Oncol Lett公司。2017年10月；14(4): 4659–4662.
长非编码RNA PTENP1通过AKT和MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移
,1,* ,2,* ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1和1
盛晨（Sheng Chen）
1中国人民解放军火箭军总医院普通外科，北京100088
叶旺（Ye Wang）
2中华人民共和国北京100029中日友好医院病理科
张建华
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
夏奇军
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
孙强
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
李振凯
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
张建国
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
茅生堂
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
茂盛洞
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
1中国人民解放军火箭部队总医院普外科，北京100088
2中国北京中日友好医院病理科，邮编100029
*平均出资
2017年5月15日收到；2017年8月18日接受。
摘要
我们旨在研究长非编码RNA（lncRNA）PTEN假基因-1（PTENP1）对乳腺癌细胞增殖、迁移和周期的影响及其机制。合成表达PTENP1的慢病毒载体，并分别用LV003-GFP-PTENP1和LV003-GFP转染乳腺癌细胞MCF7。CCK-8法检测乳腺癌细胞的增殖能力，划痕法检测乳腺肿瘤细胞的迁移能力；流式细胞仪检测细胞周期，Western blot检测AKT和MAPK通路中cyclin A2、CDK2、p-p44/42 MAPK、t-p44/42MAPK、p-p38 MAPK、t-p38 MAPK、p-AKT、t-AKT的表达水平。实验组48小时和72小时的细胞吸光度值（A450）分别为1.4±0.3和2.3±0.47，显著低于对照组（3.2±0.39，3.4±0.58）（P<0.05）。实验组的细胞集落数为（48±13）个，显著低于对照组的（159±16）个（P<0.01）。实验组细胞迁移率为22.8±3.3%，显著低于对照组61.8±5.2%（P<0.01）。Western blot检测显示，实验组细胞周期蛋白A2、CDK2、p-AKT、p-p44/42 MAPK和p-p38 MAPK的表达水平均显著低于对照组。LncRNA PTENP1可通过AKT和MAPK信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。
关键词：lncRNA、PTENP1、乳腺癌、细胞周期、迁移
介绍
乳腺癌是威胁女性健康的主要疾病。据统计，乳腺癌占女性所有新发肿瘤的三分之一(1). 乳腺癌的发生和发展是多基因、多步骤的链式过程，由基因异常促进；此外，异常的表观遗传调控在乳腺癌的发生过程中也起着重要作用(2). 近年来，研究发现长非编码RNA（lncRNA）通过表观遗传调控机制在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用(三).
据报道，PTEN（10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）可抑制各种癌症的进展和发展，并被确定为肿瘤抑制因子(4). 例如，PTEN可以通过负调控PI3K/AKT通路参与抑制癌细胞的增殖(5,6)这表明PTEN在癌细胞的恶性转化中起重要作用。然而，关于PTEN在致癌过程中如何变化的详细机制尚不清楚。近年来，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）在癌症领域受到越来越多的关注。据报道，PTENp1（PTEN假基因1）可以调节祖先基因PTEN的表达，从而影响致癌过程(7). 然而，PTEN假基因1（PTENP1）在乳腺癌细胞中的作用和机制尚未完全阐明。本研究建立了稳定表达lncRNA PTENP1的乳腺癌细胞系，以探讨PTENP1-在乳腺癌细胞增殖和迁移中的作用及其机制。
材料和方法
材料
用于慢病毒包装的乳腺癌细胞系MCF7和细胞系293T购自中国科学院上海生物科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。TRIzol试剂购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德），胰蛋白酶和胎牛血清DMEM购自Gibco（美国纽约州格兰德岛），二甲基亚砜购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯），CCK-8试剂盒购自Dojindo（日本熊本），RNA提取试剂盒和TRIzole购自Takara（日本Otsu），兔抗人p-p44/42MAPK、p-p38 MAPK、p-AKT、cyclin A2、CDK2和小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）。
细胞培养
在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养MCF7细胞，并将培养基置于37°C含有5%CO2的培养箱中。细胞经0.25%胰蛋白酶消化后传代；并使用对数期细胞进行实验。
lncRNA PTENP1慢病毒表达载体的构建
根据美国国家生物技术信息中心（NCBI）的PTENP1基因序列，以人体皮肤组织中的DNA为模板，扩增出靶基因PTENP1-3′UTR。基因引物序列如下：正链：5′-AGTCACCTGTTAAGAAAATAGAGAGAGACAA-3′，反链：5’-CTGCCCTTATCAGATATACTTCAAA-3′。通过LV003-GFP载体构建表达PTENP1的重组子，并进行测序和鉴定。
慢病毒包装
在慢病毒包装系统中制备了4种质粒（pspax2、pMD2G、pLVX-IRES-ZsGreen1和pLV003-PTENP1）；质粒上的ZsGreen1表达盒能表达GFP；将含有靶基因的质粒和四种质粒转染293T细胞，在慢病毒包装系统中进行病毒包装，收集病毒上清液；上清液在40 ml超高速离心管中以80000×g在4°C下离心2 h；在40ml超离心管中。使用冰冻PBS重新悬浮病毒沉淀，在4°C下溶解过夜，并在−80°C下储存。
稳定表达lncRNA PTENP1的乳腺癌细胞系MCF7的构建
当MCF7的细胞融合率达到60-70%时，在感染多重性（MOI）=10的细胞表面分别添加GFP-PTENP1和LV003-GFP。8小时后，使用含有10%胎牛血清的正常DMEM培养基。建立实验组（用LV003-GFP-PTENP1转染的MCF7细胞）和对照组（用LV003-GFP转染的MCF7细胞）。荧光显微镜下观察绿色荧光后，加入嘌呤霉素（1µl/ml）进行筛选，3天后拍摄荧光照片，通过实时荧光定量PCR检测PTENP1的表达。
CCK-8检测乳腺癌细胞增殖能力
将取自两组的细胞接种到96孔板（2×10三/井），每组5个重复井。分别在12、24、48和72 h向CCK-8溶液中添加10µl/孔，并在培养箱中培养细胞2 h。使用微孔板阅读器测量A450，并根据A450s绘制生长曲线。
平板克隆法检测乳腺癌细胞克隆形成能力
消化实验组和对照组的细胞，制备单细胞悬液，细胞密度调整为2×10三/取100µl细胞悬液接种在6孔板上，然后加入2ml培养基。细胞悬浮液在培养箱中培养1-2周，当克隆形成可见时播种，然后进行Giemsa染色；并统计克隆数。
划痕法检测乳腺癌细胞迁移率
将上述细胞接种到6孔板上，当细胞融合达到100%时，用1ml矛头在每个孔的中间画一条直线，24小时后拍摄细胞照片；计算划痕前后的面积变化。细胞迁移率（%）=（划痕面积-24小时后面积/划痕面积）×100%。
蛋白质表达的western blot检测
对数期细胞取自实验组和对照组；按照蛋白提取试剂盒中的程序提取各组总蛋白并进行定量。蛋白质经丙烯酰胺凝胶电泳后，采用湿转移法转移到聚偏氯乙烯膜上。用脱脂牛奶密封膜1 h，然后制备兔单克隆p-AKT抗体（稀释度1:500；类别号ab81283）；兔多克隆t-AKT抗体（稀释，1:500；cat.no.ab38449）；兔单克隆p-P44/42MAPK抗体（稀释，1:500；目录号ab53277）；兔单克隆t-P44/42 MAPK抗体（稀释，1:500；目录号ab50011）；兔多克隆p-p38 MAPK抗体（稀释，1:500；猫编号ab47363）；兔多克隆t-p38 MAPK抗体（稀释，1:500；cat.no.ab197348）；兔单克隆cyclinA2抗体（稀释，1:500；cat.no.ab32386）；兔CDK2单克隆抗体（稀释，1:500；目录号ab32147）；添加兔多克隆GAPDH抗体（稀释度为1:500；cat.no.ab37168）。所有抗体均购自Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）。然后将蛋白质在4°C下培养过夜。用TBST洗涤蛋白质三次后，添加次级山羊抗兔（HRP）IgG抗体（稀释度1:2000；cat.no.ab6721）孵育1 h，然后通过增强化学发光（ECL）显影。
统计分析
使用SPSS 17.0软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行数据分析。t检验用于比较两组之间的蛋白质表达水平和吸光度值。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
lncRNA PTENP1对乳腺癌MCF7细胞增殖能力的影响
乳腺癌MCF7细胞的生长曲线如所示48h和72h实验组细胞A450分别为1.4±0.3和2.3±0.47，显著低于对照组（3.2±0.39，3.4±0.58）（P<0.05）。集落形成分析如所示结果表明，实验组细胞克隆数为48±13，显著低于对照组（159±16）（P<0.01）。
乳腺癌MCF7细胞的集落形成测定。（A） 对照组；（B） 实验组；（C） 与对照组相比，实验组菌落数显著减少（**P<0.01）。
lncRNA PTENP1对乳腺癌MCF7细胞迁移能力的影响
划痕实验显示，实验组细胞迁移率为22.8±3.3%，显著低于对照组61.8±5.2%（p<0.01）().
lncRNA PTENP1对对照组和实验组乳腺癌MCF7细胞迁移能力的影响（**P<0.01）。
lncRNA PTENP1对乳腺癌MCF7细胞周期蛋白的影响
细胞周期蛋白A2和CDK2是促进细胞从S期向G2期转化的重要蛋白质。Western blot检测显示，实验组细胞周期蛋白A2和CDK2的表达水平显著低于对照组().
lncRNA PTENP1对对照组和实验组乳腺癌MCF7细胞周期蛋白的影响。
lncRNA PTENP1对AKT和MAPK信号通路的影响
Western blot检测显示，实验组AKT信号通路中重要因子p-AKT蛋白的表达与对照组相比显著降低。此外，实验组MAPK信号通路中重要因子p-p38 MAPK和p-p44/42 MAPK的蛋白表达水平与对照组相比显著降低().
lncRNA PTENP1对对照组和实验组乳腺癌MCF7细胞AKT和MAPK信号通路的影响。
讨论
lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的转录RNA。由于缺乏启动子，lncRNA不能转化为蛋白质。越来越多的研究证实，lncRNA通过参与调节染色质修饰、转录激活、核内干扰和X染色体沉默来调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化和迁移(8). 研究表明，lncRNA在乳腺癌的发生发展中也起着重要的调节作用。在ERα阳性乳腺癌中，lncRNA H19可以通过下调促凋亡基因BIK来提高乳腺癌的化疗抵抗力(9). 在乳腺癌细胞中，长非编码RNA UCA1可以增强三苯氧胺的化疗耐药性，这可能是通过调节miR-18a-HIF1α反馈环实现的(10). 在本研究中，建立了表达PTENP1的乳腺癌细胞MCF7。CCK-8增殖试验和平板克隆试验表明，PTENP1可以抑制乳腺癌细胞的增殖和生长，划痕试验表明，PTENP1能够抑制乳腺癌的细胞迁移。
PTEN通过直接抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路和负调控miR-21，可以影响一系列细胞过程(11,12). 如我们的研究所示，PTENp1通过AKT信号通路以及细胞周期相关蛋白（如细胞周期蛋白A2和CDK2）抑制细胞增殖和迁移。这一发现揭示了PTENp1，一种在乳腺癌中阻断miRNA活性的假基因转录物，可以在转录后调节许多潜在的生物学作用。
MAPK是细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在乳腺癌中起重要作用。MAPK信号通路的异常变化在乳腺癌的生长、分化等生理活动中起着重要作用。为了研究PTENP1在乳腺癌细胞MAPK信号通路中的作用，检测了表达PTENP1MCF7中p-p44/42 MAPK和p-p38 MAPK的蛋白表达水平，发现PTENP1能下调Erk1/2（p44/42 MAPK）和p38 MAPK蛋白的磷酸化，乳腺癌细胞MAPK信号通路中的重要因子，表明PTENP1除了抑制乳腺癌细胞AKT信号通路的活性外，还可以通过调节MAPK信号途径调节乳腺癌细胞的增殖和迁移。
近年来，一些学者提出了竞争性内源性RNA（ceRNA）假说；也就是说，lncRNA和相应功能网络中的mRNA有共同的microRNA结合位点，通过microRNA吸附减弱了microRNA对同源mRNA的抑制作用(13–15). 研究表明，lncRNA PTENP1也可以通过ceRNA假说中的方法调节PTEN的表达，从而影响肿瘤细胞的进展(16–18). ceRNA在乳腺癌细胞中的作用机制尚需进一步研究。
总之，lncRNA PTENP1可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，这可能是通过下调细胞周期中重要蛋白cyclin A2和CDK2以及AKT和MAPK信号通路实现的。lncRNA PTENP1在乳腺癌的发生和发展中发挥着重要作用，对其深入研究不仅可以揭示其抑癌基因PTEN的相关机制，还可以揭示lncRNA在乳腺癌中的作用和机制。此外，对lncRNA的深入研究可以为乳腺癌的预防和治疗提供新的思路。
工具书类
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