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自然。作者手稿；PMC 2011年11月2日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然。2010年6月24日；465(7301): 1033–1038.
数字对象标识：10.1038/自然09144
预防性维修识别码：项目经理3206313
尼姆斯：美国国立卫生研究院235496
PMID：20577206

基因和假基因mRNA的编码无关功能调节肿瘤生物学

劳拉·波利塞诺，1,†* 莱昂纳多·萨尔梅纳，1,* 张江文，2 布雷特·卡弗，三 威廉·哈夫曼，1和保罗·潘多尔菲码头1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

信使RNA（mRNA）的典型作用是向蛋白质合成位点传递蛋白质编码信息。然而，鉴于microRNA与RNA结合，我们假设RNA在癌细胞中具有生物作用，这依赖于它们竞争microRNA结合的能力，并且独立于其蛋白编码功能。作为RNA的蛋白编码依赖性作用的范例，我们描述了由PTEN公司抑癌基因及其假基因(PTENP1公司)以及这种互动的关键后果。我们发现了PTENP1公司具有生物活性，这取决于其调节PTEN细胞水平的能力，并且可以发挥生长抑制作用。我们也证明了这一点PTENP1公司该基因在人类癌症中选择性丢失。我们将我们的分析扩展到其他具有假基因的癌症相关基因，如致癌KRASPTEN公司也具有生物活性。总之，这些发现赋予了表达的假基因一种新的生物学作用，因为它们可以调节编码基因的表达，并揭示了mRNA的非编码功能。

在人类癌症中PTEN公司第二个等位基因的缺失或突变在表现时普遍存在，而除晚期癌症外，在低频率下观察到完全缺失1.在小鼠模型中铂族导致多种癌症2，并对铂族剂量对上皮癌的发病率和严重程度有重要影响三，4，共同表明PTEN公司是一种功能上单倍体的肿瘤抑制基因。众多PTEN公司-靶向microRNAs表明转录后调控在决定癌细胞PTEN丰度中起着关键作用5–11。细胞对PTEN丰度的细微下降都非常敏感，因此强调了微RNA介导的PTEN调节在癌症中的重要性4因此，我们推断PTEN与其假基因之间的关系PTENP1公司(PTH2/ψPTEN)12可能是对我们假设的有力检验(图1a).

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PTENP1公司目标是PTEN公司-靶向microRNA

a。工作假设：PTEN公司通过以下方式防止microRNA结合PTENP1公司microRNAs：彩色波形条；5'和3'UTR：开放矩形；开放阅读框：填充矩形。b。 PTEN公司(上面的)和PTENP1公司(降低)3'UTR包含一个高度保守（深灰色）的结构域，然后是一个不太保守的（浅灰色）结构域。PTEN公司-靶向microRNA种子在高同源性区域内的匹配在PTEN公司和PTENP1公司.c。的绑定PTEN公司-靶向microRNAPTENP1公司.种子和种子匹配：粗体；标准对：实线；非规范对（G:U）：虚线。d。 PTEN公司-瞄准miR-19b型和20英里减少PTEN公司和PTENP1公司mRNA丰度。e、。 miR-17型和miR-19家族抑制剂降压PTENP1公司丰度（左）.PTEN公司用作阳性对照（右）.d日和e（电子）平均值±标准差，n≥3。

假基因被定义为基因组基因座这类基因与真基因相似，但在生物学上却被认为无关紧要，因为它们含有过早的终止密码子、缺失/插入和移码突变，这些都会使其转化为功能蛋白的功能失效。然而，假基因中包含的核苷酸序列保存完好，这表明存在维持这些遗传元素的选择性压力，它们可能确实在细胞中发挥重要作用。

假基因以加工或非加工遗传元素的形式存在。非加工假基因来源于遗传重复，而加工假基因是通过逆转录转座子产生的；因此，它们不包含内含子，但它们通常与祖先的基因共享5’和3’UTR序列13.假基因几乎与编码基因一样多，在“转录组”中占很大比例14尽管缺乏典型启动子，加工假基因利用近端调控元件来调节其转录15.其转录具有组织特异性16在癌症中异常激活17，18这表明假基因可能有助于致癌，尽管其机制仍不清楚。到目前为止，很少有假基因具有功能特征13.

MicroRNAs是一大类非编码小RNA（ncRNAs），已成为细胞生物学和病理生理学中的关键元素。微RNA已被证明影响几乎所有的细胞过程和细胞类型，从植物到人类19microRNAs通过退火到编码序列或靶基因转录物3'UTR上的互补位点来发挥作用，在那里它们促进蛋白质复合体的补充，从而损害翻译和/或降低mRNA的稳定性，导致靶蛋白丰度的降低19–22生理学上，microRNA的异常表达与人类疾病和癌症有因果关系23.

我们已经测试了假基因衍生RNA转录物和mRNA转录物在癌症中是否具有积极的生物学作用，这种作用独立于其蛋白编码功能，但依赖于它们竞争microRNA结合的能力，从而调节microRNA靶点的去表达(图1a).

PTENP1公司目标是PTEN公司-靶向microRNA

PTENP1公司是位于9p13.3的加工假基因；它与PTEN公司，整个编码序列中只有18个不匹配。起始甲硫氨酸密码子的错义突变阻止翻译12.PTENP1公司拥有3'-UTR，比PTEN公司(图1b). 相对于其与PTEN公司3'UTR：高同源性（~95%）5'区域和低同源性（<50%）3'区域(图1b，补充图1). 在高同源性区域内，我们发现了与PTEN公司-瞄准miR-17型，miR-21型，miR-214、miR-19和miR-26家庭(图1c，补充图1). 测量这些microRNAs在两者上的作用PTEN公司和PTENP1公司表达，我们在非同源3'UTR区域设计了特异的PCR引物集(补充图2a、b). 在DU145前列腺癌细胞中，PTEN公司-靶向microRNAmiR-19b型和miR-20a型抑制两者PTEN公司和PTENP1公司mRNA丰度(图1d，补充图3a). 在这些细胞中，一组内源性表达的抑制剂PTEN公司-靶向微小RNA(补充图3b)二者都被脱稿了PTEN公司和PTENP1公司转录水平(图1e). 嵌合荧光素酶质粒的使用表明microRNA：PTENP1公司互动是直接的(补充图4a–c). 这些数据表明PTENP1公司和PTEN公司受到相同的microRNA介导的转录后调控。

的3'UTRPTENP1公司具有抑瘤活性

我们检查了PTENP1公司3'UTR作为诱饵PTEN公司-使用表达3'UTR的逆转录病毒载体靶向microRNA(补充图5a). 3'UTR可以转录，但不能编码蛋白质；然而，它仍然可能发挥生物作用。事实上，PTENP1公司3'UTR过度表达导致PTEN转录和蛋白的去表达(图2a，补充图5b和10摄氏度). 与PTEN升高一致，用EGF刺激细胞后AKT磷酸化降低(图2b). 这些分子观察伴随着生长抑制(图2c，补充图5c和10天)半固体培养基中产生的菌落数量显著减少(图2d).

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PTENP1公司3'UTR作为诱饵发挥肿瘤抑制功能PTEN公司-靶向microRNA

a–c。清管器/ψ3'UTR-感染的DU145细胞显示(一)增加PTEN公司mRNA和蛋白质水平(b条)EGF刺激后phosho-AKT水平降低(c（c）)增殖率降低。d。感染DU145细胞的半固体培养基中的生长清管器，清管器，清管器/ψ3'UTR或清管器/PTEN.e、。 PTEN公司转染后24小时mRNA水平pCMV/ψ3'UTR在亲代HCT116或HCT116-DICER−/−细胞中。数据标准化使用pCMV病毒empty转染细胞。f、。转染对照siLuc、si-PTEN/PTENP1、si-PTEM或si-PTENP1的DU145细胞的生长曲线。g、。信使核糖核酸水平PTEN公司(左边)和PTENP1公司(正确的)转染siLuc（白色）、si-PTEN/PTENP1（蓝色）、si-PTEN（黑色）和si-PTENP1（红色）后24小时。i、。转染所指示的siRNA后48小时PTEN的蛋白质印迹。一，c、 d日，e（电子），（f）和g、。平均值±标准差，n≥3。

对PTEN公司丰度PTENP1公司HCT116-DICER抑制了3'UTR过度表达−/−结肠癌细胞(图2e). 在这些细胞中，DICER（催化microRNA成熟的最后一步的酶）的破坏导致成熟microRNA水平低于亲本HCT116细胞24这反过来支持了以下概念：PTENP1公司需要成熟的microRNA来实现PTEN公司.

检查PTENP1公司下调监管，我们设计了定制的siRNA池（Dharmacon），专门针对PTENP1公司（si-PTENP1）或PTEN公司（si-PTEN）表达(补充图6)由于商用si-RNA池PTEN公司（si-PTEN/PTENP1）绑定到中的公共序列PTEN公司和PTENP1公司(补充图7a). si-PTENP1转染加速了细胞增殖，表明PTENP1公司尽管以较低的相对水平表达，但可以在DU145细胞中发挥生物活性(图2f). si-PTEN/PTENP1，使两者都沉默PTEN公司和PTENP1公司，显示出最强的作用，表明PTEN及其假基因可能对生长抑制具有加性作用。PTENP1公司击倒导致下降PTEN公司mRNA和蛋白质丰度(图2g–h)，反映了过度表达PTENP1公司3英尺UTR(图2a).

在DU145电池中PTENP1公司与PTEN相比，3'UTR是一种更有效的生长抑制剂(图2d，补充图5c). 这一结果可以用以下事实来解释：PTENP1公司作为诱饵的功能还将其他靶点与肿瘤抑制活性结合。例如miR-17型家族目标E2F1和p2125、和miR-21型目标PDCD426因此，miR-17型和miR-21型模拟物增加PTEN公司-空PC3细胞(补充图8a)，表明PTEN独立。事实上，si-PTENP1不仅导致PTEN的剂量依赖性下调，还导致p21的剂量依赖型下调(补充图8b). 此外，si-PTENP1和si-PTEN/PTENP1都能够抑制PTENP1公司并以剂量依赖的方式增加增殖PTEN公司-空PC3细胞(补充图8c–d). 相反，稳定感染PTENP1公司PC3细胞中的3'UTR抑制病灶形成(补充图8e)，支持以下概念PTENP1公司其3'UTR发挥的肿瘤抑制作用超出了PTEN公司只有富足。

的表达和损失PTENP1公司在人类癌症中

PTEN公司和PTENP1公司利用定制的Taqman探针（参见方法，补充图2c). 在正常组织和前列腺肿瘤阵列中(对=0.8087，第页<0.0001和对=0.3960，第页=0.0013，分别）PTEN公司和PTENP1公司表达表明它们可能是共同调节的(图3a-b). 这一发现支持了我们的分子观测PTENP1公司可以调节PTEN公司表达式。PTENP1公司被发现有不同程度的丰富，在某些情况下表达水平高于PTEN公司.

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损失PTENP1公司在癌症中

a–b。的表达式级别PTEN公司(黑色)和PTENP1公司(红色)在一组正常人体组织中(一)前列腺肿瘤样本(b条). 线性回归PTEN公司与PTENP1公司表达式显示在左上角。c。Affymetrix Human SNP Array查询的48例散发性结肠癌样本的聚类分析。d。Affymetrix人类外显子1.0 ST阵列归一化的热图和聚类分析PTEN公司强度值。e、。对数比图PTENP1公司日志10的副本号（CN）PTEN公司表达强度。最佳拟合线表示两个总体的回归分析。相关系数（r）衡量可靠性，p值衡量x和y之间相关性的统计显著性。

接下来，我们检查了PTENP1公司基因组位点。挖掘了几个基于阵列的比较基因组杂交数据库，包括癌症工作台(https://cgwb.nci.nih.gov/cgi-bin/heatmap)和NCBI GEO(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). (补充图9a–b，表S1). 值得注意的是，在散发性结肠癌的数据集中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi？acc=GSE16125标准) (图3c–e)，层次聚类确定了一个明确的样本群体，其可检测拷贝数（CN）丢失具体发生在PTENP1位点(图3c). 重要的是，这些CN损失是重点损失，与9便士的巨额损失无关，与CDKN2A位点(补充图9c). 该数据集正式证明了在PTENP1位点，支持以下概念PTENP1公司发挥肿瘤抑制功能，并在选择性压力下承受癌症CN损失。

在同一患者样本集中PTEN公司与正常结肠样本相比，其表达下调(第页=0.0008156;图3d). 的回归分析PTENP1公司CN随表达水平的变化PTEN公司确定了两个离散的患者群体，其中PTENP1公司CN变化和PTEN公司表达直接且显著相关（人群1：对=0.6015，第页=0.0092; 人口2：对=0.6056，第页=0.0129) (图3e). 两者之间存在直接关系PTENP1公司CN和PTEN公司表达支持我们的假设PTENP1公司转录水平可以调节PTEN公司表达式。这些发现共同证明了PTENP1公司.

内源性信使核糖核酸介导生物学的一般模型

根据我们的结果，我们预计PTEN公司3'UTR也具有生物活性。事实上，我们发现PTEN公司3'UTR可以卸压PTENP1公司丰富，如PTENP1公司在上执行PTEN公司(图4a，左侧和补充图10a-c）。重要的是，PTEN公司3'UTR过度表达伴随着生长抑制，这表明PTEN公司通过3'UTR发挥肿瘤抑制活性，至少部分(图4a、右侧和补充图10d).

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PTEN公司3'UTR和KRAS1P公司3'UTR作为诱饵的功能和内源性microRNA诱饵机制的一般模型

a。 PTENP1公司空质粒转染24h后mRNA水平pCMV病毒或pCMV/PTEN3'UTR基因DU145细胞中的质粒(左边)和增长曲线(正确的).b。 KRAS公司空质粒转染24h后mRNA水平pCMV病毒或pCMV/K1P3’UTR型DU145细胞中的质粒(左边)和增长曲线(正确的).c（c）。型号。X和Y是相同microRNA靶向的不同转录物。处于稳定状态(中间的)，microRNA分子与其靶X和Y之间存在平衡(左边)导致与Y结合的microRNA分子的可用性增加，从而降低其丰度。相反，X的过度表达(正确的)导致与Y自由结合的microRNA分子减少，因此Y丰度增加。红色矩形：microRNA分子。X和Y可以是假基因及其同源蛋白编码基因。一和b。平均值±标准差，n≥3。

扩展我们的研究范围PTEN公司以及它的假基因，我们检测了其他与癌症相关的假基因和基因(表S2和第3章，补充图11-17). 基因和假基因序列的比对表明，微小RNA结合位点是非常保守的；例如miR-145型绑定站点华侨城4号及其假基因OCT4-pg1型，三，4和5(补充图11a);miR-1型家族结合位点康奈辛43(CX43系列)及其假基因(补充图11b). 尤其是，OCT4-pg1型和-第5页只在癌组织中表达，在正常组织中不表达17.此外OCT4-pg5型在5'端截断，仅表示部分开放阅读框区域，后跟3'UTR27。此类保护的其他示例包括：miR-34型上的家族绑定站点CDK4PS系列(补充图12);miR-182型绑定站点FOXO3B公司(补充图13);miR-17型家庭绑定站点位于E2F3P1型(补充图14);miR-143基因和let-7家族结合位点KRAS1P公司(补充图15).

自3'UTRPTENP1公司像它的亲本基因一样抑制生长PTEN公司，我们假设KRAS公司及其假基因KRAS1P公司的确，KRAS1P公司DU145细胞中3'UTR过度表达导致KRAS公司mRNA丰度(图4b、左侧和补充图18a、b)并加速细胞生长(图4b，右侧）。我们还发现KRAS公司和KRAS1P公司转录水平与前列腺癌呈正相关(补充图18c). 值得注意的是KRAS1P基因座在不同的人类肿瘤中，包括神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和肝细胞癌，6p11-12被扩增28–30这些发现共同指出了KRAS1P公司，并支持伪基因功能反映其同源基因功能的概念，如microRNA诱饵机制所解释的。

讨论

这项研究的发现使我们得出了一些重要结论。首先，伪基因microRNA-decoy功能的发现将这些转录物确定为生物活性单位。我们证明了这一点PTENP1公司和KRAS1P公司影响其同源基因的水平，并可能参与疾病的发病机制。因此，需要系统地分析肿瘤发生中的假基因表达水平和基因组状态，以进一步了解疾病进展。

以前有报道称，小鼠卵母细胞中经过处理的假基因会产生内源性小干扰RNA（endo-siRNAs），通过常规RNA干扰下调同源基因的表达31然而，体细胞内siRNA的产生尚待鉴定32值得注意的是，虽然只有少数假基因进行反义转录，但所有转录的假基因原则上都可以与同源基因竞争微RNA结合。类似地，假基因的microRNA-decoy能力可能比其分裂为piRNAs的能力更广泛，piRNAs-最近仅在包括小鼠在内的许多生物体的生殖细胞中发现33.

我们还证明了假基因PTENP1公司即使在低水平表达时，也能解除同源基因的表达(补充图3a和图2f–h). 我们认为假基因是其祖先基因的“完美诱饵”，因为它们保留了许多microRNA结合位点，并且可以同时竞争许多microRNAs的结合。据推测，次优的“假靶点”可能与真实靶点竞争microRNA结合34相反，我们认为假基因在microRNA网络中具有固有的生物活性，因为它们是合法的microRNA靶点，并与其他合法靶点竞争microRNA结合(图2e). 这一观点得到了植物中通过表达非蛋白编码基因来隔离microRNA的“目标模拟”过程的证实35.

外源性给药的微小RNA海绵最近成为微小RNA的有效和特异性抑制剂36，37假基因的作用类似于“内源性海绵”，能够影响微RNA分子在其所有靶点上的分布。它们可能特别有效，因为它们是非编码的，因此活性翻译不会干扰microRNA结合38.

假基因调节细胞生物学的能力超出了其调节同源基因水平的能力(补充图8). 这一现象与每个microRNA都有多个靶点的事实相一致，可以导致广泛的稳态效应。此外，考虑到单个基因通常具有许多差异调节的假基因(例如OCT4，NPM1型(补充图11a、17)和核糖体蛋白假基因39)这样的网络可能会变得错综复杂。

细胞microRNA的丰度由总基因组CN及其生物生成过程决定40。关于成熟microRNA活性的调节，人们知之甚少。microRNAs可以通过脱氨作用增加靶向mRNAs的谱41，同时缩短3'UTR42多态性可以阻止microRNA与mRNA结合43伪基因介导的微小RNA诱饵提供了一个新的维度来调节微小RNA与其靶标之间的串扰。事实上，蛋白质编码基因的假基因数量越多，它就越容易受到微RNA的保护。

我们发现了PTENP1公司与PTEN生物学相关，因为PTEN的微小变化可能会导致致瘤后果三。在我们的分析中，我们发现PTENP1公司正向调节PTEN公司水平。此外，我们发现PTENP1位点人类癌症中CN减少，这与PTEN公司; 因此，我们建议PTENP1公司是一个真诚地肿瘤抑制基因。有鉴于此，必须开发更好的工具来检测癌症中假基因的丰度。例如，假基因包括PTENP1公司已经被忽视到这样的程度，以至于在一些微阵列平台中缺乏伪基因特异性探针(补充图7b).

我们发现的一个重要暗示是，诱饵机制可能不仅限于假基因，还可能包括其他长ncRNA转录物，包括核糖体RNA、lincRNA和编码基因mRNA39，44(图4a和补充图10). 超越其功能顺式影响自身转录本稳定性的监管因素，UTR也反式通过微RNA结合调节基因表达。此外，由于microRNA的结合位点也位于开放阅读框序列中21编码基因的整个转录本，不仅3'UTR可能具有诱饵功能（参见工作模型：图4c).

正如我们的模型所表明的，引入细胞的信使核糖核酸可能会干扰微小核糖核酸与其多个靶点之间的相互作用，因此具有独立于其编码的蛋白质翻译的生物活性45重要的是，这同样适用于内源性mRNA水平的转录诱导或抑制，这可能导致细胞内mRNA分子数量发生几个数量级的变化46.

我们的研究结果表明，在研究导致“通读”或融合转录物的特定无义或移码突变和基因组改变时，必须考虑这种新的RNA调节生物维度。例如，染色体融合事件，如APL的t（15；17）易位PML-RAR公司α和风险调整比率α-PML公司黑色素瘤中的融合转录本或反复“阅读”转录本CDK2-RAB5B型可以通过异常的microRNA“海绵”活性发挥致癌活性47，48这种现象也可能是体细胞基因组重排的结果，这在许多癌症中是一种严重未被认可的事件49此外，在人类癌细胞中观察到的3'UTR缩短42不仅会影响微RNA依赖的mRNA调节，而且反过来也会改变特定RNA转录物的“海绵”能力。最后，在PTEN公司-缺失相关癌症，PTEN突变的分子后果知之甚少PTEN公司与完全基因缺失相比，转录本被保留PTEN公司没有成绩单1虽然这些事件之前被认为会改变蛋白质丰度、蛋白质信号和蛋白质网络，但它们也会对细胞RNA和microRNA稳态产生重大影响。因此，在这项研究中，我们确定了一个新的维度，通过它可以调节细胞和肿瘤生物学。

方法摘要

细胞系在标准条件下培养。通过瞬时转染（si-miRNAs）检测microRNA的过度表达。PTENP1公司/PTEN公司/KRAS1P公司3'UTR过表达是通过瞬时转染实现的(pCMV病毒表达载体）或稳定感染MSCV清管器逆转录病毒结构。通过荧光素酶报告分析测定miRNA/靶相互作用。PTENP1公司，PTEN公司，KRAS公司，KRAS1P公司实时PCR检测miRNA表达水平。根据标准方案进行增殖、病灶和软琼脂试验。

方法

试剂

抗-HSP90抗体#61041（Becton Dickinson）；抗PTEN抗体#9559、抗21抗体#2947、抗Tubulin抗体#2125；siGENOME非靶向siRNA#2（siLuc）、si-PTEN、si-PETNP1、si-PPEN/PTENP1、siGLO RISC-free控制siRNA、si-miR-17、si-miR-19b、si-mi R20a、si-mi-21、si-miR-26b、si-Mi R-214、microRNA抑制剂阴性对照#1（IC）、miR-19b抑制剂、miR-93抑制剂、miR-106b抑制剂、Dharmafect 1（Dharmacon）；脂质体2000、Trizol试剂、DNAseI扩增等级、SuperScript II逆转录酶、Dulbecco改良Eagle培养基（D-MEM）、RPMI-1640、胎牛血清（FBS）（Invitrogen）；组织扫描正常组织qPCR阵列：人类主要组织（HMRT103）；组织扫描疾病组织qPCR阵列：前列腺癌II（HPRT102）（起源）；pGL3-对照，pRL-TK，双荧光素酶报告分析（Promega）；聚brene，嘌呤霉素（Sigma）；QuantiTect Sybr Green PCR试剂盒，Effectene（Qiagen）；EGF（研发）；QuikChange II XL定点突变试剂盒，Herculase Taq聚合酶（Stratagene）。

质粒

的3'UTRPTENP1公司(NM_023917)通过PCR从PC3细胞基因组DNA中扩增，并克隆到pCMV-MCS表达质粒的BamHI和XhoI位点。这样就获得了pCMV/ψ3'UTR质粒。用于PCR扩增的引物为：F 5’-GAGGAGCGTCAAAACCAGAG-3’和R 5’-TCGTCAAGTTCC-3’。的3'UTRPTENP1公司然后亚克隆到MSCV-PIG逆转录病毒载体的BglII和XhoI位点50获得PIG/ψ3'UTR质粒。的3'UTRPTEN公司(NM_000314.4号)通过PCR从HeLa细胞基因组DNA中扩增，并克隆到pCMV-MCS表达质粒的BamHI和XhoI位点。这样就获得了pCMV/PTEN3'UTR质粒。用于PCR扩增的引物为：F 5’-TAGAGCGTCAAATCCA-3’和R 5’-TGGACATGATGGATGGAT-3’。的3'UTRKRAS1P公司(NC_000006.11号)通过PCR从HeLa细胞基因组DNA中扩增，并克隆到pCMV-MCS表达质粒的BamHI和XhoI位点。这样就获得了pCMV/K1P3’UTR质粒。用于PCR扩增的引物为：F 5’-AACCAGCAAAGACAGGTGT-3’和R 5’-GTTCAATTCAACGCAGA-3’。wt之间的同源性KRAS公司其假基因在整个mRNA序列中非常高（>90%）。用于扩增的引物KRAS1P公司3'UTR包含许多错配，使其对假基因具有特异性。为了构建pGLU/ψ3'UTR嵌合荧光素酶质粒，将pGL3-Control质粒的多克隆位点从其原始位置移除并插入荧光素素酶STOP密码子（pGLU）下游的XbaI位点。PTENP1公司然后使用pGLU的SmaI和XhoI位点从pCMV/ψ3'UTR质粒亚克隆3'UTRs。使用QuikChange II XL位点定向突变试剂盒生成该质粒的突变版本（pGLU/ψ3'UTRmut）。

细胞和培养条件

在DMEM+10%FBS中培养Phoenix A、293T和PC3细胞。在角质形成细胞培养基+EGF+BPE中培养RWPE-1、PWR-1E和VCaP。22Rv1，DU145型51和LnCaP在RPMI 1640+10%FBS中生长。所有细胞系均从ATCC中获得，并在37°C的含青霉素/链霉素和谷氨酰胺的培养基中生长，在含6%CO的湿空气中2.

瞬时转染

对于si-miRNAs/microRNA抑制剂的转染，DU145（1.5×105)或PC3（1×105)在12孔培养皿中播种。第二天，根据制造商的建议，使用Dharmafect 1转染100nM siRNAs/si-microRNAs或400nM microRNA抑制剂。根据该方案，90%以上的细胞对无荧光siGLO RISC对照siRNA呈阳性反应（数据未显示）。转染细胞后的第二天进行胰蛋白酶处理，并重新接种在12孔板中，以进行后续收集和分析。

对于质粒转染，将293T和DU145接种在6cm培养皿中（2.5和3.5×105）和转染Effectene后的第二天。6小时后，将其胰蛋白酶化并接种用于各种分析。

双荧光素酶报告分析

DU145细胞以6×10的密度接种4每个24孔培养皿中的细胞数。24小时后，将720 ng的pGLU/ψ3'UTR或pGLU/ψ3'UTRmut与80 ng的pRL-TK共转染。使用Lipofectamine 2000作为转染剂。转染24小时后，测量荧光素酶活性，并按照参考文献进行标准化。7.

逆转录病毒感染

将Phoenix A细胞置于10cm聚-D-赖氨酸涂层皿中（3×106/培养皿），16小时后，使用Lipofectamine 2000转染PIG逆转录病毒质粒。48小时后，过滤含有病毒的培养基（10ml），与5ml新制备的培养基混合，补充4µg/ml聚乙烯，并添加到5×105前一天将DU145或PC3细胞放在10厘米的培养皿中。感染48小时后给予嘌呤霉素（2µg/ml）。选择细胞2天，然后用于各种分析。每天更换筛选介质。

聚合酶链式反应分析

根据制造商的说明，使用Trizol试剂提取总RNA。然后对其进行DNA酶处理和逆转录（1µg RNA/瓶）。

使用Herculase-Taq聚合酶进行常规PCR。

的实时PCR重量PTEN，PTENP1公司，KRAS公司和KRAS1P公司使用Sybr Green荧光进行。在20µl反应中使用2µl RT。肌动蛋白用作内部标准。用比较C进行基因表达的相对定量T型方法52.PTEN公司引物：F 5'-GTTACCGGCATCAAAT-3'；R 5’-CCCCC ACTTAGTGCACAGT-3’。PTENP1公司引物：F 5'-TCAGAACATGGCATACACACAA-3'；R 5’-TGATGACGTCCGATTTTCA-3’。KRAS公司引物：F 5'-ATTGTGAATGTTGGT-3'；R 5’-GAAGGTCTCAACTGAATT-3’。KRAS1P公司引物：F 5’-AAGGTTTTCTTCCAGTTCT-3’；R 5'-ATTTGGGAATTTGTGAG-3'。肌动蛋白引物：F 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'；R 5’-CTCCTTAATGTCACGCGAT-3’。

根据Ref。53进行了一些修改。简言之，使用0.05µM的微小RNA特异性RT引物和0.05µM的SNORD44 RT引物（5'-GTCGTTATCCAGTGCAGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACagtcagt-3'）为每个微小RNA建立独立的逆转录反应。然后使用Sybr Green荧光（20µl反应中2µl RT）对用作内部标准的microRNA和SNORD44进行实时PCR。对于microRNA，使用了一个特定的正向引物和通用R引物（5'-GTGCAGGTCCGAGGT-3’）。对于SNORD44，使用了5’-CGGCGGtggcgatgaggaggtacc-3’正向引物和通用反向引物。microRNA特异性RT和正向PCR引物列于补充图19实时PCR反应包括40个95°C循环15秒，然后60°C循环1分钟。用比较C进行基因表达的相对定量T型方法如上所述。

TaqMan RT PCR在HMS生物聚合物设施使用Applied Biosystems 7900 HT Fast仪器进行。

蛋白质印迹

收集并溶解细胞（50mM Tris pH8.0，1mM EDTA，1mM MgCl2，150mM氯化钠，1%NP-40，1mMβ-甘油磷酸，1mM钠三VO（旁白）4，1 mM NaF，蛋白酶抑制剂）。蛋白质（30µg/lane）在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜上。使用以下一级抗体对细胞膜进行免疫印迹：抗PTEN（1:1000）、抗p21（1:1000。用推荐的与过氧化物酶偶联的二级抗体孵育后，用增强化学发光法显示信号。使用ImageJ软件量化扫描图像。

荧光辅助细胞筛选分析

用50 ng/ml EGF处理10分钟后，从10 cm培养皿中刮取细胞，立即固定在4%PFA中，并用冰镇甲醇渗透。在PBS中用0.1%BSA复水后，用Phospho-Akt（Thr308）兔单克隆抗体-Alexa Fluor对细胞进行染色®647共轭（细胞信号）。细胞在LSRII流式细胞仪（BD）上进行分析。

细胞增殖

在选择期结束时（感染）或转染后6h，2×105将DU145细胞胰蛋白酶化，再悬浮于50ml中，接种在8组12孔板的3孔中。从第二天（d0）开始，每天用PBS清洗一次1组微孔，在室温下在10%福尔马林溶液中固定10分钟，然后在4°C的PBS中保存。第7天，所有的微孔都被结晶紫染色。用10%乙酸溶解后，在590 nm处读取外径。

Foci分析

在选择期结束（感染）或转染后6小时，对DU145或PC3细胞进行胰蛋白酶化。5 × 10三细胞被放置在10厘米的培养皿上。14-21天后，平板被结晶紫染色，并对病灶进行计数。

半固态介质中的生长

用3 ml 0.6%琼脂在DMEM中覆盖6孔培养皿，获得底层。第二天，5×104感染细胞分三次接种在2 ml 0,3%琼脂中的DMEM+10%FBS中。3-4周后以40倍放大率计数菌落。

分析PTEN公司和PTENP1公司基因组状态和表达

乳腺癌：Affymetrix GeneChip®Human Mapping 500K阵列数据集克斯7545和GSE16619从NCBI GEO下载，并使用Partek Genomic Suite（Partek Inc）进行分析，以检测基因组区域的变化和数据可视化。使用Partek分割算法对拷贝数畸变进行评分，默认参数为：平均值显著不同的相邻区域的p值截止值为0.001，任何候选区域需要最少10个探针集，最小变化幅度为0.3信噪比差，各区域探针单侧t检验的p值阈值0.01被视为显著偏离预期正常值。计算了270名HapMap正常人的所有畸变。研究包括118例乳腺癌标本和44例正常标本。

结肠癌：GSE16125标准零星结肠癌原始数据集从NCBI GEO下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/query/acc.cgi？acc=GSE16125标准). 该数据集中使用了两个芯片平台：48个散发性结肠癌样本，通过Affymetrix GeneChip（r）Human Mapping 250K Nsp SNP Array进行询问，其中36个样本通过Affmetrix Human Exon 1.0 ST Array进行分析。使用Partek Genomic Suite（Partek Inc）分析SNP阵列原始数据集，以检测基因组区域的变化和数据可视化（Partek平滑算法基于46个探针）。Affymetrix提供的HapMap项目中的48个正常样本被用作非配对参考集[http://www.affmetrix.com/support/technical/sample_data/500k_data.affx]。利用Affymetrix Power Tools（APT，v.1.12.0）分析结肠癌和正常结肠的原始外显子阵列强度CEL文件。的标准化强度值PTEN公司计算为对应于两个探针的8个探针的平均值PTEN公司特异性外显子探针组3256703和3256704。这些值由APT软件提取出来。从NCBI GEO GSE1916数据集下载了Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array正常结肠上皮细胞数据集(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE19163标准). log10之间r和p值的相关图PTEN公司表达强度和对数比率PTENP1公司副本号是在GraphPad Prism（GraphPad-Software，Inc.）中生成的。的对数比率PTENP1公司基于侧翼14个SNP探针的平均值PTENP1公司基因。

统计分析

体外使用未配对分析数据t吨-试验（GraphPad Prism，GraphPad-Software，Inc.）p<0.05的值被认为具有统计学意义*p<0.05**p<0.01***p<0.001。报告了三个或更多独立实验的平均值±标准差。回归分析和相关系数是使用GraphPad Prism，GraphPadSoftware，Inc.生成的。

补充材料

supp数据分析

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支持图

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支持表1

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支持表2

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支持表3

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致谢

我们感谢潘多尔菲实验室成员的批判性讨论，特别是A.Carracedo的批判式投入；S.Feng寻求技术援助。我们感谢Bert VogeIstein的DICER−/−细胞；T.Yuan协助FACS分析；A.Tuccoli协助microRNA RT-PCR；一、奥斯曼的支持和富有洞察力的建议。L.P.得到了Istituto Toscano Tumori和美国意大利癌症基金会的研究金支持。L.S.得到了人类前沿科学计划和加拿大卫生研究院的研究金支持。这项工作得到了NIH向P.P.P.提供的R01 CA-82328-09拨款的支持。

脚注

作者贡献

P.P.P.领导并监督该项目；L.P.、L.S.和P.P.设计实验；L.P.、L.S.和W.H.进行了实验；不列颠哥伦比亚省提供前列腺癌患者样本cDNA。J.Z.进行了所有生物信息分析。L.P.、L.S.和P.P.P.分析了数据并撰写了论文。所有作者都批判性地讨论了结果和手稿。

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