摘要
PTEN公司是一种肿瘤抑制基因，已被证明受PTEN公司假基因表达的非编码RNA，PTEN第1页在这里，我们描述了一个先前身份不明的PTEN第1页编码的反义RNA（asRNA），调节PTEN公司转录和PTEN公司mRNA稳定性。我们找到两个PTEN第1页asRNA亚型，α和β。α亚型功能在trans中，定位到PTEN公司启动子和表观遗传调控PTEN公司通过招募DNMT3a和EZH2转录。相反，β亚型与PTEN第1页通过RNA:RNA配对相互作用，通过改变PTEN第1页稳定性和microRNA海绵活性。asRNA调节网络的破坏导致细胞周期停滞，并使细胞对阿霉素敏感，这表明其各自的生物学功能PTEN第1页表达为RNA。
关键词：假基因，PTEN，PTENp1，PTENpg1，反义RNA，非编码RNA，表观遗传学，转录调控，DNMT3a，EZH2
介绍
抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN公司)是PI3K-Akt途径的负调节因子，在几种癌症中表观遗传学沉默1.剂量PTEN公司已发现其表达与上皮癌的严重程度相关2，表明PTEN公司基因对维持细胞内环境稳定至关重要。PTEN公司表达被发现在转录后受到PTEN公司假基因(PTEN第1页，也称为第1页，聚四氟乙烯2和聚四氟乙烯Ψ1)三. ThePTEN第1页是一种长的非编码RNA（lncRNA），被发现可以隔离许多PTEN公司-通过充当miRNA海绵来靶向microRNA（miRNAs）。过度表达3'UTR的miRNA海绵效应PTEN第1页lncRNA导致PTEN公司mRNA稳定性和PTEN蛋白数量增加，可能是由于miRNA从PTEN公司蛋白质编码转录本。相反，抑制PTEN第1页lncRNA释放miRNAs靶向PTEN公司从而导致PTEN公司.
表达的假基因在灵长类数百万年的进化中是保守的4传统上被认为是“非功能DNA”，散落在人类基因组中。假基因几乎和蛋白质编码基因一样多5最近的证据显示其中一些被转录成RNA三，6一种新的范式表明，一些假基因可能在转录或转录后水平上直接调节其蛋白编码对应物三，7–9。相比之下PTEN第1页介导的转录后调节PTEN公司，多潜能相关转录因子华侨城4号据报道，受反义RNA（asRNA）的表观遗传调控华侨城4号假基因57综上所述，这些先前的观察结果鼓励我们研究是否也有asRNA编码自PTEN第1页基因座以及这种asRNA在多大程度上参与表观遗传调控肿瘤抑制基因PTEN公司.
结果
这个PTEN公司假基因，PTEN第1页，编码为RNA
为了研究基因组景观和asRNA转录在PTEN第1页我们在UCSC基因组浏览器中评估了表达序列标签（EST），并对ENCODE染色质免疫沉淀（ChIP）测序数据进行了独立分析。EST读数的评估表明来自PTEN第1页轨迹(补充图1a). 此外，我们对ENCODE ChIP测序数据进行的活性转录组蛋白标记H3K4me3的存在分析表明，不同细胞系之间存在差异模式(补充图1b). 此外，H3K4me3和RNA聚合酶II（RNAPII）在人类胚胎干细胞（H1-hESC）和K562细胞中的定位分析显示，在两个不同的位点重叠和结合，表明启动子活性和两个不同转录起始位点（TSS）在PTEN第1页轨迹(补充图1b).
接下来，我们开始研究H3K4me3和RNAPII的ChIP测序峰值是否与指示的TSS相对应PTEN第1页asRNA转录物(补充图1a–b). 为此，我们进行了5'比赛(补充表1a)和底漆行走(补充图2a–b)分析。这些分析表明PTEN第1页启动asRNA转录的位点。总的来说，三个占主导地位PTEN第1页asRNA亚型已鉴定（未切割、α和β）(，补充图2a-e和补充表1a)以及PTEN第1页asRNA外显子3(补充图2c和补充表1b). 细胞分级显示，剪接的α和β亚型在细胞质中高水平表达，而非剪接的PTEN第1页asRNAα亚型只存在于核部分(补充图2d–e). 细胞总RNA中聚腺苷酸（poly（A））RNA的耗竭证实了剪接的α和β亚型与PTEN第1页理智和无条理PTEN第1页asRNAα亚型，主要是poly（A）负转录物(和补充图2f).
高表达PTEN第1页asRNA与低PTEN公司mRNA表达（a）描述PTEN第1页sense和asRNA差异转录位点。（b）对聚（A）亏损组分的半定量RTPCR进行评估PTEN第1页感觉和不同亚型PTEN第1页asRNA。（c–d）半定量RTPCR(补充图3d)使用ImageJ软件进行量化。对定量PCR产物进行Spearman秩相关（n=11）和散点图。（c）散点图对比PTEN公司和PTEN第1页asRNA。（d）散点图对比PTEN第1页感觉和PTEN第1页asRNA。（e）HEK293T细胞的QRTPCR分析（高PTEN第1页asRNA）与MCF7细胞系（低PTEN第1页asRNA）（n=2）。(（f）)U2OS细胞的QRTPCR分析（高PTEN第1页asRNA）对比HeLa细胞系（低PTEN第1页asRNA）（n=2）。
描述PTEN第1页asRNA
主要剪接的α和βasRNA转录物似乎来自两种不同的TSS，它们奇怪地与PTEN第1页感觉促进剂(，补充图2a-b和补充表1a). 如荧光素酶表达测定所示，这些区域也表现出作为差异转录启动子的功能(补充图3a–c). 在不同人类细胞系之间的筛选中，高表达PTEN第1页asRNA与低表达PTEN公司基于Spearman秩相关分析的mRNA(
和
补充图3d). 令人惊讶的是，在PTEN第1页sense和asRNA，它们似乎是共同表达的(和补充图3d). 之间的不协调表达PTEN公司和PTEN第1页对一组细胞株的qRTPCR分析进一步支持asRNA()以及PTEN蛋白水平的western blot分析，唯一的例外是PTEN公司PC3前列腺癌细胞株缺失(补充图3e). 此外PTEN第1页还通过克隆每个转录物的cDNA来测量sense和asRNA转录物。定量的cDNA克隆用于qRTPCR的标准曲线分析PTEN第1页asRNA通常表达的拷贝数高于感觉对应物(补充图3f).
PTEN第1页asRNAα是PTEN公司表达
在不同的细胞系中观察到的不一致表达暗示了细胞间的负调控联系PTEN第1页asRNA和PTEN公司mRNA表达。为了进一步研究这个概念，用siRNAs转染HEK293T细胞(pg1asαsiRNA）或shRNA(pg1asαshRNA）靶向PTEN第1页asRNAα转录物(补充图4a). 抑制PTEN第1页asRNAα与这些si-或shRNAs，导致PTEN公司HEK293T细胞中mRNA的表达(和补充图4b–c). 激活PTEN公司之前报道的miRNA海绵作用水平似乎没有任何变化PTEN第1页(). 之间的不协调监管PTEN公司和PTEN第1页asRNAα在U2OS细胞系中得到进一步证实()和HeLa细胞系(). 值得注意的是，HeLa细胞缺乏可检测到的PTEN第1页感觉(和补充图3d)，表明PTEN第1页asRNAα的功能独立于PTEN第1页在所有被调查的细胞系中都有意义。观察到的诱导PTEN公司确定目标后PTEN第1页asRNAα在本质上是转录的，基于PTEN公司前mRNA(). 转录激活PTEN公司Run-On分析进一步支持()和ChIP用于RNAPII结合PTEN公司发起人(). 此外，激活PTEN公司似乎不涉及任何由siRNAs介导的非靶向效应(补充图4d–e)，或shRNAs(补充图f). si-或shRNA构建体靶向PTEN第1页asRNAα不影响PTEN公司在HCT116或MCF7细胞中表达，这些细胞不表达明显水平的PTEN第1页asRNA(补充图4d–f)，建议PTEN公司通过特定靶向介导的激活PTEN第1页asRNAα。综上所述，这些观察结果表明PTEN公司容易受到PTEN第1页asRNA介导的转录调控，可能通过与之前观察到的其他基因类似的机制，其中非编码RNA（ncRNA），特别是asRNA10，11，被发现在抑制性染色质重塑物（如Zeste增强子（EZH2））的招募中起作用7，12，DNA甲基转移酶3A（DNMT3a）13和甲基转移酶G9A7.
的功能特性PTEN第1页asRNAα（a）QRTPCR分析PTEN公司转染HEK293T细胞72小时后的转录物PTEN第1页asRNAα亚型（n=3）。(b条)QRTPCR分析PTEN第1页如上所述处理的培养物中的感官（n=3）。（c）QRTPCR分析PTEN公司和PTEN第1页如上所述处理的U2OS细胞中的转录物（n=3）。（d）QRTPCR分析PTEN公司如上所述处理的HeLa细胞中的转录物（n=2）。（e）核试运行分析PTEN公司转染后48小时，靶向PTEN第1页asRNAα亚型（n=3）。（f）RNA PII富集的ChIP分析PTEN公司按上述（a–d）处理的培养物中的启动子（n=3）。使用学生T检验，（*）表示显著性p<0.05，（**）p<0.01和（***）p<0.005。误差条表示平均值的标准误差。
PTEN第1页asRNAα定位于PTEN公司发起人
先前的观察表明asRNAs在人类细胞基因转录的表观遗传调控中具有调节作用，但支持这一观点的直接证据仍然是个谜7，10，11.探索是否诱导表达PTEN第1页asRNAα可以抑制PTEN公司，我们克隆了PTEN第1页asRNAα转化为GFP编码慢病毒载体，U6启动子驱动其表达14稳定的Jurkat细胞系，诱导表达PTEN第1页生成asRNAα并随访40天(补充图5a). 的表达式PTEN第1页asRNAα得到验证，相应的抑制PTEN公司被观察到，支持了PTEN第1页asRNAα作用在trans中作为负调节器PTEN公司(). 为了进一步研究PTEN公司和PTEN第1页asRNA，PTEN第1页asRNA是在体外使用氟化核苷酸和生物素连接核苷酸转录(补充图5b). 此已修改在体外转录物成功转染到靶细胞中，半衰期超过48小时(补充图5C). 氟化和生物素连接PTEN第1页asRNA也被发现抑制PTEN公司表达式()并将其本地化为PTEN公司MCF7细胞中的启动子(). 的过度表达PTEN第1页asRNA没有诱导任何可检测水平的IFNα诱导的基因办公自动化系统1和IL6（IL6），可能由双链RNA形成触发(补充图5d). 总之，这些数据表明PTEN第1页asRNAα定位于PTEN公司启动子和抑制子PTEN公司mRNA表达。
机械师洞察PTEN第1页asRNAα调节PTEN公司（a–b）稳定Jurkat细胞系的QRTPCR分析。（a）
PTEN公司mRNA表达和（b）
PTEN第1页asRNA表达。（c）生物素化氟化物转染MCF7细胞的QRTPCR分析PTEN第1页asRNA（n=3）。（d）
体外转录生物素化氟化物PTEN第1页asRNA转染到MCF7细胞，然后用生物素-ChIP和半定量RTPCR靶向MCF7的不同区域PTEN公司发起人。（e）siRNA缺失的QRTPCR分析DNMT3a公司和EZH2型在HEK293T细胞中（n=3）。（f）RNA-IP随后进行半定量RTPCRPTEN第1页asRNAα。只有鸡（IgY）抗DNMT3a抗体被发现与IPPTEN第1页asRNAα。将下拉与非特异性蛋白G抗体进行对比。（g）shRNA诱导靶向后ChIP-EZH2样品的QRTPCR分析PTEN第1页HEK293T细胞中的asRNAα（n=2）。（h）siRNA诱导靶向后ChIP-H3K27me3样品的QRTPCR分析PTEN第1页α在HEK293T细胞中的表达（n=3）。（i）单链ODN靶向后ChIP-DNMT3a样品的QRTPCR分析PTEN第1页HeLa和HEK293T细胞中的asRNAα（n=3）。（j）核表达和非片段的半定量RTCPRPTEN第1页asRNAα遵循与H3K27me3结合的RNA的改良ChIP协议。使用学生T检验，（*）表示显著性p<0.05、（**）p<0.01和（***）p<0.005。误差条表示平均值的标准误差。
PTEN第1页asRNAα诱导染色质重塑
接下来，我们着手研究以下分子机制：PTEN第1页asRNAα对PTEN公司转录。基于先前对ncRNAs介导的转录调控的研究，我们研究了先前鉴定的一部分蛋白质的参与，如组蛋白脱乙酰化酶1（HDAC1）、精氨酸1（AGO1）、Argonaute 2（AGO2）、DNMT3a、EZH2和G9A7，12，13，15–17SiRNA诱导的缺失表明EZH2型和DNMT3a公司似乎参与了PTEN公司.抑制EZH2型和DNMT3a公司在表达PTEN第1页asRNA导致PTEN公司(和补充图6a–c). 相比之下EZH2型和DNMT3a公司在HCT116细胞系中PTEN第1页asRNA表达(补充图4d)，对PTEN公司水平(补充图6b–d). 此外，两者同时消耗EZH2型和PTEN第1页asRNAα在两种不同的细胞系中没有被证明具有激活作用PTEN公司进一步支持了这两个因素协同作用的观点(补充图6e–f). 这些观察激发了我们研究EZH2和DNMT3a是否可以在蛋白质：RNA复合物中与PTEN第1页asRNAα。DNMT3a的RNA免疫沉淀（IP）显示DNMT3a和PTEN第1页asRNAα与co-IP相互作用，从而在同一蛋白质内相互作用：RNA复合物(和补充表1c). 综上所述，这些数据表明EZH2和DNMT3a参与了PTEN公司并且重要的是，DNMT3a与PTEN第1页asRNAα转录物。
以前的报告表明DNMT3a和EZH2相互作用16通过催化组蛋白3赖氨酸27（H3K27）中甲基的添加来调节转录水平，这形成了一个负抑制染色质标记18，19因此，我们决定调查DNMT3a和EZH2在PTEN公司发起人和是否PTEN第1页asRNAα积极招募这些因子。为了探索这个概念，我们诱导了siRNA的缺失PTEN第1页asRNAα，并研究了H3K27me3、DNMT3a和EZH2水平在PTEN公司发起人。抑制PTEN第1页asRNAα变异与EZH2和H3K27me3在PTEN公司发起人(). 此外，我们还着手瞄准PTEN第1页使用单链硫代磷酸寡核苷酸（ODN）的asRNAα变体(补充图4a). 与siRNAs相反，ODN通过RNase H途径发挥作用，该途径诱导RNA的链特异性靶向，随后RNA-ODN双链降解20.值得注意的是，抑制PTEN第1页使用这些ODN的asRNAα变异体显示DNMT3a在PTEN公司两种不同细胞系的启动子().
总的来说，这些数据表明PTEN第1页asRNAα结合染色质重塑剂DNMT3a和EZH2并将其招募到PTEN公司启动子并催化H3K27me3的形成。这激发了我们研究内源性PTEN第1页asRNAα定位于PTEN公司启动子，更具体地说是H3K27me3染色质标记。因此，我们对H3K27me3进行了修改的ChIP方案，并分析了细胞核是否定位PTEN第1页asRNA与表观遗传标记直接相关。事实上，内源性未分裂PTEN第1页asRNA被发现定位于这个组蛋白标记().
PTEN第1页asRNAβ与PTEN第1页感觉
观察结果表明PTEN第1页sense缺少健壮的poly（a）尾巴(和补充图2f)通过3'RACE进一步验证。克隆的3'RACE端PTEN第1页感官被测序，揭示出缺少聚（a）尾(补充表1d). 有趣的是，多（A）尾转录物与RNA稳定性有关21以及RNA从细胞核到细胞质的运输22，23总的来说，缺少聚（A）尾巴表明PTEN第1页sense可能是保留在细胞核中的不稳定转录物。然而，与这一概念相反，放线菌素D处理阻断转录显示了所分析的所有三个转录物的类似稳定性；PTEN第1页sense和poly（A）阳性转录物PTEN公司和PTEN第1页asRNA(). 因此，我们推测PTEN第1页sense RNA通过细胞内的其他方法稳定下来。一种可能的机制可能与感觉有关：asRNA相互作用，此前已有报道调节RNA的稳定性24.这一概念PTEN第1页sense和asRNA在不同的细胞系中共同表达(和补充图3d)并且它们还共享一个不同转录的启动子(补充图S3a–c)，表明它们可能是共调节的，并且可能通过双链RNA中间体相互作用。体外RNA酶A分析重申了这一概念，并表明PTEN第1页sense和asRNA转录物以RNA:RNA依赖的方式相互作用().
机械师洞察PTEN第1页asRNAβ调节PTEN第1页（a）QRTPCR稳定性分析PTEN第1页感觉，PTEN第1页asRNA和PTEN公司使用放线菌素D阻断HEK293T细胞的转录后，数据被标准化为T=0h。（b）RNase A的半定量RTPCR检测RNA的分析：RNA配对。RNA酶A处理后进行RT和PCR，引物跨越PTEN第1页sense和asRNA差异转录位点（图示）。（c）QRTPCR稳定性分析PTEN第1页干扰后HEK293T细胞的感觉PTEN第1页意义：使用U6编码的ssRNA与asRNAβ相互作用。使用放线菌素D阻断转录，并将数据标准化为T=0h。（d）QRTPCR分析PTEN公司和PTEN第1页干扰后的感觉PTEN第1页意义：asRNAβ相互作用使用单链ODN（n=3）。（e）shRNA靶向后的QRTPCR分析PTEN第1页asRNA转录物。(（f）)Western blot显示PTEN的表达PTEN第1页RNA耗竭。使用ImageJ软件量化强度。（g）分离HEK293T细胞耗尽后的QRTPCR分析PTEN第1页asRNA。使用学生T检验，（*）表示显著性p<0.05，（**）p<0.01和（***）p<0.005。误差条表示平均值的标准误差。
为了进一步探讨这个概念，我们首先开发了U6表达的单链RNA（ssRNAs），靶向PTEN第1页sense和asRNAβ重叠(补充图4a). 有趣的是，干扰这种相互作用会导致PTEN第1页感觉(). 其次，单链ODN，专门针对PTEN第1页sense和asRNAβ重叠，shRNA靶向PTEN第1页设计asRNA外显子2和3(补充图4a). 这两种方法都导致了PTEN第1页感觉，有趣的是也被抑制了PTEN公司信使核糖核酸()和蛋白质水平(). 观察到的PTEN抑制与以前的报告一致，其中PTEN第1页感官被描述为结合和隔离miRNAs三更准确地说，RNA:RNA相互作用在消耗PTEN第1页asRNAβ，由此PTEN第1页感觉不稳定，表达减少。因此，miRNAs通常由PTEN第1页可以释放和自由地约束PTEN公司而不是mRNA。综上所述，这些数据表明RNA:RNA之间的相互作用PTEN第1页需要sense和asRNAβPTEN第1页作为miRNA海绵的功能。有趣的是，这也表明PTEN第1页asRNAα和β亚型具有不同的功能；α亚型调节PTEN公司而β亚型似乎作为miRNA海绵参与转录，最终影响PTEN公司.
我们进一步着手研究这种RNA:RNA相互作用是发生在细胞核还是细胞质中。为此PTEN第1页使用shRNA靶向敲除asRNAβ，然后分离细胞质和细胞核。这个PTEN第1页asRNAβshRNA靶向导致PTEN第1页感觉水平只在细胞质中，而在细胞核中则不受影响(). 总之，这些数据表明PTEN第1页意义：RNAβ相互作用是维持稳定水平PTEN第1页在细胞质中有感觉，最终PTEN第1页感知海绵活动。
PTEN第1页asRNAα调节细胞周期和凋亡
这里提出的机制研究表明PTEN公司，PTEN第1页感觉和PTEN第1页asRNA。由于扰动PTEN第1页asRNAα水平显著受影响PTEN公司mRNA表达，我们决定研究破坏这个lncRNA网络对PTEN蛋白表达的影响。siRNA缺失后的Western blot分析PTEN第1页asRNAα在不同细胞系的几个时间点导致PTEN蛋白水平的明显诱导(). 此外，PTEN蛋白水平升高导致PTEN下游靶点pAKT的伴随下调(). 由于PTEN是细胞周期的负调控因子，因此我们研究了在细胞周期中缺乏PTEN对CDK抑制剂p21的影响PTEN第1页asRNAα。耗尽PTEN第1页asRNAα在转染后48和96小时均显著诱导p21表达()25值得注意的是，p21在PTEN第1页缺乏PTEN第1页asRNAα，反对siRNA的非靶向效应(补充图6g). 更具体地说，PTEN依赖性p21的诱导通过同时缺失siRNA证实PTEN公司和PTEN第1页asRNAα，不会导致p21蛋白水平的诱导(). FACS分析进一步支持了这种对细胞周期的负面影响()，表明在PTEN第1页asRNAα抑制U2OS细胞。相反，同时消耗PTEN公司和PTEN第1页asRNAα部分挽救了G0/G1细胞周期阻滞().
的功能影响PTEN第1页asRNAα（a）Western blot显示PTEN表达PTEN第1页asRNAα在两个不同细胞系的不同时间点。数据标准化为β-肌动蛋白。（b）击倒后两个不同时间点的Western blotPTEN第1页asRNAα。（c）Western blot显示同时敲除PTEN和p21后对PTEN和p21的影响PTEN第1页asRNAα和PTEN公司.（d）基因敲除后U2OS细胞的细胞周期分布PTEN第1页asRNAα（n=3）。（e）同时敲除后的细胞周期分布PTEN第1页asRNAα和PTEN公司在U2OS细胞中（n=3）（f）AnnexinV/PI染色法在72小时敲除PTEN第1页asRNAα和48小时阿霉素治疗（n=3）。使用学生T检验，（*）表示显著性p<0.05、（**）p<0.01和（***）p<0.005。误差条表示平均值的标准误差。
除了引起负细胞周期效应外，PTEN水平在调节凋亡敏感性方面也很重要26.抑制PTEN第1页asRNAα对细胞死亡的基础水平有一定影响，但明显使细胞对DNA损伤剂阿霉素敏感(). 总之，这些数据表明PTEN第1页asRNAα开启PTEN公司这种表达与生理相关，可能在肿瘤细胞对阿霉素等化疗药物的敏感性中起作用。
讨论
这里的数据表明lncRNAs在人类细胞基因调控中的作用比以前认识到的更为复杂。我们发现lncRNAs可以通过RNA:protein和RNA:RNA相互作用形成更高级的生物学相关功能结构。早期的研究报告称PTEN第1页sense lncRNA起着miRNA海绵的作用，这种相互作用通常被认为发生在细胞质中三，27从机械角度来看，有人建议PTEN第1页sense lncRNA与PTEN公司靶向miRNA，通过miRNA靶向PTEN公司减少，最终导致PTEN mRNA和蛋白表达增加。然而，这些先前的研究忽略了PTEN第1页相关asRNA转录物。
我们在此报告PTEN第1页该位点表达具有机械功能的asRNAs，这些转录物似乎是PTEN公司在转录和翻译水平上的表达。
在这项工作中，我们调查了三个PTEN公司调节性lncRNAs；PTEN第1页感觉，PTEN第1页asRNAα和PTEN第1页asRNAβ，并观察到这些转录物由两个不同转录的启动子表达(补充图3a–c). 我们发现lncRNA的复杂调控网络是有效的PTEN第1页asRNAα物理定位于表观遗传重塑蛋白并将其引导至PTEN公司促进剂控制PTEN公司转录。相比之下PTEN第1页asRNAβ转录物形成RNA:RNA与PTEN第1页感觉，改变细胞室定位PTEN第1页感觉转录物、miRNA隔离和最终PTEN蛋白水平(). 虽然比以前认识到的更为复杂，但仍不清楚PTEN第1页基因座是受控的，如果任何调节开关或相互作用在PTEN第1页asRNAα和PTEN第1页asRNAβ。此外，即使我们发现PTEN第1页asRNAα直接定位于PTEN公司对于启动子和与DNMT3a共IP，这些相互作用的细节仍有待探索。
的模型PTEN第1页基于asRNA的PTEN公司(1)这个PTEN第1页该位点以正反义方向（蓝色）转录。(1–2)三种不同的亚型PTEN第1页asRNA被转录；PTEN第1页asRNAα、β和未分裂核定位PTEN第1页asRNAα。(3)
PTEN公司转录被抑制PTEN第1页asRNAα和未切割亚型在trans中通过将染色质阻遏蛋白EZH2和DNMT3a募集到PTEN公司发起人。(4)这个PTEN第1页sense缺乏poly（a）尾巴和PTEN第1页与剪接物的相互作用促进了对细胞质的感知PTEN第1页asRNAβ转录物。(5)这种相互作用导致PTEN第1页感知海绵活性，从而增加PTEN公司mRNA稳定性和翻译。这种机制(1–5)结果在转录和转录后调节PTEN公司通过它的假基因。该模型显示了假基因与其蛋白编码对应物之间的同步水平。
这些观察结果表明，假基因，PTEN第1页，包含直接同时影响PTEN公司转录与翻译(). 该模型建立在RNA:RNA和RNA:protein相互作用的基础上，可能强调了一种机制，即缺乏RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的生物体，如灵长类，可以利用不同的范式，如假基因表达的lncRNA来调节基因表达。功能性RdRP有望导致这些RNA:RNA复合物的扩增，并最终形成基于RNAi的调控机制。然而，缺乏可行的RdRP增加了细胞核和细胞质的功能复杂性，因为lncRNA复合物不会被RdRP处理，而是在不同的环境中发挥作用，如本文所示，lncRNA复合体同时控制基因转录和翻译。这些观察为我们目前对基因调控的理解增添了一层重要的复杂性，并突显了人类细胞中假基因表达lncRNA的生物学作用。此处确定的系统()提供了一种有用的细胞适应策略，可以精细控制和平衡PTEN蛋白的输出，最终控制细胞生长。
推测PTEN第1页asRNAα可能作为ncRNA癌基因，因为它对PTEN公司。在未来的研究中，我们将非常感兴趣地描绘出人类癌症肿瘤PTEN公司表达，并调查PTEN第1页asRNA可以促进表观遗传沉默PTEN公司以及肿瘤的发展。如果是，了解这一点PTEN第1页和其他假基因ncRNA调控途径可能被证明在控制基因表达的治疗相关方法以及肿瘤生物学方面的信息方面有用。
在线方法
细胞培养
HEK293、HEK293T和U2OS在5%CO中培养2在37°C的Dulbecco修饰的MEM培养基中，补充10%热灭活的胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、50µg/ml链霉素和50µg/ml青霉素。
ShRNAs、ssRNAs和siRNAs
利用Bgl II和Kpn I限制位点生成ShRNA和ssRNA表达结构并克隆到U6M2结构中(补充表2)如前所述三使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）转染ShRNA和ssRNA构建物。SiRNAs是从各自的制造商处订购的(补充表2)并使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）或HiPerFect（Qiagen）在10-20 nM下转染，除非另有说明。
RNA提取和cDNA
使用Qiagen RNeasy mini kit（Qiangen）和DNase处理（Ambion Turbo DNA-free，Life Technologies）提取RNA。RNA（~500ng）用于使用MuMLV（生命技术）和寡核苷酸混合物（dT）生成cDNA18纳米材料。
PCR和qRTPCR
使用KAPA2G FAST混合物（Kapa Biosystems）和相应的寡核苷酸进行PCR(补充表2). 在Eppendorf RealPlex或Applied Biosystem 7900HT平台上使用KAPA 2G SyberGreen（卡帕生物系统）进行QRTPCR量化，循环条件如下：95°C 3分钟，95°C 3s，60°C 30秒。
核试运行
使用HiPerFect（Qiagen）将50nM siRNA转染HEK293T细胞。48小时后收集颗粒并进行溶解（10mM Tris-HCl，pH 7.4，10mM NaCl，3mM MgCl2，0.5%NP-40）。细胞核在甘油储存缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8.3，0.1 mM EDTA，40%甘油，5 mM MgCl）中重新悬浮2)并在液氮中快速冷冻。将甘油存储缓冲液（50µL）解冻，与60µL转录缓冲液（20mM Tris-HCl，pH8，5mM MgCl）混合2，300mM KCl，4mM DTT，2mM ATP，2mM CTP，2mM GTP，1mM生物素16-AA-5'-UTP，100U RNase out），在30°C下培养45分钟，然后进行DNA酶处理和核溶解（50mM Tris-HCL pH 7.4，5%SDS，0.125M EDTA），用蛋白酶K处理。提取RNA并使用Dynabeads MyOne Streptavidin珠捕获生物素化RNA（Life Technologies）。珠子在H中重新悬浮2O和cDNA直接在珠子上制备。
蛋白质分析
样品在50 mM Tris–HCl、pH 7.4、1%NP40、150 mM NaCl、1mM EDTA、1%甘油、100µ钒酸甲酯、蛋白酶抑制剂鸡尾酒和PhosSTOP（Roche Diagnostics GmbH）。将裂解物进行SDS-PAGE并转移到PVDF膜上。使用增强化学发光系统（Western Lightning–ECL，PerkinElmer）通过Western blot分析检测蛋白质。所用抗体：PTEN（细胞信号，目录号9552，1:1000）、AKT（细胞信号，目录号9272，1:1000）、磷酸化AKT（细胞信号，目录号4060S，1:1000）、p21（BD Biosciences Sparks，目录号610234，1:1000）、β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，目录号A5441，1:5000）。
分馏
根据制造商的建议（生命技术），使用PARIS试剂盒对HEK293细胞进行分离。
启动子活动
HEK293T细胞与Renilla/Firefly双向启动子结构共转染4和GFP使用脂质体2000（生命技术）。转染24小时后，使用双球荧光素酶检测系统（Promega）测量GFP和发光的表达，并使用GloMax®-Multi+检测系统（Promega）检测。荧光表达归一化为GFP。
炸薯条；RNAPII和H3K27me3
使用ChIP分析试剂盒（Upstate/Millipore）进行ChIP。细胞在1%甲醛中交联，根据制造商的建议进行淬火和溶解。用生物破坏者声波仪（Diagenode）对样品进行声波处理，并在4°C下与适当的抗体孵育过夜。使用鲑鱼精子DNA/蛋白A琼脂糖（Upstate/Millipore）来降低抗体。DNA在洗脱缓冲液（1%SDS，100mM NaHCO）中洗脱三)然后进行反向交联、RNaseA和蛋白酶K处理。使用Qiagen PCR纯化试剂盒洗脱DNA。使用了以下抗体（4µg/样品）；聚合酶II（Santa Cruz biotechnologies，Cat#sc899x）和H3K27me3（Upstate/Millipore，Cat#17-622）。
PTEN第1页asRNA与H3K27me3结合
如上所述，执行ChIP方案时未进行氯化锂清洗和RNaseA处理。将小球重新悬浮在95µL蛋白酶K缓冲液（100 mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，0.5%SDS）和5µL酶K（20mg/ml）中，在50°C下培养60分钟，并加热到95°C 10分钟。使用miRNeasy迷你试剂盒（Qiagen）洗脱RNA，并进行DNA酶处理，如前所述制备cDNA。
ChIP和IP-RT测序-DNMT3a
使用EpiMotion（Eppendorf）和先前发布的协议，以自动化方式对ODN处理的细胞进行ChIP分析5，6适应这个系统。对得到的ChIP进行了一次修改，没有添加RNA酶A。所得洗脱物经DNA处理，cDNA制备如上所述。对IP-RT进行PCR，使用PTEN第1页正、反义特异性引物分别为3套和2套。仅引物集2的测序结果(补充表2),PTEN第1页asRNA，显示为所有引物集3采样均为阴性。所使用的抗体为：；DNMT3a（ProSci，Cat#xw-7148）、AGO-2（细胞信号，Cat#C34C6）、Nucleolin（Abcam，Cat#ab50279）、AGO-1（Upstate/Millipore，Cat#07-599）、G9a（Upstate/Millipole，Cat#07-55）和EZH2。
RNA酶A
来自HEK293细胞的RNA在37°C下暴露于RNA酶A（0.1µg）30分钟。对样品进行热灭活（95°C，10分钟），并按照上述方法制备cDNA。用PCR扩增得到的cDNAPTEN第1页感觉和PTEN第1页asRNA引物（组1-2，补充表2).
5´比赛
根据5´RACE系统试剂盒（Life Technologies）使用引物PTENpg1 asRNA R1收集来自几个人类细胞系的RNA并制备cDNA(补充表2). PCR使用正向引物AAP和反向引物PTENpg1 asRNA R5进行。使用正向引物AUAP和反向引物PTENpg1 asRNA R3进行巢式PCR(补充表2). PCR产物经凝胶纯化并测序。
Poly（G）尾矿
RNA使用酵母聚（A）聚合酶（Affymetrix）和5′-三磷酸鸟苷（GE Healthcare）进行3′-聚（G）尾。多（G）尾RNA用于第一链cDNA合成，然后进行巢式PCR(补充表2). PCR产物被克隆到StrataClone PCR克隆试剂盒（安捷伦科技公司）并测序。
聚（A）耗尽
Dynabeads MyOne Streptavidin珠（Life Technologies）预载5'-生物素化寡核苷酸（Dt）18或对照（生物素362as）7脱氧核糖核酸酶处理的HEK293T细胞RNA中的poly（A）转录物被耗尽，并用于生成cDNA。
启动子结构的生成
这个PTEN第1页用含有Kpn1限制位点的引物PCR扩增启动子序列(补充表2). 将所得PCR产物克隆到pLucRLuc双向载体中4.
表达的U6的生成PTEN第1页asRNAα慢病毒构建物
从U6M2克隆质粒中扩增出U6启动子三并连接到pHIV7-IMPDH2载体的Not1限制位点8.PTEN第1页用PCR扩增asRNAα，然后将其克隆到pHIV7-IMPDH2-U6质粒的Nhe1和Pac1限制位点(补充表2).
慢病毒的产生、转导和选择
如前所述，生成慢病毒颗粒并进行滴定8Jurkat细胞以多重感染=1的感染率被棘球感染30分钟。将转导的细胞置于1–2的选择下µM分枝杆菌酚酸（Sigma-Aldrich）的培养20天。
生物素连接的产生PTEN第1页asRNA
PTEN第1页使用具有Nhe1或Kpn1限制性位点的引物对asRNAα进行PCR扩增(补充表2)并克隆到pcDNA 3.1中。T7转录物是通过使用含氟CTP和UTP（TriLink）将pcDNA 3.1线性化，并使用Durastri T7试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Epicenter）转录的Kpn1和T7生成的。生物素UTP以1:10的比例加入。生成的转录物经过DNA酶处理，并使用Antartic磷酸酶（新英格兰生物实验室）进行去磷酸化。使用酚-氯仿和EtOH沉淀法沉淀转录物。使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）将T7转录物转染到25-50nM的靶细胞中。对于体内下拉，转染MCF7细胞，30小时后收集并按所述进行亲和素IP5，6.
PI-annexin V染色
收集处理过的细胞，在PBS中清洗，造粒，并在100个细胞中重新悬浮µL Annexin V培养缓冲液（10 mM HEPES/NaOH，pH 7.4，140 mM NaCl，5 mM CaCl2)含有1%的annexin V FLOUS（annexin V FLOOS，Roche Molecular Biochemicals）和500µ克/µl PI染色。将样品孵育15分钟，然后添加400µL Annexin V孵育缓冲液，然后使用Cell Quest软件在细胞仪上进行分析。
细胞周期分布
细胞在PBS中清洗，并在室温下在4%PFA中固定一夜。去除PFA，将细胞重新悬浮在95%乙醇中。然后将样品在蒸馏水中再水化，用DAPI染色，并使用cell Quest软件在FACS Calibur（Becton Dickinson）上通过流式细胞仪进行分析。
ODN目标PTEN第1页asRNA转录物
产生ODN（IDT）并使用RNAiMax（生命技术）在100nM下转染。
