Oncotarget公司。2016年12月6日；7(49): 81452–81462.
LncRNA H19通过抑制促凋亡基因BIK的表观遗传沉默赋予ERα阳性乳腺癌化疗耐药性
，1,4 ，1,4 ，5 ，1,4 ，1,4 ，1,4 ，1,4 ，1,4 ，1,5 ，1,5 ，6 ，6 ，1,4和1,2,三，4
新新斯
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
阮晋藏
1南京医科大学江苏省人类功能基因组学重点实验室，中国江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
张二宝
5南京医科大学生物化学与分子生物学系，江苏南京
刘岳（音）
1南京医科大学江苏省人类功能基因组学重点实验室，中国江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，中国江苏省南京市
小石
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
张二韶
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
邵立培
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4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
李安迪
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
南阳
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
5南京医科大学生物化学与分子生物学系，江苏南京
肖翰
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
5南京医科大学生物化学与分子生物学系，江苏南京
栾阳
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
孙玉洁
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
2肿瘤医学协同创新中心，江苏省肿瘤生物标志物防治重点实验室，南京医科大学，中国江苏南京
三南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，江苏南京
1江苏省人类功能基因组学重点实验室，南京医科大学，江苏南京
2中国江苏省南京市南京医科大学肿瘤生物标志物与防治江苏省重点实验室肿瘤医学协同创新中心
三南京医科大学生殖医学国家重点实验室，江苏南京
4南京医科大学细胞生物学系，中国江苏省南京市
5南京医科大学生物化学与分子生物学系，中国江苏南京
6南京医科大学第一附属医院病理科，江苏南京
2016年5月1日收到；2016年10月21日接受。
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- 补充资料
GUID:0BF04A79-70BA-4A8A-93FB-5A0FDB975836
摘要
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤。耐药性的获得是乳腺癌治疗中遇到的主要障碍之一。长非编码RNA（lncRNA）已被证明在发育和肿瘤发生中发挥重要作用。然而，lncRNAs与化疗耐药性的发展之间的关系尚不明确。在本研究中，在ERα阳性乳腺癌细胞中，lncRNA H19的高表达被确定为与紫杉醇（PTX）耐药性相关的一个强大因素，但在ERα阴性乳腺癌细胞内没有。LncRNA H19通过抑制促凋亡基因BIK和NOXA的转录，减轻PTX治疗引起的细胞凋亡。进一步证实H19通过招募EZH2和在赖氨酸27处使组蛋白H3三甲基化来抑制BIK的启动子活性。有趣的是，我们的数据表明lncRNA H19是ERα的下游靶分子之一。因此，ERα表达的改变可能改变H19水平，以调节乳腺癌细胞对化疗的凋亡反应。我们的数据表明，ERα-H19-BIK信号轴在促进化疗耐药中起着重要作用。
关键词：乳腺癌，化疗耐药，lncRNA H19，凋亡，雌激素受体
简介
乳腺癌是世界各地女性常见的恶性肿瘤。化疗对大多数乳腺癌患者来说是一种有效的治疗方案，然而，化疗耐药性的出现严重限制了这种治疗的疗效。癌症的一个特征是细胞凋亡的破坏，它促进肿瘤发生和化疗耐药。因此，大多数抗癌药物通过激活凋亡途径杀死肿瘤细胞，但在耐药肿瘤中如何避免这种激活尚不清楚。因此，癌症治疗的改进需要对使肿瘤易受药物诱导凋亡影响或使其避免凋亡死亡的分子事件有更深入的了解。
长非编码RNA（lncRNA）是一种非编码转录物[1，2]。越来越多的证据支持lncRNA在肿瘤形成中的重要作用。它可以调节参与细胞周期、细胞增殖、凋亡和迁移的多种癌症相关信号通路[三–8]。H19基因转录一种长的非编码RNA，是一种母系表达的印迹基因，在哺乳动物的发育中起着至关重要的作用[9–11]。H19在大多数人类癌症中高度表达，包括乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌和胃癌[12–15]H19的过度表达通常与肿瘤患者的不良预后相关[16，17]。尽管H19的表达很重要，但就细胞凋亡和化疗耐药性而言，研究较少。我们的研究表明，H19在乳腺癌中的高表达可减弱化疗反应中常见的细胞凋亡。其他研究报告称，H19通过充当miRNA海绵、改变DNA甲基化和控制mRNA衰变，以不同方式促进肿瘤的进展和转移[10，18，19]。在本论文中，我们证明了H19与组蛋白甲基转移酶EZH2的结合对促凋亡基因BIK的表观遗传抑制。这是首次证实H19在乳腺癌耐药性中的作用。
乳腺癌的进展至少部分受到雌激素受体α（ERα）的调节。约65%的人类乳腺癌依赖雌激素并表达ERα[20]。临床试验的累积数据表明，ERα参与了乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。例如，据报道，ERα阳性乳腺癌患者从服用PTX中获益甚微[21，22]。因此，提高化疗作为乳腺癌治疗的疗效需要更好地了解其潜在的分子机制。我们已经证明lncRNA H19是乳腺癌细胞ERα的下游分子之一，ERα上调H19调节乳腺癌细胞对化疗的凋亡反应。基于这些发现，我们提出ERα-H19-BIK信号轴参与PTX抗性的促进。
结果
在ERα阳性乳腺癌细胞中，lncRNA H19的表达水平与PTX耐药呈正相关
据报道，lncRNA H19在各种癌症中的表达，H19被认为参与肿瘤的发生和转移[23–25]。因此，H19在PTX耐药乳腺癌细胞中的高表达引起了我们的关注。Oncomine平台(http://www.oncomine.org)是癌症转录组数据的免费在线生物信息学资源。我们分析了从Oncomine数据库中筛选出的Barretina研究数据[26]，并确定H19的表达与不同乳腺癌细胞系中PTX耐药性的增加平行增加（图). 实时PCR证实，抗PTX的MCF-7和ZR-75-1细胞（MCF-7R和ZR-75-1R）中H19 RNA水平升高。在图中与亲代MCF-7S和ZR-75-1S细胞相比，H19在MCF-7R和ZR-75-1R细胞中显著上调。然而，在MDA-MB-231耐药细胞（ERα阴性乳腺癌细胞）中未观察到lncRNA H19上调（数据未显示）。该表显示了每对电池类型的IC50（图). ERα阳性乳腺癌细胞中H19转录与PTX耐药之间存在明显的正相关。
LncRNA H19与PTX耐药性呈正相关(一个)H19在对PTX具有不同敏感性的乳腺癌细胞中的表达水平（基于Oncomine搜索）。对PTX耐药的细胞组包括HCC1569、Hs578T、MCF7、MDA-MB-157、MDA MB-175-VI、MDA-MB-415、MDA MB-468和T-47D。中等敏感性细胞组包括ZR-75-30、MDA-MB-436、BT-474和CAL-85-1。PTX敏感组包括HCC1395、SK-BR-3、CAMA-1、HCC1954、HCC1187、EFM-19、MB157、HMC-1-8、AU565、BT-549、HCC70、HCC1806、BT-20、HDQ-P1等[26]。(B类)实时PCR分析两对PTX耐药乳腺癌细胞系（MCF-7R和ZR-75-1R）及其双亲细胞系中H19的表达水平。(C类)每对耐PTX细胞的IC50值。
LncRNA H19与乳腺癌耐药性的关系
通过用H19-靶向siRNA转染MCF-7R和ZR-75-1R细胞，验证了lncRNA H19对乳腺癌PTX耐药性的贡献。实时PCR证实了干扰效率（图). 将这些转染细胞用一系列PTX浓度处理48小时，然后使用MTT法进行活性测试。当用100、1000和10000 nM PTX处理时，MCF-7R细胞的存活率显著降低（图). H19敲除组MCF-7R细胞的IC50值从4172±567 nM降至982±289 nM。ZR-75-1R细胞的结果相似，显示IC50值从12791±4703 nM降至5189±3153 nM(补充表S1).
LncRNA H19对乳腺癌细胞多药耐药性的影响(一个)用H19-靶向siRNA或干扰siRNA瞬时转染MCF-7R或ZR-75-1R细胞。实时PCR分析表明H19的表达有效降低。MTT分析表明，在PTX处理的应激下，H19的敲除降低了细胞活力。(B类)用H19过表达质粒或对照载体瞬时转染MCF-7S或ZR-75-1S细胞。实时PCR分析证实H19过度表达。采用MTT法测定不同浓度PTX处理的MCF-7S或ZR-75-1S细胞的存活率。(C类)从转染H19过表达质粒或对照载体的MCF-7S细胞获得的MTT结果表明，H19过度表达也增加了这些细胞对EPI（左）和DDP（右）的抗性。(D类)转染H19-靶向siRNA或对照siRNA的MCF-7R细胞的MTT结果表明，H19敲除也降低了这些细胞对EPI和DDP的抗性。
我们通过在亲代细胞系MCF-7S和ZR-75-1S中异位表达H19，进一步评估了H19在乳腺癌化疗耐药中的作用。通过qPCR证实了转染效率（图). 转染后24小时，用不同浓度的PTX处理细胞48小时，然后用MTT法评估其生存能力。表达高水平lncRNA H19的细胞对PTX治疗有抵抗力。这种现象在MCF-7S和ZR-75-1S细胞系中都观察到（图). MCF-7S细胞的IC50值从684±201 nM增加到2313±817 nM，ZR-75-1S细胞从2563±1358 nM增加至6693±2781 nM(补充表S1).
据报道，H19可在缺氧条件下诱导P-糖蛋白表达[27]。P-糖蛋白是一种由MDR-1基因编码的跨膜蛋白，其作用是作为一个泵，促进包括PTX在内的特定药物的流出。我们通过MTT法检测MCF-7R对其他两种化疗药物表阿霉素（EPI）和顺铂（DDP）的药物反应，确定H19相关耐药性是否依赖于P-糖蛋白。EPI是另一种P-糖蛋白底物，但DDP不是。将H19导入MCF-7S细胞显著增加了它们对EPI和DDP的耐药性，而H19敲除则减弱了它们对EPI和DDP的耐药性（图和)，根据PTX结果。IC50值如所示补充表S2和S3因此，H19可以独立于P-糖蛋白介导的药物外排，促进化疗药物暴露应激后的细胞存活。
H19通过抑制BIK和NOXA的转录来减弱细胞凋亡反应
大多数化疗药物通过激活细胞凋亡发挥作用。我们通过H19敲除细胞的流式细胞术评估了细胞凋亡在H19介导的化疗耐药中的作用。通过Annexin V/PI染色和FACS分析评估转染H19 siRNA和PTX处理的MCF-7R细胞的凋亡率。H19基因敲除显著增加了PTX处理的细胞的凋亡率（图).
H19通过抑制BIK和NOXA的转录减弱细胞凋亡反应(一个)将H19 siRNA或干扰siRNA瞬时转染MCF-7R细胞，然后进行PTX处理。采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。(B类)实时PCR分析检测MCF-7R细胞中H19基因敲除对9个促凋亡基因mRNA水平的影响。(C类)实时PCR分析检测MCF-7S细胞中H19过度表达对NOXA和BIK mRNA水平的影响。(D类)进行蛋白质印迹分析以检测H19过表达或敲低对BIK或NOXA的蛋白质水平的影响。
我们通过选择Bcl2家族中的9个促凋亡基因作为假设的H19靶点，进一步研究了H19介导的细胞凋亡的机制。如图所示MCF-7R细胞中H19的敲除在转录水平显著上调BIK和NOXA，而将H19引入MCF-7S细胞显著抑制BIK和NOXA的表达（图). H19敲除后BIK和NOXA的蛋白水平同样升高，H19过度表达后降低（图).
在确认BIK和NOXA为H19靶点后，我们通过恢复MCF-7R细胞中BIK和NOXA的表达来评估它们在乳腺癌细胞耐药性中的作用。Western blot分析证实了转染效率（图). 正如预期的那样，BIK或NOXA的过度表达降低了PTX存在下的细胞存活率，使MCF-7R细胞具有更高的药物敏感性（图). PTX治疗后，BIK或NOXA的过度表达也增强了MCF-7R细胞的凋亡（图)表明BIK或NOXA可减弱MCF-7R细胞的耐药表型。
BIK和NOXA均参与H19介导的耐药途径(一个)用BIK（pEGFP-BIK）或NOXA（pEGFP-NOXA）表达载体或对照载体瞬时转染MCF-7R细胞。Western blot分析检测BIK或NOXA的表达水平。(B类)对这些转染的MCF-7R细胞进行的MTT分析表明，BIK或NOXA的过度表达显著提高了这些细胞对PTX的敏感性。(C类)用200 nM PTX处理转染有BIK或NOXA表达载体或对照载体的MCF-7R细胞，然后采集细胞进行凋亡分析。(D类)将H19表达质粒与BIK过表达质粒或NOXA过表达质粒一起转染MCF-7S细胞。用不同浓度的PTX处理细胞，并用MTT法检测其活力。BIK过表达或NOXA过表达降低了H19介导的耐药性。
我们通过将H19和BIK或NOXA表达质粒共同转染到MCF-7S细胞中，进一步研究了BIK和NOXA是否为H19的下游分子。BIK的过度表达部分抑制了H19过度表达的影响，并使MCF-7S细胞对PTX敏感（图). 在联合转染H19和NOXA表达载体的MCF-7S细胞中观察到类似的结果（图). 这些过度表达和敲除研究都证实了BIK和NOXA是H19的重要下游靶点，并证实了这两个基因在H19介导的乳腺癌细胞PTX耐药性中的强烈参与。
H19以EZH2依赖方式导致BIK的表观遗传沉默
我们先前证实H19在乳腺癌中抑制BIK和NOXA的转录，但其潜在机制尚不清楚。先前的研究报道，lncRNA H19通过与EZH2结合抑制膀胱癌靶基因的表达[25]。多梳蛋白EZH2是一种组蛋白甲基转移酶，在组蛋白H3的赖氨酸27处产生三甲基化。启动子区高水平的H3K27me3被认为是表明基因转录受到抑制的表观遗传标记。因此，使用ChIP分析检查H3K27me3在BIK和NOXA启动子区域的修饰状态，以确认H19负责表观遗传沉默。如图所示和，BIK启动子区显示出响应H19表达改变的动态修饰模式。H19的高表达促进了MCF-7细胞中BIK启动子区的H3K27me3修饰，而不是NOXA启动子的修饰。
H19表观遗传沉默的BIK以EZH2依赖方式(一个和B类)对转染H19表达质粒或H19-靶向siRNA的细胞的定量ChIP分析表明，H19表达的改变改变了BIK启动子的H3K27me3修饰，但不改变NOXA启动子。(C类和D类)从这些转染细胞获得的定量ChIP分析表明，H19表达的改变改变了EZH2与BIK启动子的关联，但没有改变与NOXA启动子的联系。(E类)在MCF-7R细胞中进行RIP实验，并对共沉淀RNA进行H19的qRT-PCR。H19在EZH2 RIP中的折叠富集相对于其匹配的IgG对照RIP表达。(F类)实时PCR分析表明，转染H19表达质粒的MCF-7S细胞BIK mRNA水平降低，而EZH2基因敲除显著抑制H19诱导的BIK下调。(G公司)用H19表达质粒和EZH2靶向siRNA转染MCF-7S细胞。定量ChIP分析表明，EZH2-敲除抑制了H19介导的EZH2/H3K27me3与BIK启动子的结合。(H（H）)从这些转染细胞获得的MTT结果表明，EZH2的敲除降低了H19过度表达对MCF-7S细胞耐药性的影响。
然后，我们通过对H19-过度表达MCF-7S细胞的Q-ChIP分析，确认了NOXA和BIK启动子在EZH2占据中对H19的需求。如图所示当H19丰富时，与BIK启动子结合的EZH2较高。相比之下，H19的过度表达并没有增加EZH2在NOXA启动子上的占有率。在H19敲低的MCF-7R细胞中观察到相应的结果。H19表达的减弱降低了EZH2在BIK上的占有率，但不降低NOXA启动子的占有率（图). 我们还证实了H19在乳腺癌细胞中与EZH2结合。如图所示内源性H19在抗EZH2 RNA免疫沉淀（RIP）组分中富集，但在IgG组分中不富集。
通过检测EZH2能否逆转H19诱导的BIK失活，我们进一步研究了lncRNA H19对BIK表观遗传失活的EZH2-依赖性。将H19导入MCF-7S细胞显著降低BIK表达，而EZH2敲除消除H19诱导的BIK抑制作用（图). H19诱导的EZH2结合占有率上调和BIK启动子区H3K27me3修饰被伴随的EZ82敲除所逆转（图).
然后，我们用H19表达质粒转染MCF-7S细胞，并用EZH2靶向siRNAs，用不同浓度的PTX处理这些细胞，从而证实H19-BIK介导的化疗耐药性依赖于EZH2。MTT分析显示EZH2敲除部分抑制H19的作用，并使MCF-7S细胞对PTX敏感（图). 综上所述，这些结果表明H19对BIK的表观遗传沉默依赖于EZH2。
H19介导的ERα诱导的乳腺癌PTX耐药性
本研究仅在ERα阳性PTX耐药乳腺癌细胞系（MCF-7和ZR-75-1）中观察到H19的高表达；因此，我们认为ERα可以激活H19的表达。我们通过使用Oncomine分析已发表的患者数据来评估ERα和H19之间的关系。Lu的乳腺癌数据集，包含129个样本[28]在ERα阳性中H19表达较高(n个=76）比ERα负(n个=53）乳腺癌（图)，这表明ERα可能参与了化疗耐药癌细胞中H19的上调。MCF-7S中ERα的过度表达上调H19和下调BIK转录（图). 相反，ERα抑制剂ICI对ERα的抑制显著降低H19并增加BIK表达（图).
H19介导的ERα诱导乳腺癌PTX耐药(一个)ER-阳性和ER-阴性乳腺癌（Oncomine）患者肿瘤组织中H19的表达水平。(B类)用ERα表达载体或对照载体瞬时转染MCF-7S细胞。Western blot分析检测ERα（上部）的表达水平。实时PCR检测H19和BIK（较低）的mRNA水平。(C类)Western blot分析检测ERα抑制剂处理的MCF-7R细胞中ERα的表达水平。实时PCR检测H19和BIK（较低）的mRNA水平。(D类)将ERα表达质粒或ERα表达载体与H19靶向siRNA一起转染MCF-7S细胞。
据报道，ERα是一种强大的化疗耐药因子[29]。因此，我们检测了H19可能参与ERα介导的耐药途径。具体来说，我们测试了H19的敲除是否可以拯救ERα诱导的耐药性。如图所示抑制H19表达抑制ERα过度表达的影响，并使MCF-7S细胞对PTX致敏。这些结果综合起来表明，ERα促进了乳腺癌细胞中H19的表达，并支持H19作为ERα诱导耐药的重要介质。
讨论
获得耐药性是阻碍癌症治疗成功的主要障碍之一。以往研究化疗耐药的分子基础往往集中于编码基因及其蛋白产物的功能。然而，最近的研究越来越强调lncRNA作为基因调控网络的组成部分的重要性。因此，需要更多的研究来阐明lncRNA在耐药性中的潜在作用。我们在本研究中的发现表明，lncRNA H19的高表达可能通过抑制促凋亡途径降低乳腺癌细胞对化疗的敏感性。
细胞凋亡是化疗过程中最常见的激活途径。因此，细胞凋亡的破坏促进了多药耐药。Bcl2家族成员是细胞凋亡的关键调节器。我们确定Bcl2家族的两个成员BIK和NOXA为H19的靶点（图)，通过显示BIK或NOXA的异位表达逆转了H19介导的PTX抗性（图). BIK和NOXA都是位于线粒体外膜上的BH3唯一促凋亡蛋白，似乎是凋亡的关键效应器[30，31]。H19抑制BIK和NOXA可降低乳腺癌细胞的凋亡及其对药物的敏感性。此前的一项研究报道，阻断H19表达可诱导细胞凋亡[15]表明H19是细胞凋亡途径的直接调节器。此外，肝细胞癌细胞中H19相关的化疗耐药与MDR1的诱导有关[14]。然而，在本研究中，H19的敲除显著逆转了对非P-糖蛋白底物药物的耐药性（图)表明H19通过调节基本细胞活性而不是通过药物流出诱导乳腺癌化疗耐药。
表观遗传改变是癌症的一个特征，异常的组蛋白修饰模式导致抑癌基因异常沉默。EZH2是多梳抑制复合物2（PRC2）的关键成分，PRC2是组蛋白甲基转移酶（HMT）的一种类型。EZH2负责生成组蛋白H3赖氨酸27三甲基化，这种修饰总是与转录抑制的染色质相关。据报道，一些lncRNAs将PRC2复合物招募到特定位点并抑制靶基因表达[32–34]。在本研究中，我们证明H19可以招募EZH2，催化BIK启动子区H3K27的三甲基化，并抑制基因转录。
BIK是Bcl2家族的成员，是一种肿瘤抑制因子，其表达受到包含BIK基因座的染色体缺失或几种人类癌症中DNA甲基化的阻止[35–37]。我们发现，H19和EZH2诱导的H3K27me3组蛋白修饰也可以沉默BIK。因此，通过抑制这些lncRNAs或通过DNA甲基转移酶（DNMTs）/组蛋白甲基转移酶抑制剂去除表观遗传标记来恢复BIK表达，可能是治疗难治性乳腺癌的潜在治疗策略。
lncRNA介导的转录调控的分子机制很复杂。LncRNAs可以通过多种方式下调基因表达，包括通过与HMT或DNMT结合建立抑制性染色质状态，从而改变组蛋白修饰和DNA甲基化，以及通过RNA-RNA相互作用调节靶mRNA稳定性或翻译效率[38–41]。lncRNA H19的另一个靶点NOXA也编码Bcl2家族的促凋亡蛋白，但我们没有发现由于H19诱导的H3K27me3修饰而抑制NOXA转录。我们认为H19通过其他尚未确定的机制抑制NOXA转录。需要进一步研究以确定NOXA在乳腺癌化疗耐药中下调的原因。
乳腺癌中H19的异常表达可能通过多种机制引起，包括染色体异常、转录因子结合和表观遗传学改变。在这里，我们发现H19被ERα上调。以前的报告显示，ER阳性肿瘤更容易对化疗药物产生耐药性。已经提出了几种机制来解释ERα介导的耐药性，包括抑制凋亡和增强P-糖蛋白表达[21，42]。此前的研究甚至确定，雌激素饥饿或富尔维斯坦治疗会强烈诱导BIK mRNA和蛋白[43]。我们认为ERα-H19-BIK轴可能是治疗ERα阳性、化疗耐药乳腺癌患者的一个新的治疗靶点。尽管已确定ERα是H19的上游分子，但我们也关注ERβ和孕酮受体（PR）在耐药乳腺癌细胞中的表达。Western blot分析显示，与MCF-7S细胞相比，MCF-7R中ERβ的表达没有改变，而耐药细胞中PR上调(补充图S1A和S1B). 这表明PR可能与H19相关的乳腺癌化疗耐药有关。进一步研究PR对lncRNA H19转录调控的潜在作用将非常有趣。
本研究的目的是确定化疗耐药的新机制，为更有效的治疗奠定基础。总之，我们表明H19是导致乳腺癌耐药的重要因素，H19和EZH2介导的表观遗传调控参与了化疗耐药的获得。因此，针对调节信号轴ERα-H19-BIK的治疗可能会提高乳腺癌化疗的整体疗效。
材料和方法
细胞培养
从ATCC中获得人MCF-7和ZR-75-1乳腺癌细胞系。通过用紫杉醇对MCF-7和ZR-75-1细胞进行脉冲选择，建立了耐PTX的MCF-7R和ZR-75-1R细胞系；亲本细胞系命名为MCF-7S和ZR-75-1S。MCF-7S和MCF-7R细胞在添加10%FBS、胰岛素（0.2 U/ml）、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的MEM中培养，而ZR-75-1S和ZR-75-1 R细胞在含有10%FBS，100 U/m1青霉素和100U/ml链霉素的DMEM中培养。
乳腺癌细胞的转染
根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将siRNA寡核苷酸或质粒转染乳腺癌细胞。H19的siRNA核苷酸序列为CCAAACAAAGACACAU，EZH2的为GAGGUUCAGAGAGCUGAUU。靶基因和阴性对照（si-con）的siRNA购自Invitrogen。ERα表达载体在我们之前的工作中有描述[42]。将含有其各自全长编码序列的BIK和NOXA表达载体克隆到pEGFP-N3载体中，用于表达EGFP-BIK或EGFP-NOXA融合蛋白。将H19表达载体克隆到pcDNA3.0中。
RNA提取和qRT-PCR分析
根据制造商的方案，使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。根据制造商的说明（Vazyme），通过逆转录1μg总RNA制备cDNA。为实时荧光定量PCR设计的引物序列如下：H19-F，ATCGGTGCCTCAGCGTCGG；H19-R，CTGTCCTC GCCGTCACACCG；PUMA-F，中国民航总局；PUMA-R，AGTCCCATGAGAGATGTAC ATGAC；NOXA-F、GCAGAGCTGAAGTCGAGTGT；NOXA-R、CTCTTTTGAAGGAGTCCCTCAT；BAK-F，GCTCCCAACCATTCACTAC；BAK-R，TCCCTACTC CTTTTCCCTGA；BMF-F，CCACAGCCAGAGAGAC AAAG；BAX-F，TGGAGCTGCAGAGGATGATG公司；BAX-R，GAAGTTGCCGTCAGAAAAACATG公司；BIM-F，AGCCGAGACCACCACGAA；BIM-R，GCTCCCTC CTTTACATTCAACAA；BOK-F，GGCCCAGGTC TACCGCAA；博克-R，CGCATACAGGACACCT；投标-F，CCATAAGGAGGAGCGGGTAG；BID-R，CG TTGTTGACCTCAGTCCA；BIK-F、GACCATGGAG GTTCTTGGCA；BIK-R、AGGCTCACGTCCATCTCGTC。
蛋白质印迹分析
总蛋白提取物是由躺在冰镇裂解缓冲液中的细胞获得的。蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到PVDF膜（Bio-Rad）。在5%脱脂牛奶中封闭1小时后，将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜。在TBST中清洗膜3次10分钟，并在室温下与HRP结合的二级抗体孵育1小时。在TBST中洗涤3次10分钟后，用ECL检测系统观察蛋白质。EZH2抗体购自Millipore，ERα抗体购自Santa Cruz，β-actin抗体购自Sigma-Aldrich。
生存曲线
将细胞以每孔8000个细胞的密度接种在96孔板中。第二天，用分级浓度的PTX、EPI或DDP处理细胞48小时。培养结束时，用MTT法测定细胞活力，如前所述[44]。所有测量均一式三份。
细胞凋亡测定
按照制造商的说明，使用凋亡检测试剂盒（Keygentech）进行凋亡分析。简单地说，收集细胞，用PBS洗涤两次，然后轻轻地重新悬浮在500μl结合缓冲液中。在添加5μl Annexin V-FITC和5μl碘化丙啶（PI）后，在室温下在黑暗中培养细胞15分钟，然后在FACScan仪器上进行即时流式细胞术分析（Becton Dickinson）。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
使用ChIP分析试剂盒进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析，基本上如制造商（Millipore）所述。简而言之，1×107将细胞在37°C的1%甲醛中固定10分钟。然后裂解细胞，超声处理产生200–1000 bp的片段，并与抗体在4°C下孵育过夜。在65°C下反向交联5小时，然后分离DNA。根据提供的说明，使用SYBR Green实时PCR Master Mix（Vazyme）通过实时PCR对ChIP产品进行定量分析。EZH2抗体来自Abcam，H3K27me3抗体来自Millipore。qChIP的序列如下：NOXA-F，GTTGCCTAAGGTTTAGCCAG；NOXA-R、TCCAGGCTCATTTGACTTACC；BIK-F，CAAGCTTGCACAGCAGAGCGG；BIK-R，TGGCATTGG CAACAGAACC公司。
RNA免疫沉淀（RIP）分析
根据制造商的说明，使用Magna RIP™RNA-结合蛋白免疫沉淀试剂盒（Millipore）进行RIP实验。EZH2抗体来自Abcam。用反转录PCR检测共沉淀RNA。总RNA为输入对照。
统计分析
所有实验都重复了三次。平均值之间的统计差异用t吨-测试。数值表示为三次测量的平均值±标准误差。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
确认和资金
本研究得到了国家自然科学基金（81172091号）、国家自然科学项目（81301897号）、南京大学药物生物技术国家重点实验室开放基金的资助，江苏省高校研究生创新研究计划（CXZZ13_0561）。
参考文献
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