等人，2008年;曹等人，2002;Lan等人，2008年;Shi等人，2004年;威尔逊，2007年). 具体来说，组蛋白去甲基化酶可以去除稳定的甲基修饰，以便在发育过渡期间对细胞基因表达谱进行表观遗传重编程。这一过程在胚胎发育早期就开始了，当细胞从多能干细胞转变为更明确的谱系时，二价染色质结构域被分解，并在生物体的整个生命周期中持续进行(Mikkelsen等人，2007年). 许多优雅的研究已经定义了去甲基化酶的特异性，并对它们如何定位于基因组位点获得了一些见解(Agger等人，2008年;Chang等人，2007年;De Santa等人，2007年;Klose等人，2006年;Lan等人，2007年;Lee等人，2008年;Lee等人，2007年;Loh等人，2007年;Miller等人，2008年;施，2007年;Smith等人，2008年). 重要的是，组蛋白修饰只有在细胞分裂后可遗传，才能被真正视为表观遗传。这意味着一旦发生发育转换，新的表观遗传状态将保持不变。因此，如果改变表观遗传状态是Jumonji蛋白的唯一功能，那么在细胞转换完成后就不需要它们了。然而，这些蛋白质既在分化细胞中表达，也在完全结合的细胞中表达(曹等人，2002;De Santa等人，2007年;Lee等人，2007年;Miller等人，2008年;Sen等人，2008年;Shi等人，2004年;Smith等人，2008年;威尔逊，2007年). 尤其不清楚为什么拮抗多结合介导阻遏作用的去甲基化酶蛋白，如Jmjd3和UTX，在H3K27甲基化进一步改变可能有害的终末分化细胞中表达。这种不一致性导致了这样一种假设，即Jumonji蛋白具有另一种功能活性，这种功能活性与它们的去甲基化酶潜能完全不同，并且这种活性是调节最终分化细胞中的基因表达事件所必需的。

定义谱系的转录因子需要在细胞转变时建立基因表达模式，但值得注意的是，它们在承诺谱系中也发挥额外的细胞类型特异性作用。T-box家族代表了一个庞大而多样的谱系定义转录因子组，在许多器官系统的发育和正常功能中起着重要作用(Naiche等人，2005年). T盒因子的突变与几种人类遗传病有关，在发育需要的组织中观察到突变病理学。例如，Tbx5是心脏发育所必需的，该基因的突变与先天性心脏病（CHD）有关(Fan等人，2003年;莫里和文莱，2004年;雷蒙·贝特纳和博拉克，2004年). 此外，对基因敲除小鼠的分析表明，大多数T盒因子是完成胚胎发育特定阶段所必需的，如果缺乏这些因子，则胚胎会在需要每个T盒因子的阶段停止发育(Naiche等人，2005年). 综上所述，目前的数据支持T盒因子在确定发育过程中细胞命运决定方面的必要作用，以及在承诺细胞群体中的作用。

一个关键的悬而未决的问题是，谱系定义转录因子（如T-box家族）在发育过程中显著改变基因表达模式并随后影响承诺细胞中的基因活动的机制。之前，我们定义了T盒因子与H3K27脱甲基酶和H3K4-甲基转移酶复合物之间的共同功能相互作用(Miller等人，2008年). 这些相互作用需要T-box DNA结合域内的保守残基，并允许T-box因子诱导一个表观遗传环境，该环境允许在其靶基因处进行转录。这导致了这样一种假设，即T盒因子与这些复合物之间相互作用的主要功能是在发育转变时改变表观遗传状态。然而，T-bet是免疫系统中T辅助细胞1（Th1）细胞发育所需的谱系定义T盒因子，即使在发育静止的EL4细胞系中，也需要H3K27脱甲基酶Jmjd3才能最佳诱导靶基因表达(Miller等人，2008年). EL4细胞是一种转化的小鼠胸腺瘤细胞系，其表观遗传特征在很大程度上是固定的。这表明T-bet和可能的其他T-box因子可能利用H3K27脱甲基酶蛋白进行功能性活动，该功能性活动独立于其在终末分化细胞群中的脱甲基酶潜能。

在这里，我们表明H3K27脱甲基酶Jmjd3介导T盒转录因子T-bet和含Brg1的SWI/SNF重塑复合物之间的相互作用。这种功能相互作用在不同的T盒因子之间是保守的。有趣的是，另一种已知的H3K27脱甲基酶UTX也可以与SWI/SNF复合物发生物理相互作用，并且在功能上是T盒因子激活基因所必需的。值得注意的是，我们的数据表明，Jmjd3和UTX在一般染色质重塑中发挥作用，这与它们的H3K27脱甲基酶潜能无关(图S1). Jmjd3和UTX在调节分化细胞中诱导性T盒蛋白介导的基因表达模式中的功能作用增强了它们的去甲基化酶活性以促进活性转录。

结果

T盒蛋白需要Jmjd3，但不需要其去甲基化酶活性来诱导靶基因的子集

T-bet分别通过与Jmjd3和Set7/9的物理相互作用来协调抑制性H3K27me3修饰的去除和靶启动子上允许性H3K4me2标记的添加(Miller等人，2008年). 与这些组蛋白修饰酶活性物理相互作用的能力在T盒因子中是保守的(Miller等人，2008年). 然而，之前建立这种物理相互作用的研究并没有解决几个重要问题。具体而言，尚不确定T盒因子是否在功能上需要这些相互作用来调节最佳基因表达，如果需要，是否在所有情况下都需要这些蛋白质的组蛋白修饰酶活性。为了解决这些问题，我们研究了Jmjd3在发育停滞的EL4细胞系中T盒依赖性转录中的作用。我们用T-box构建物结合对照siRNA或siRNA将EL4细胞转染到Jmjd3。与之前的T-bet结果类似(Miller等人，2008年)T盒因子Eomesodermin（Eomes）、Tbx5和Tbx6都需要Jmjd3激活Ifng公司基因表达(图1A–C).

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Jmjd3是T盒蛋白依赖性基因表达所必需的，但其H3K27脱甲基酶活性不需要诱导一部分靶基因。（A–C）EL4 T细胞转染载体对照或Eomes、Tbx5或Tbx6的T盒因子表达构建物，结合对照siRNA（siGFP）或Jmjd3的siRNA（SiJmjd 3）。（D） 用载体控制或T-bet表达构建物转染EL4细胞，其中siGFP、siJmjd3、siJmjd3和野生型Jmjd 3或siJmjd3以及Jmjm3的H3K27脱甲基酶催化死亡突变体。（A–D）收集小份细胞用于RNA和qRT-PCR，数据代表具有标准偏差的独立实验的平均值。

由于Jmjd3是最佳基因表达所必需的，因此我们接下来要解决的是它是否仅用于创建表观遗传状态，特别是考虑到它在发育静止的EL4细胞群中的T-box依赖性基因表达中的重要性。为了解决这个问题，我们进行了siRNA实验，比较野生型Jmjd3和H3K27脱甲基酶催化死亡突变体拯救T-bet依赖性基因表达的能力。如前所示，激活原型T-bet靶点需要Jmjd3，包括Ifng公司,Ccl3公司和Cxcr3号机组在EL4 T细胞系中(图1D和图S2). 作为对照，Jmjd3依赖性转录水平的降低可以通过野生型Jmjd 3结构的过度表达来挽救，该结构被截断，使其不被siRNA靶向，但保留了完整的去甲基化酶活性(Hong等人，2007年). 与Jmjd3的H3K27脱甲基酶活性在某些情况下调节转录所需的作用一致，内源性基因表达Ccl3公司无法被催化失活的Jmjd3解救。令人惊讶的是，在T-bet靶点的一个子集上，催化突变体Jmjd3构建物拯救了基因表达(图1D). 重要的是，这种催化突变结构在H3K27脱甲基酶反应所需的三个协调铁离子的关键残基中的两个具有点突变，并且之前的几项研究表明，即使这些氨基酸的个别突变也会在体内外消除催化活性(Chen等人，2006年;Culhane和Cole，2007年;De Santa等人，2007年;Hong等人，2007年). 事实上，迄今为止所有已发表的研究都得出结论，这三个保守的铁配位残基对Jumonji蛋白的脱甲基酶活性是绝对必要的(Chen等人，2006年;De Santa等人，2007年;Hong等人，2007年;Horton等人，2009年;Kleine-Kohlbrecher等人，2010年;Tahiliani等人，2007年;Tsukada等人，2006年;Tsukada等人，2010年). 为了证实双突变体获得的出乎意料的结果，我们接下来创建了一个Jmjd3构建体，该构建体在所有三个铁配位残基中都有突变，这些数据证实了Jmjd3去甲基化酶突变体仍然能够拯救相同靶标亚群的基因表达(图S2). 因此，这些结果表明，Jmjd3蛋白发挥了另一个关键的功能作用，这与它在诸如Iffing公司,中央电视台和Cxcr3号机组在此设置中。为了进一步表征这种Jmjd3活性，我们探讨了Jmjd3在Ifng公司和Cxcr3号机组，细胞介导免疫中两个关键的Tβ依赖性靶基因。

Jmjd3是T-bet靶基因的一般染色质可及性所必需的

我们首先想确定Jmjd3的这种功能活性是否调节染色质依赖性或非依赖性事件。重要的是，H3K27脱甲基酶诱导的依赖功能与染色质结构有关，因为Ifng公司具有可构成的染色质环境的启动子-报告子结构不受Jmjd3基因敲除的影响(图2A). 因此，我们接下来研究了Jmjd3在染色质依赖性事件中的作用。在内源性Ifng公司启动子，T-bet表达时启动子可及性增加，重要的是，如限制性内切酶可及性分析所示，Jmjd3的siRNA敲除降低了这种重塑(图2B). 在内源性Cxcr3号机组启动子表明这是Jmjd3在T-bet目标启动子中的常见角色(图2C). 因此，T-bet和Jmjd3都是常规染色质重塑所必需的，以调节最佳基因表达。值得注意的是，Jmjd3依赖性的一般染色质重塑Ifng公司启动子通过野生型或催化死亡突变体Jmjd3的表达得到拯救(图2D). 总的来说，这些数据强烈表明，在某些情况下，T-bet利用Jmjd3使启动子区域更容易通过一种独立于其H3K27脱甲基酶活性的机制进入(图S2C).

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T-bet要求Jmjd3具有一般染色质重塑功能，该功能独立于其H3K27脱甲基酶活性。（A–D）EL4细胞通过载体控制或T-bet表达结构与siGFP联合转染，siJmjd3单独转染，或（D）siJmjd3与野生型Jmjd_3或Jmjd 3催化突变结构转染以进行挽救。收集等分细胞用于（A）荧光素酶分析，（B–D）RE分析。（A） 对于荧光素酶分析，转染后6小时不刺激或用PMA和离子霉素处理以模拟TCR刺激。（A–D）数据表示独立实验的平均值及其标准偏差。

T-bet在功能上与Jmjd3和含Brg1的SWI/SNF重塑复合物相互作用

Jmjd3本身不太可能积极参与破坏DNA-组蛋白的相互作用，因为在Jmjc-脱甲基酶结构域之外没有可识别的蛋白质基序，其中包含酶重塑活性。这导致了一种假设，即需要Jmjd3来调节T-bet和ATP酶依赖性组蛋白重塑复合物之间的相互作用。SWI/SNF-like复合物是一个很好的候选物，因为在T-bet靶基因启动子处，组蛋白-DNA相互作用被破坏，但没有沉积。Brg1是与SWI/SNF复合物相关的ATP酶之一，以前曾被认为参与Ifng公司激活，使其成为催化重塑成分的可能候选物(Zhang和Boothby，2006年).

我们首先检测了含有Brg1的SWI/SNF重塑复合物是否被募集到内源性Ifng公司在完全分化的原代Th1细胞中的启动子。在染色质免疫沉淀分析中，我们检测到野生型与T-bet相比，Brg1和Baf170（另一个核心SWI/SNF复合亚单位）的水平增加−/−原代Th1细胞(图3A、3B). Jmjd3还与Ifng公司以T-bet依赖方式启动子(图3B). 这些数据表明，T-bet在Th1细胞中招募了Jmjd3和含有Brg1的SWI/SNF重塑复合物。重要的是，我们还观察到一般染色质可及性的Tβ依赖性增加和H3K27me3修饰的减少(图3A、3C). 在完全分化的原代Th1细胞中的这些数据表明，SWI/SNF和Jmjd3的Tβ依赖性募集在功能上很重要。

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含Brg1的SWI/SNF复合物的T-bet依赖性招募Ifng公司启动子影响与Jmjd3相似的最佳启动子可及性和内源性基因表达。（A–C）来自野生型或T-bet的初级Th1细胞−/−对小鼠进行了（A，B）ChIP和（C）RE分析，显示了独立实验的平均定量和标准偏差。（A，B）使用针对Brg1、T-bet、H3K27me3、Jmjd3、Baf170或非特异性IgG抗体对照的抗体进行ChIP分析。样本被归一化为总输入的一等分，该等分也使用基因特异性引物进行扩增，以Ifng公司减去背景非特异性IgG控制信号。用载体对照（深灰色）、野生型T-bet和siGFP（黑色）、siBrg1（白色斑点）、siJmjd3（浅灰色）或siBrg1-siJmjd3（灰色斑点）转染（D，E）EL4细胞。收集细胞进行（D）RE分析，以确定Ifng公司启动子可及性或内源性（E）qRT-PCR分析Ifng公司表达式。（F） 用对照载体或野生型T-bet转染EL4细胞，其中siGFP（黑色）、siBaf170（浅灰色）、siBaf155（斑点浅灰色）或siBaf170-siBaf155（灰色，带黑色条纹）。内源性Ccl3公司,Cxcr3号机组和Ifng公司通过qRT-PCR分析监测表达。显示了相对于T-bet+siGFP样本具有标准偏差的三个独立实验的平均值。

接下来，我们想确定是否需要含有Brg1的SWI/SNF复合物来进行T-bet/Jmjd3依赖性重塑Ifng公司发生在发育停滞细胞中的启动子。我们对联合转染T-bet和siRNA至Brg1、Jmjd3或两者联合转染的EL4细胞进行了限制性内切酶（RE）可及性分析。Brg1的敲除减少了T-bet依赖的可及性，这表明Brg1是T-bet诱导的一般染色质重塑所必需的Ifng公司发起人(图3D). 有趣的是，当Brg1和Jmjd3联合被敲低时，对染色质重塑没有相加或协同作用。类似地，T-bet的激活能力Iffing公司Brg1和Jmjd3分别或联合被敲除后，基因表达受到同等程度的损害(图3E). 这些数据高度表明，Jmjd3和Brg1参与了导致Tβ依赖性染色质重塑和最终基因激活的相同途径(图S2C). 此外，SWI/SNF复合物的两个核心成分Baf170和Baf155的敲除也会抑制基因表达，尽管值得注意的是，其程度略低于催化成分Brg1(图3F与3E). 这表明，含有Brg1的SWI/SNF复合物是优化T-bet靶基因表达所必需的。

T盒因子需要含有H3K27去甲基酶潜能的Jumonji亚家族的一般染色质重塑活性

在图1，我们表明多个T盒因子利用Jmjd3诱导Ifng公司但从这些数据来看，尚不清楚这些T盒因子是否也通过Jmjd3和Brg1介导染色质重塑。为了研究这个问题，我们将T盒结构与siRNA结合转染EL4细胞到Brg1或Jmjd3。在这两种情况下，Brg1或Jmjd3的敲除都会降低内源性Ifng公司分别由Eomes、Tbx5或Tbx6诱导的基因表达(图4A、4C和图S3). 接下来，我们测试了T盒依赖性基因表达中对Jmjd3和Brg1的需求是否是由于一般染色质重塑的作用。重要的是，在染色质可及性分析中，Eomes和Tbx5在内源性Ifng公司发起人(图4B、4D). 当Jmjd3或Brg1被拆除时，可访问性的增加会减少(图4B、4D). 这些数据表明，Brg1和Jmjd3是保守的T盒因子依赖性染色质重塑诱导所必需的。

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T盒因子需要Jmjd3和Brg1进行染色质重塑和基因表达Ifng公司发起人。EL4细胞转染带有siGFP、siBrg1（细条）或siJmjd3（宽条）的Eomes（深灰色）或Tbx5（黑点）的载体控制（灰色）或T-box表达构建物。收集内源性（A，C）RNA和qRT-PCR样品Ifng公司表达或（B，D）RE分析以确定启动子可及性。（A–D）数据表示具有标准偏差的独立实验的平均值。

接下来，我们想定义Jmjd3中负责H3K27脱甲基酶独立活性的域。为了实现这一点，我们进行了siRNA敲除实验和过表达Jmjd3截短结构，以确定Jmjd 3的最小区域，该区域是拯救其在脱甲基酶依赖性靶基因上的活性所必需的。我们开始从Jmjd3的C端截断。有趣的是，Jmjd3结构体被截断到Jmjc结构域的C末端，在内源性靶基因上保持活性(图S4). 接下来，我们结合这个C端截断进行了累进N端截断(图5). 第一个Jmjd3双截突变包括Jmjc结构域和一个在Jumonji亚科中保守的区域，被称为混合结构域(Chen等人，2006年和图S5). 这种构建体保留了激活内源性基因表达的能力(图5A). 与结果一致图1D和图S2，当这种Jmjd3截短在所有三个催化残基中突变时，它仍然可以激活非甲基化酶依赖性靶标，Cxcr3号机组(图5B)但不能拯救脱甲基酶依赖者Ccl3公司表达式(图S6A). 值得注意的是，保留激活脱甲基酶诱导的依赖性内源性基因表达的能力以及重塑内源性启动子处的染色质的最小截短定位于213个氨基酸区域，该区域包含Jmjc结构域和大约一半的混合结构域(图5C、5D和图S6). 进一步完善脱甲基酶依赖活性所需的最小结构域受到阻碍，因为较小的突变结构体没有稳定表达。然而，值得注意的是，其他Jumonji家族蛋白质的晶体结构在这两个结构域中鉴定出了几个α螺旋和β片，它们从催化核心突出，可能是蛋白质/蛋白质相互作用的潜在对接位点(Chen等人，2006年;Horton等人，2009年). 目前，尚不清楚该区域的蛋白质/蛋白质相互作用是否会破坏Jumonji蛋白质的脱甲基酶活性，从而使这两种活性相互排斥，或者说它们可以同时发生。我们的数据确实表明，Jmjd3在一般染色质重塑中的作用不需要催化残基本身(图2D和图5B). 总之，数据表明，H3K27脱甲基酶亚家族中保守的一个区域包含最小Jmjc和混合结构域，负责T盒因子和重塑活动之间的功能相互作用。

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T-bet和Jmjd3之间的功能相互作用定位于H3K27脱甲基酶亚家族成员之间高度同源的区域。（A–D）EL4细胞通过载体控制或T-bet表达结构与siGFP联合转染，siJmjd3单独转染，或siJmjd3与野生型Jmjd 3或Jmjd_3截断突变结构转染，以进行拯救，如图所示。每个突变体结构中包含的来自Jmjd3的氨基酸由每个图的键中的数字表示。（B） 三个核心催化残基在Jmjd3 1170-1483截断的背景下发生突变，以产生催化死亡蛋白。收集小份细胞，以检测（A–C）RNA和qRT-PCRCxcr3号机组内源性基因表达，（D）RE可及性Ifng公司促进剂或西方分析(图S6). 所示为具有标准偏差的独立实验的平均值。（E） 如上图所示，Jmjd3与其最近的Jumonji亚科成员UTX和UTY高度同源。该亚家族在N末端结构域中分化，其中只有29.1%的同源性（6.7%的同源性），但重要的是，在混合结构域和Jmjc结构域中有87.4%的同源性，在C末端有77.6%的同源性。

结构域定位实验表明，Jmjd3在调节染色质重塑中的功能活性定位于Jumonji H3K27脱甲基酶亚家族之间的高度同源区域(图5和图S5). 因此，我们接下来想确定Jmjd3在T盒依赖性染色质重塑中的这种新功能作用是否与Jumonji蛋白的H3K27脱甲基酶亚家族相同。该子家族由Jmjd3、UTX和UTY组成。UTX已被证实具有H3K27脱甲基酶活性，而位于Y染色体上的UTY尚未通过实验验证(Hong等人，2007年;Smith等人，2008年). 虽然Jmjd3优先在免疫系统中表达，但UTX的表达更为普遍。这一点很重要，因为如果UTX在功能上也有助于染色质重塑，那么它可能是其他器官系统中表达的T盒因子的功能伙伴。

为了测试UTX是否也在功能上与一般重塑活动相互作用，我们在EL4细胞中进行了UTX siRNA转染实验，以分析UTX对T盒蛋白依赖性染色质可及性和基因表达的贡献。重要的是，T-bet、Eomes和Tbx5在不同程度上都可以利用UTX在内源性Ifng公司发起人(图6A-E). 因此，已知的H3K27脱甲基酶、Jmjd3和UTX共同具有调节T盒靶启动子处核小体重塑的能力。这一发现拓宽了这种机制活动的重要性，因为其他T盒因子可能能够利用UTX在Jmjd3不表达的细胞类型中招募SWI/SNF复合物。

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T盒因子还与UTX在功能上相互作用，诱导染色质重塑和基因表达。如图所示，用带有siGFP、siUTX或siJmjd3的载体控制或T盒因子表达构建物转染（A–E）EL4细胞。采集（A–C）RNA和qRT-PCR的细胞等分试样，以确定内源性Ifng公司表达和（D，E）RE可及性检查染色质重塑。显示的是具有标准偏差的独立实验的平均值。

Jmjd3调节T-bet和含Brg1的SWI/SNF复合体之间的物理相互作用

我们已经表明，Tβ依赖性重塑在Ifng公司和Cxcr3号机组启动子需要Brg1和Jmjd3的非催化功能。接下来，我们想确定Jmjd3的这种非催化活性是否介导与含Brg1的SWI/SNF重塑复合物的物理相互作用。为了探索这种可能性，我们进行了一系列联合免疫沉淀（co-IP）实验，以确定是否可以在细胞中的相同复合体中发现这些蛋白质。首先，我们发现内源性Brg1与EL4细胞中过度表达的T-bet和Jmjd3共同沉淀(图7A). 重要的是，与来自图2Jmjd3在启动子重塑中的作用与去甲基化酶活性无关，Brg1也与催化死亡的Jmjd 3突变体相互作用(图S7A). 接下来，我们想确定当这两种蛋白质都处于内源性水平时，Brg1和Jmjd3之间是否发生相互作用。内源性Jmjd3与EL4细胞中的Brg1相关，证实了我们对过表达蛋白的研究结果(图7B和图S7B). 同样，Jmjd3也与Baf170和Baf155共沉淀，表明Jmjd 3在内源性蛋白水平上与较大的SWI/SNF重塑复合物发生物理相互作用(图7C和7D). 接下来，我们测试了H3K27脱甲基酶亚家族的这种相互作用是否保守。在co-IP实验中，内源性UTX与Brg1共沉淀(图7E和图S7C). 这些数据与该脱甲基酶亚家族重塑活性的功能保守性一致。

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T-bet需要Jmjd3才能与包含Brg1的SWI/SNF复合体进行物理交互。制备EL4或原代Th1 T细胞的全细胞提取物，并用内源性蛋白或V5表位标签特异性抗体进行免疫沉淀。通过SDS页面解析免疫复合物，并使用图右侧所示的特定抗体进行Western分析。（A，H）EL4 T细胞转染如图所示。特定的Brg1波段用星号表示。作为IP的对照，用V5表位标签的抗体重新复制印迹。用Brg1或对照抗体沉淀来自（B–E）未转染EL4 T细胞或（F，G）原代Th1细胞的裂解物，如每条泳道上所示。作为对照，用第二个Brg1抗体重复印迹。（A） T-bet和野生型Jmjd3都与Brg1相关。EL4细胞转染pcDNA载体对照（1、4道）、T-bet（2、5道）或Jmjd3（3、6道）。（B–E）内源性H3K27脱甲基酶亚家族蛋白与Brg1和SWI/SNF复合物的其他成分相互作用。用对照抗体或Brg1沉淀EL4细胞的裂解液，并用（B）Jmjd3或（E）UTX特异性抗体进行检测。此外，EL4裂解物用对照或Jmjd3抗体沉淀，用（C）Baf170或（D）Baf155的抗体探测。（F，G）H3K27脱甲基酶jumonji亚家族蛋白在不依赖T-bet表达的原代Th1细胞内内源性水平上与Brg1形成复合物。（F） 来自野生型和T型的裂解物−/−用对照或Brg1抗体沉淀Th1细胞，用Jmjd3探测印迹。（G） T-bet样本−/−用对照或Brg1抗体沉淀细胞，并在印迹中探测UTX。（H） T-bet和Brg1之间的物理交互需要Jmjd3。用T-bet和对照siGFP（1、3道）或Jmjd3特异性siRNA（2、4道）转染EL4细胞，然后进行co-IP分析。

EL4细胞中没有内源性T盒蛋白表达的co-IP数据表明，内源性Brg1和Jmjd3（或UTX）之间的相互作用不需要这些转录因子。为了进一步探讨T盒蛋白、H3K27脱甲基酶亚家族和含Brg1的SWI/SNF复合物之间相互作用的需求，我们检测了Brg1和Jmjd3在原代Th1细胞中是否也以Tβ依赖性方式相互作用。为了解决这个问题，我们在野生型和T-bet中进行了内源性Brg1和Jmjd3的联合免疫沉淀实验−/−原代Th1细胞。重要的是，我们在两个样品中观察到类似水平的Jmjd3与Brg1共沉淀，这表明相互作用不受T-bet存在或不存在的影响(图7F). UTX还与T-bet中的Brg1共沉淀−/−表明其相互作用在原代Th1细胞中也是T-β依赖性的细胞(图7G). Jmjd3（或UTX）和Brg1之间的T盒依赖性相互作用表明，Jumonji蛋白的H3K27亚家族可能通过充当T盒因子和SWI/SNF重塑复合体之间的链接，介导T盒蛋白依赖性染色质重塑。因此，我们想确定Jmjd3是否是T-bet和Brg1之间物理联系所必需的，或者说，这些蛋白质只是在更大的重塑复合体中发现的独立成分。我们在EL4细胞中进行了联合IP实验，将T-bet与对照siRNA或Jmjd3特异性siRNA结合表达，以确定在没有Jmjd 3的情况下是否保留了T-bet和Brg1之间的相互作用。与Jmjd3介导这种相互作用的要求一致，当siRNA敲除降低Jmjd 3表达时，Brg1与T-bet的共沉淀严重减少(图7H). 因此，似乎需要H3K27脱甲基酶亚家族蛋白来桥接T盒因子和SWI/SNF染色质重塑复合物之间的物理相互作用。

讨论

我们的研究表明，除了作为H3K27脱甲基酶的重要发育作用外，Jmjd3和UTX还与含有Brg1的SWI/SNF复合物相互作用，促进普遍的染色质重塑。Jmjd3的这种机制活性在调节Th1细胞的基因表达模式中至关重要，Th1细胞依赖于谱系定义的T-box转录因子T-bet。重要的是，我们还表明，由T-box因子Eomes、Tbx5和Tbx6介导的染色质重塑也需要Jmjd 3和UTX。这些发现高度表明，这些T盒因子将利用与Jmjd3和/或UTX的相互作用来调节其自然发育环境中的特定靶基因图谱：分别是中胚层、心脏和脊椎。总之，本研究强调了胡蒙吉蛋白H3K27脱甲基酶亚家族的功能活性范围，提供了在发育过渡期间改变表观遗传环境的潜力，以及染色质重塑的更广泛作用，染色质重塑主要用于终末分化细胞。有趣的是，这两种功能活性都定位于含有Jmjc和混合结构域的213个氨基酸区域；每个脱甲基酶亚家族高度保守的区域。目前，尚不清楚一般染色质重塑活动是否与脱甲基酶功能相互排斥，或同时发生。为了解决这个问题，需要进行更精细的点突变分析，但可以推测，任何一种情况都可能对细胞有利，因为这是一种严密调节基因表达的方式。

T-box因子与Jumonji蛋白H3K27亚家族之间的保守相互作用为在特定发育阶段适当靶向染色质重塑活动提供了一种机制。T盒因子突变的数量说明了其在生物学上的重要性，这些突变会导致属于T盒域的人类遗传疾病(Andreou等人，2007年;Bamshad等人，1999年;Bongers等人，2004年;Fan等人，2003年;Kirk等人，2007年;莫里和文莱，2004年;Pulichino等人，2003年). 之前，我们描述了T盒结构域中的一小部分人类遗传病突变，这些突变专门破坏了T盒因子和H3K27脱甲基酶复合物之间的相互作用(Miller等人，2008年). 这些突变与先天性心脏缺陷、Holt-Oram综合征、促肾上腺皮质激素缺乏症和腭裂等不同疾病有关，这些疾病分别是由Tbx5、Tbx3、T-pit或Tbx22的突变引起的(Andreou等人，2007年;Bamshad等人，1999年;莫里和文莱，2004年;Pulichino等人，2003年). 本文提供的数据表明，由于Jmjd3/UTX相互作用的丧失，这些T-box突变可能会破坏T-box因子在其靶基因建立适当表观遗传状态的能力或一般染色质重塑模式。然而，导致异常发育的T盒依赖性靶基因表达谱失调的功能缺陷尚待确定。随着我们发现Jmjd3和其他含Jmjc-结构域蛋白质的新功能活性，了解在特定启动子和/或特定发育阶段需要哪些能力，即H3K27脱甲基酶活性或一般染色质重塑，变得越来越重要。这种机械知识最终可能使合理设计临床干预措施成为可能。目前，我们只能推测Jumonji蛋白的功能是必需的，但如果需要重塑功能，那么使用增强去甲基化酶活性的药物对患者进行潜在治疗将无益。

了解Jmjc-结构域蛋白去甲基化酶与染色质重塑功能的相对重要性对人类健康也有进一步的意义。特别是，Jumonji家族成员的突变与疾病有关。具体来说，在UTX公司与多种癌症相关(van Haaften等人，2009年). 有趣的是，虽然其中一些突变属于Jmjc结构域的催化残基，但许多突变位于Jmjc-结构域的非催化残基和蛋白质的C末端。鉴于H3K27脱甲基酶中这些区域的高度保守，这些突变可能破坏脱甲基酶诱导的保守功能活性，例如与含Brg1的SWI/SNF复合物的相互作用。如果情况确实如此，这将表明染色质重塑功能与去甲基化酶活性对正确的基因表达同样重要。我们的结果在某些情况下支持这种可能性，因为Jmjd3或UTX的缺失会以脱甲基酶依赖的方式降低目标基因子集的基因表达。还值得注意的是，H3K27脱甲基酶亚家族的N末端区域也被发现在一些癌症中包含突变，但N末端对脱甲基酶功能来说不是必需的，并且在亚家族成员之间差异很大。这导致人们猜测，对于这个Jmjc域家族，还有其他必要的、非冗余的功能活动。现在重要的是确定在人类遗传病中失调的Jmjc结构域蛋白的特定活性。

去甲基化酶蛋白在修饰组蛋白和一般染色质重塑中发挥作用的知识也有助于解释我们从组蛋白修饰的全基因组绘图中获得的信息。一般来说，H3K27甲基化的丧失以及组蛋白修饰的其他变化被认为是建立指示基因表达潜力的染色质状态的功能必需事件。同样，人们普遍认为，在特定基因组位置存在Jumonji蛋白意味着需要其酶活性来调节该位点的表观遗传变化。在许多情况下，这可能是真的，尤其是在发育过渡期间，为了重置基因表达谱，必须发生表观遗传状态的大规模变化。然而，在某些情况下，组蛋白修饰的变化可能只是含有Jmjc结构域的蛋白质为另一目的被招募到该位点的副产品，或者没有因Jumonji蛋白的结合而引起的可检测的变化。事实上，Jmjd3似乎就是后者，最近的ChIP-seq研究表明，Jmjd3不会改变与终末分化巨噬细胞相关的许多基因组位点的H3K27甲基化状态(De Santa等人，2009年). 我们的数据表明，Jmjd3可能被招募到这些位置来介导一般染色质重塑。

值得注意的是，H3K27去甲基化酶、Jmjd3和UTX去除抑制性甲基标记，然后通过诱导基因座的广泛重塑继续保持启动子活性。这导致了这样一种假设，即特定去甲基化酶的特定性质，无论是激活还是抑制转录，都可能在进化上与具有相同类型电位的重塑复合体相互作用。例如，启动子的渐进开放可能是去甲基酶的保守功能，去甲基酶可以消除抑制性修饰，而去除允许标记的Jumonji蛋白可能具有有助于基因沉默的结合伙伴，即使它们没有去甲基酶功能。我们的研究强调，需要确定Jumonji蛋白的所有作用，以便更好地了解随着细胞分化为独特群体，染色质调节蛋白需求的变化。特别是，在发育过渡中重要的去甲基化酶活性可能在承诺谱系中成为次要的，甚至是无关的。还需要进一步的实验来确定在细胞发育过程中是否存在这样一种机制逻辑来耦合表观遗传和一般染色质重塑事件。

实验程序

细胞培养和转染

EL4细胞

用10%FBS和Penn/Strep将小鼠EL4 T细胞保存在RPMI中。使用Amaxa（Lonza）核转染系统转染细胞：程序O-17，溶液V，如前所述(Lewis等人，2007年;Miller等人，2008年). 转染后16-22小时收集细胞进行进一步分析。对所有转染实验进行western分析，以确保相等的蛋白质表达水平。如前所述，使用pcDNA3.1/V5-His标记载体（Invitrogen）克隆所有表达结构(Lewis等人，2007年)或亚克隆到pEF1/Myc-His载体（Invitrogen）。siRNA未靶向的截短Jmjd3结构如所示图S5（1025–1641），之前已经证明保留了完全脱甲基酶活性(Hong等人，2007年).

初级单元格

初级CD4+从野生型C57BL/6和T-bet的脾脏和淋巴结中分离出T细胞−/−使用研发部Mag Cellect试剂盒的小鼠。所有涉及小鼠的实验均按照IACUC批准的方案进行。在存在Th1极化细胞因子（αIL-4、IL-2和IL-12）的情况下，用平板结合的αCD3e和αCD28激活细胞。第三天，细胞分裂，从TCR刺激中移除，并极化三天，以实现完全分化。

限制性内切酶可及性测定

该协议改编自Weinmann等人(Weinmann等人，1999年)如前所述进行更改。5×10的核6分离细胞，并在37℃下用1μl BanII或PstI分别消化2.5或1分钟。DNA纯化后，使用T4 DNA连接酶（NEB）将样品连接到酶特异性连接物。使用特异于连接子和启动子区域的引物进行嵌套LM-PCR。为了定量，使用Thermo scientific的ABsolute QPCR-Sybr Green Mix进行了第二轮LM-PCR。信号被标准化为来自肌动蛋白启动子的非门控DNA输入控制。结果表示为实验样品与野生型T-bet样品与对照siRNA的相对可及性（如适用）。

RNA和RT-PCR

使用Qiagen的RNeasy试剂盒或Machery-Nagel的Nucleospin试剂盒分离RNA，包括两种方案中的DNAse步骤。为了定量，使用第一链合成系统协议从Invitrogen制备cDNA，并重新悬浮到10ng/μl的浓度。使用来自Thermo Scientific的ABsolute QPCR-Sybr Green Mix和跨越内含子的基因特异性引物对cDNA和标准曲线进行定量。最终结果表示为与野生型T-bet和对照siRNA相比的相对表达水平。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

如前所述进行ChIP实验(Beima等人，2006年;Lewis等人，2007年;Miller等人，2008年). 简单地说，细胞与甲醛交联并进行声波处理。用因子或组蛋白特异性抗体沉淀蛋白质/DNA复合物。Brg1和H3K27me3抗体来自Millipore。T-bet和Baf170抗体购自Santa Cruz，Jmjd3抗体购自Abcam。用基因特异性引物和Sybr绿色试剂盒扩增纯化的DNA进行定量。定量结果归一化为总输入对照，从每个值中减去非特异性IgG对照的背景信号。最终结果代表了相对于野生型和T型的总样本−/−细胞。

荧光素酶

EL4细胞转染了T-bet表达结构，即5'CNSIfng公司启动子荧光素酶报告子构建(Shnyreva等人，2004年)，一种CMV-肾小球控制质粒，并将siRNA或siRNA控制到Jmjd3。收集小份细胞用于荧光素酶分析或西方对照。为了进行荧光素酶分析，根据制造商关于Promega双荧光素素酶报告物分析的说明对细胞进行裂解，并将信号标准化为肾素对照。最终结果表示为相对于T-bet和对照siRNA（siGFP）样本的平均表达水平。

共免疫沉淀

Co-IP实验如前所述进行(Miller等人，2008年)除非另有说明。使用浓度为325mM NaCl的改良RIPA II缓冲液。在这些研究中，使用V5抗体（Invitrogen）、Brg1抗体（Santa Cruz）、Jmjd3抗体（Abcam）或UTX抗体（Abcam）进行沉淀。western使用Brg1抗体（Millipore）监测相互作用；Baf170、Baf155和Brg1抗体（Santa Cruz）或Jmjd3和UTX抗体（Abcam）。

补充材料

01

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致谢

我们要感谢Ken Oestreich和Al Huang对手稿的有益讨论和批判性阅读。本研究得到了NIAID（AI061061）和（AI07272）以及美国癌症学会（RSG-09-045-01-DDC）对A.S.W.S.A.M的资助，并得到了NIGMS（PHS NRSA 2T32 GM007270）的产前培训资助。我们感谢NCI临床前实验室慷慨捐赠IL2和抗IL4药物。我们将这部作品献给凯里·亚当·莱维埃基（Kerry Adam Lewiecki）。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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