N-乙酰-Seryl-天冬氨酰-Lysyl-Proline（Ac-SDKP）调控乙酰化α-管蛋白对二氧化硅诱导大鼠肺纤维化的抗纤维化作用

α-Ac-Tub在矽肺大鼠和AngⅡ诱导的成纤维细胞中的表达

此外，我们验证了另一种与Ac-SDKP抗纤维化作用相关的差异表达蛋白SA4（α-Tub）。出乎意料的是，验证结果与2-DE结果不一致。两种不同的机制可以调节微管多样性以适应多种细胞功能。一种机制是存在特定的微管蛋白同种型，另一种机制是翻译后修饰（PTMs），其中乙酰化先前已被确定为对α-微管蛋白的重要作用¹⁰。如所示图2a，Ang II诱导的成纤维细胞中α-Ac-Tub表达下调24 h.免疫荧光显示α-Ac-Tub和α-Tub的共表达表明，α-Ac-Tub在肺组织的肺泡壁中表现出特异性表达。与α-Tub的弥漫表达不同，在矽肺结节中观察到α-Ac-Tub表达的特异性缺失。

α-Ac-Tub在成纤维细胞中的阳性表达^13,14，上皮细胞^15,16和内皮细胞^17,18来自肺组织在体外所有这些细胞类型都被认为是肌成纤维细胞的潜在来源¹⁹为了初步确定哪种细胞类型阳性表达α-Ac-Tub，我们用免疫荧光染色法检测了α-Ac-Tub与间充质标记物波形蛋白或肺泡II型细胞的生物标记物SP-A的共同表达。如所示图2bα-Ac-Tub与SP-A或波形蛋白在肺组织的肺泡壁共表达阳性，提示在肺泡Ⅱ型细胞和间充质细胞中可以检测到α-Ac-Tub的阳性表达。在矽肺结节中，SP-A或α-Ac-Tub呈散在或弱表达，波形蛋白呈强表达，但不伴有α-Ac-Tub的共表达。为了消除这些抗体的潜在混杂效应，使用了两种不同的商业抗体，并获得了大鼠肺组织中α-Ac-Tub的类似表达模式(图2c).

Ac-SDKP稳定大鼠矽肺模型中α-Ac-Tub的表达

为了更好地说明微管乙酰化和肌成纤维细胞分化之间相互作用的作用，我们使用IHC检测了α-Ac-Tub和α-SMA在大鼠模型中的位置和表达。如所示图3a，与我们之前的研究类似⁸α-SMA在对照组的血管和气管平滑肌细胞中呈阳性染色，而在间质中未见阳性染色。在矽肺模型的矽肺结节和间质纤维化区域观察到α-SMA的特异性表达。相反，对照组动物接受了不含SiO的盐水治疗₂诱导后，大多数检测到的α-Ac-Tub在气道上皮中表达，与以前的报告类似¹¹; 如前所述，α-Ac-Tub也出现在肺泡细胞的多种细胞类型中²⁰在矽肺结节或间质纤维化区域，即使在α-SMA阳性表达的区域，也未观察到α-Ac-Tub的阳性表达。

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图3

Ac-SDKP对矽肺大鼠col I、α-SMA和α-Ac-Tub的影响。

(一)免疫组织化学法检测肺组织中α-SMA和α-Ac-Tub的表达。比例尺=====================================================================================================200 μm和50 微米。(b条)Western blot检测肺组织中col I、α-SMA和α-Ac-Tub的表达。数据表示为平均值 ± 扫描电镜；N个=====================================================================================================4个独立实验。

免疫染色结果用Western blot分析进一步证实(图3b)表明在矽肺模型中（4 w和8 w） 与对照组相比，二氧化硅诱导组α-SMA表达增加，同时α-Ac-Tub表达减少（4 w和8 w） ●●●●。综上所述，这些结果表明肌成纤维细胞分化可能导致微管破裂。

Ac-SDKP减弱Ang II诱导的成纤维细胞中α-Ac-Tub的表达损失

类似于TGF-β1的作用⁸，Ang II治疗24小时后 h、 大鼠肺成纤维细胞出现形态学改变，包括细胞变宽，α-SMA强阳性表达，α-Ac-Tub表达降低(图4). 这一发现表明，成纤维细胞分化为肌纤维母细胞样表型，微管断裂。Ang II治疗后，α-SMA和col I蛋白显著上调，α-Ac-Tub显著下调。为了专门检测Ac-SDKP的抗纤维化作用，我们合成了突变体Ac-ADKP，其中Ser被Ala取代，从而产生Ac-SDKP的非功能类似物。如所示补充图S2Ac-SDKP强烈抑制col I和α-SMA的表达，并稳定Ang II诱导的α-Ac-Tub的表达。

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图4

Ac-SDKP对Ang II诱导的成纤维细胞col I、α-SMA和α-Ac-Tub的影响。

(一)免疫荧光法检测AngⅡ诱导的成纤维细胞中α-SMA和α-Ac-Tub的共同表达。比例尺=====================================================================================================50 微米。(b条)通过Western blot测定Ac-SDKP、缬沙坦（AT1抑制剂）、TCS HDAC6 20b（特异性HDAC6抑制剂）和Y-27632（ROCK抑制剂）对成纤维细胞的影响。数据表示为平均值 ± 扫描电镜；N个=====================================================================================================4个独立实验。

Ac-SDKP抑制HDAC6的表达在体外和体内

先前的研究表明，微管脱乙酰化可能主要受HDAC6调节¹⁰在本研究中，我们还发现Ang II对肌成纤维细胞分化和ECM沉积的影响可能涉及Ang II受体1型（AT1），尽管没有证据表明HDAC6通过AT1激活。为了测试这些机制在HDAC6作用中的潜在参与，我们使用了相应受体和酶的药理抑制剂。缬沙坦（AT1抑制剂）、TCS HDAC6 20b（特定HDAC6抑制剂）治疗^14,15)和Y-27632（一种Rho-相关卷曲形成蛋白激酶（ROCK）抑制剂）导致α-Ac-Tub重新分布，并减弱Ang II诱导的α-SMA和col I上调。Ac-SDKP治疗显示出类似的结果，并抑制AT1和p-MYPT的表达(图4).

此外，我们观察了HDAC6和HSP90在矽肺大鼠体内的表达和定位。如所示图5a在大鼠肺中，矽肺结节增加了HDAC6和HSP90的表达。体内和在体外HDAC6和HSP90在矽肺组和AngⅡ诱导的成纤维细胞中表达上调。在Ac-SDKP治疗前后，大鼠HDAC6表达降低。此外，Ac-SDKP、缬沙坦、TCS HDAC6 20b和Y-27632治疗可减轻Ang II诱导的成纤维细胞HDAC6表达升高(图5b).

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图5

Ac-SDKP对HDAC6表达的影响体内和在体外.

(一)用免疫组织化学方法检测肺组织中HDAC6和HSP90的表达。比例尺=====================================================================================================50 微米。免疫荧光法检测大鼠矽肺肺组织中HDAC6/α-Ac-Tub和HDAC6/-α-SMA的共同表达。比例尺=====================================================================================================100 微米。(b条)Ac-SDKP对HDAC6和HSP90表达的影响体内和在体外用Western blot测定。数据表示为平均值 ± 扫描电镜；N个=====================================================================================================4个独立实验。

矽肺病模型

实验方案和矽肺病模型如前所述⁸简单地说，用异氟醚麻醉大鼠，并接受二氧化硅溶液（50 mg/大鼠，1 ml）或0.9%生理盐水（载体）经气管滴注。Ac-SDKP【800】 μg/（kg d），美国Bachem AG公司]或对照组（0.9%生理盐水）通过一个微型透水泵（型号2 ml 4，美国DURECT有限公司）植入腹腔。60只大鼠分为6组（每组10只）：1）对照组4 w（用0.9%生理盐水诱导；然后用0.9%的生理盐水处理4次 周）；2） 矽肺模型4 w[矽肺诱发50 毫克二氧化硅₂（s5631，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）在大鼠气管内，然后用0.9%生理盐水处理4次 w] ；3） 控制8 w（用0.9%生理盐水预诱导48 0.9%盐水诱导前h，然后用0.9%盐水处理8次 w） ；4） 矽肺模型8 w（用0.9%生理盐水预处理48 50之前的h 二氧化硅毫克₂诱导，然后用0.9%生理盐水处理8次 w） ；5） Ac-SDKP后处理（用SiO诱导₂，用0.9%生理盐水治疗4次 w、 然后用Ac-SDKP再治疗4次 w） ；和6）Ac-SDKP预处理（在用SiO诱导前48小时用Ac-SDKP预处理₂，然后继续Ac-SDKP治疗8 w） ●●●●。在实验结束时，用0.9%的生理盐水冲洗肺组织，以在切除前除去血液，并在液氮中进行snap冷冻，以便随后提取蛋白质。

双向凝胶电泳（2-DE）样品制备

冷冻肺组织（每组6个）在液氮中研磨，并在含有40 mM Tris、1%w/v DTT、1%v/v IPG缓冲液3–10NL和鸡尾酒蛋白酶抑制剂混合物（04693116001，罗氏），然后均质。样品匀浆在冰上培养30 最小值，40000离心 克对于30 14时最小 摄氏度。向上清液中加入2 M硫脲和7 M尿素并标记“可溶性蛋白”。

剩余沉淀物用裂解缓冲液A洗涤两次，并重新悬浮在裂解缓冲液B（2 M硫脲，7 M尿素，40 mM Tris、1%w/v DTT、1%v/v IPG缓冲液3–10 NL和鸡尾酒蛋白酶抑制剂混合物）。接下来，匀浆在40000下离心 克对于30 14时最小 °C，上清液被标记为“不溶性蛋白质”。

2-DE图像分析和蛋白质鉴定（MALDI-TOF-MS）

如前所述，遵循2-DE协议³⁰蛋白质样品（1.3 毫克，氮=====================================================================================================每组6个）加载到固定干条上（24个 cm，pH值3–10 NL，GE Healthcare）。使用IPGphor-3（GE Healthcare），按照GE Healthcare提供的方案执行一维等电聚焦（IEF）。在缓冲器中平衡后[6 M尿素，50 mM Tris碱pH 8.8，30%（v/v）甘油，2%（w/v）SDS（十二烷基硫酸钠）]补充1%（w/v）DTT 15 分钟，在添加2.5%（w/v）碘乙酰胺的同一缓冲液中进行第二次培养15分钟。然后将板条加载到Ettan DALT II系统中12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上（GE Healthcare）。使用考马斯蓝G-250（Amresco）染色对凝胶中的蛋白质进行可视化，并使用ImageMaster 2D Platinum Software 6.0版（GE Healthcare）进行扫描和分析。只有体积百分比变化至少1.5倍的斑点才被视为差异表达。

将表达发生显著变化的蛋白质从凝胶中取出，洗涤、脱水并用10 50纳克/毫升胰蛋白酶（Promega） 毫摩尔/升NH₄HCO公司_三肽混合物放置在不锈钢MALDI探针上，并在室温下缓慢干燥。MS是使用Bruker Daltonics Autoflex MALDI-TOF-MS进行的。除非另有规定，否则质谱是在反射模式下检测的，并使用FlexControl软件（版本2.4，Bruker Doltonics）使用默认参数进行记录。除非另有规定，否则使用Xmass软件（5.1.1版，Bruker Daltonics）使用默认参数标记单等位肽质量。

使用Mascot搜索引擎完成MS数据中的蛋白质鉴定(www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl？FORMVER=2&SEARCH=PMF)带有大鼠作为选定的分类法和为搜索选定的NCBI非冗余数据库。根据以下标准鉴定蛋白质³¹：（1）得分大于60分(第页 < 0.05，默认阈值）；（2） MS数据覆盖的理论蛋白质序列比例大于20%；（3）与理论值相比，分子质量变化小于30%，pI变化小于2.0。

细胞培养

使用胰蛋白酶消化法从3周龄Wistar大鼠中分离出大鼠肺成纤维细胞，并将其保存在补充有10%胎牛血清（FBS，10099141，Gibco，Thermo Fisher Scientific）和100 U/ml青霉素/链霉素] °C培养箱，含5%CO₂80%融合处的细胞在无FBS-MEM培养基中培养24小时 小时，大多数细胞处于静止状态。接下来，将细胞分为6组，培养24小时 小时数：1）控制；2) 100 nmol/L Ang II（A9525，Sigma-Aldrich）；3） 昂二世+10⁻⁸ mol/L Ac-SDKP（H-1164，Bachem AG，瑞士）；4） 昂二世 + 10⁻⁶ mol/L缬沙坦（V0112，东京化学工业，日本东京）；5） 昂二世 + 10⁻⁶ mol/L TCS HDAC6 20b（4805，Tocris Bioscience，英国布里斯托尔）；6） 昂二世 + 10⁻³ mol/L Y-27632（10005583 m，Cayman Chemical Company，Ann Arbor，MI，USA）。

基因沉默和过度表达α-TAT 1

三个siRNA对抗α-TAT 1由广州瑞波生物科技有限公司合成。这些siRNA的序列为1）意义：5′GCAGCAAUCAUGACUAU dTdT 3′；反义：3′dTdT CGUCGUUAGUA CUGAUAA 5′；2） 意义：5′CCUCCAGUGAGAAUU dTdT 3′；反义：3′dTdT GGAGUCACUCUUAA 5′；3） 意义：5′GGAACCUACGCAUACAG UU dTdT 3′；反义：3′dTdT CCUGGAUGCGUAUGUCAA 5′。控制siRNA或α-TAT 1使用脂质体将siRNA转染到细胞中^®2000试剂（11668，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），根据制造商的说明。然后，在使用Ang II或Ac-SDKP治疗之前，将细胞培养48小时。

的编码顺序α-TAT 1（1266 bp）被克隆到XhoI公司和巴米希上海金玛药业科技有限公司瞬时表达载体pEX-2中的位点使用脂质体将空载体pEX-2-和pEX-2-α-TAT 1转染到细胞中^®2000试剂（11668，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），根据制造商的说明。然后，在给予Ang II或Ac-SDKP处理之前，将细胞孵育48小时。

免疫细胞化学（ICC）和免疫组织化学（IHC）

在室载玻片和石蜡包埋的组织切片上生长的细胞用于ICC和IHC。用3%H淬灭内源性过氧化物酶₂O（运行）₂，并使用高压方法对脱蜡组织切片进行抗原提取。然后将样品与α-SMA（ab3275，Eptomics，Mitten，CA，USA）、α-Ac-Tub（sc-23950，Santa Cruz Biotechnology，USA或ab125356，Abcam，Cambridge，MA，USA，HDAC6（20183，Arigo biolaboratories，Shinchu，Taiwan，China）和HSP 90（BD Transduction Laboratories °C，然后与二级抗体（PV-6000，中国北京中山金桥生物科技有限公司）在37℃下孵育 20°C 用DAB（ZLI-9018，ZSGB-BIO，中国北京）观察最小免疫反应性。棕色染色被认为是阳性结果。

为了进行免疫荧光染色，用10%的驴血清（92590，Temecula，CA，USA）封闭腔玻片或石蜡包埋切片15 4时共同孵育过夜后的最小值 °C，α-Ac-Tub/α-Tub（AF7010，Affinity Biosciences，辛辛那提，俄亥俄州，美国），α-Ac-Tub/波形蛋白（ab92547，Abcam）和α-Ac-Tub/肺表面活性物质相关蛋白A（SPA，{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”EL925092“，”term_id“：”133896550“，”term_text“：”EL92“}}EL925092型（英国伯明翰，Eterlife）、HDAC6/α-SMA和HDAC6/-α-Ac-Tub，用Alexa Fluor培养细胞^®488驴抗兔IgG（H + 五十） （A21206，Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA）和Novex^®驴抗鼠TRITC亲和力（A16016，Molecular Probes，Carlsbad，CA，USA）或罗丹明标记的山羊抗兔IgG（H + 五十） （03-15-06，Kirkegard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD，USA）和荧光标记山羊抗鼠IgG（H + 五十） （02-18-06，Kirkegard and Perry Laboratories）用于60 最小值为37 阻塞缓冲器中为°C。细胞核用DAPI（C1002，Beyotime Biological Technology Co.，LTD，Jiangsu，China）染色。然后在奥林巴斯DP80显微镜下观察细胞或组织，并使用成像软件（cellSens 1.8，奥林巴斯公司，德国）进行分析。

蛋白质印迹分析

使用RIPA缓冲液（BB-3201-1，BestBio，中国上海）对细胞和肺组织进行裂解，并使用Bradford蛋白质分析法（PC0020，Solarbio；中国）对总蛋白质含量进行量化。蛋白质（20μg/lane）通过SDS-PAGE在10%的凝胶上分离，并电转移到硝化纤维素膜上（Amervicele Biosciences）。用5%脱脂乳封闭膜，并在4 °C，带有一级抗体[抗I型胶原蛋白（ab34710，Abcam），抗α-SMA；抗α-Ac-Tub；抗α-Tub；抗AT1（DF7592，亲和生物科学）；抗p-MYPT（AF5445，亲和生物学）；抗MYPT，然后是对兔/小鼠IgG（H + 五十） （074–1506/074–1806，柯克加德和佩里实验室）。通过添加ECL显示目标带^TM（TM）Prime Western印迹检测试剂（RPN2232，GE Healthcare，中国香港）。结果表示为α-Tub中的折叠变化。

本研究由国家自然科学基金（No.81202162）、河北省自然科学基金项目（No.H201409115）和河北省研究生创新基金项目（2015S03）资助。