肌成纤维细胞基质：组织修复和纤维化的意义

摘要

介绍

肌成纤维细胞激活是生理和病理组织修复中的关键事件。肌成纤维细胞是创伤愈合和纤维化过程中主要分泌细胞外基质（ECM）的细胞，主要负责瘢痕组织成熟时的收缩性[1,2]. 肌成纤维细胞及其衍生ECM对正常和病理组织修复的作用[三]已经在肺部进行了很好的研究[4–6]，肝脏[7–9]，肾脏[10,11]、骨骼肌[12]、系统性硬化[13–15]，心脏[16–18]以及对肿瘤的基质反应[19,20]。

最近的一些综述考虑了不同器官中肌成纤维细胞祖细胞的性质[21]包括常驻成纤维细胞[三,19,22–25]，纤维细胞[26–28]，平滑肌细胞[29]，周细胞[30–33]上皮细胞和内皮细胞经历内皮细胞（EndoMT）或上皮-间充质细胞转化（EMT）[34–38]、间充质基质细胞[39,40]和肝星状细胞[23]，只列出最突出的。其他人则关注控制肌成纤维细胞形成和存活的化学和机械条件[41]、功能和表型特征[42,43]及其作为治疗靶点的适用性[44–48]. 由于空间限制，这里不探讨这些概念。

尽管有大量关于肌成纤维细胞的文献，但令人惊讶的是，很少关注肌成纤维纤维细胞ECM的具体特征和功能。事实上，肌成纤维细胞对细胞外基质的干扰和重塑对其自身行为以及共享相同微环境的其他细胞类型的行为有着深远的影响。这是直观的，因为ECM执行多种生物功能，包括为细胞提供机械稳定性、保护和指导[49–51]，并充当生长因子的存储库[52–54]。

肌成纤维细胞：产生并重塑ECM

四十年前，肌成纤维细胞首次被鉴定为成纤维细胞，在伤口肉芽组织中同时表现出突出的内质网和可收缩的微丝束[55]. 肌成纤维细胞的一个显著特征是应力纤维中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的新表达[56]，这是它们具有高度收缩活性的分子基础。然而，并非所有α-SMA表达细胞都是肌成纤维细胞。例如，不形成微丝束的α-SMA阳性细胞不被视为肌成纤维细胞，因为它们缺乏定义的收缩因子[57]. 相反，表达微丝束的α-SMA阴性成纤维细胞至少是功能性收缩性肌成纤维细胞体内由于成纤维细胞在标准细胞培养条件下几乎不可避免地形成微丝束（应力纤维），“肌成纤维细胞”表示α-SMA阳性应力纤维形成细胞。

值得一提的是，我们对肌成纤维细胞行为的理解大多来自于在体外培养条件差异很大的研究（例如在ECM涂层培养皿中培养，在“软”琼脂上培养，在附着或分离的胶原蛋白凝胶中培养）。这可能是研究结果不一致的原因，在解释文献中报告的数据时应予以考虑。人们还必须认识到体内成纤维细胞和肌成纤维细胞同时遇到多种ECM成分，从而可能改变实验环境中观察到的行为。当然，成纤维细胞在二维和三维培养条件下的行为差异已被充分记录在案[58]并为结果注入可变性在体外研究。最后，机械转导的作用——细胞对基质硬度的感知和对这种硬度的反应——开始在成纤维细胞和肌成纤维细胞中得到阐明，这也为我们对肌成纤维细胞ECM的理解增加了另一层复杂性。事实上，在培养中有一定比例的成纤维细胞自发获得肌成纤维细胞表型[57,59]可能是由于培养皿的硬度。

虽然I型胶原和III型胶原通常被认为是肌成纤维细胞表达的主要ECM蛋白，但肌成纤维纤维细胞在伤口修复和纤维化过程中会产生无数其他ECM蛋白，如IV型、V型和VI型胶原[60]; 糖蛋白；和蛋白多糖，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和tenascin[三,61–72]. 然而，值得注意的是，肌成纤维细胞不一定是这些蛋白质的唯一来源，因为上皮细胞、炎症细胞和内皮细胞也都可能产生这些蛋白质。待讨论的肌成纤维细胞ECM示意图如所示图1.

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图1

肌成纤维细胞基质。一些与组织纤维化相关的ECM分子示意图。肌成纤维细胞（中央，红色应力纤维含有α-平滑肌肌动蛋白）位于其ECM（绿色）中。ECM的成分如图所示（顺时针方向，从12点钟位置开始）：弹性蛋白、纤维蛋白和LTBP、蛋白多糖、tenascins、基质细胞蛋白、胶原蛋白和纤维连接蛋白。肌成纤维细胞遇到、发出信号并调节文本中概述的这些不同成分的表达。

胶原

胶原蛋白主要是由三条前胶原链组成的结构蛋白，它们以经典的三螺旋模式排列。在伤口肉芽形成的早期，肌成纤维细胞沉积III型胶原。尽管最近的数据表明，胶原蛋白III的缺乏促进了肌成纤维细胞的分化和伤口收缩，但这种形式在愈合的早期给伤口带来了一定的可塑性[73]. 当肉芽组织在生理性伤口修复后被吸收时，肌成纤维细胞发生凋亡（见下文），生化鉴定出更坚硬的I型胶原。在病理条件下（如手掌纤维瘤病的增殖细胞期或乳腺癌的间充质基质浸润区域），III型胶原似乎增加[74,75]促结缔组织增生性乳腺癌和闭塞性细支气管炎并发慢性肺移植排斥反应的小气道纤维化中的V型胶原[76–78]. 当然，密集的纤维化组织中含有丰富的I型胶原蛋白，也含有VI型胶原蛋白[79–83]。

随着伤口愈合接近完成，凋亡基因程序在肌成纤维细胞内表达，导致细胞相对较低的疤痕。一旦伤口闭合完成，刺激早期ECM合成的细胞因子被抑制，并合成了功能性基底膜，因此表明存在反馈回路[84]. 然而，在病理性纤维化中，有证据表明，肌成纤维细胞未能启动凋亡（或对凋亡刺激的敏感性降低）是这些细胞在纤维化组织中持续存在的原因。

纤维连接蛋白（FN）

FN由多种细胞类型表达，在细胞粘附和迁移行为中起关键作用[85,86]. 功能性FN二聚体由两个类似或相同的220-250 kDa亚单位组成，它们由靠近羧基末端的两个二硫键连接在一起。像许多糖蛋白一样，每个单体都由不同类型的同源重复结构域组成；在FN的情况下，有三种类型，称为I型、II型和III型。然而，由于前体mRNA的选择性剪接，两个额外的III型重复序列（称为EDA，表示额外结构域A，EDB，表示额外的结构域B）可以插入到成熟蛋白中；这些域的拼接是相互独立的[85,87]但受纤维化前细胞因子TGF-β高度上调[88]. FN的选择性剪接在胚胎发育期间以及在伤口愈合、病理性纤维化和恶性肿瘤期间尤为突出，并产生了“癌胚”ECM一词。证据表明，选择性分裂的EDA-FN（而非血浆FN）对TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化是必要的[89,90]因此是肌成纤维细胞ECM的关键组成部分。

作为一种单独的贡献，FN还结合了大量可能促进肌成纤维细胞分化的生长因子。最值得注意的是，FN通过结合潜在TGF-β结合蛋白（LTBPs，见下文）定位潜在TGF--β1复合物[91]. 此外，FN结合血管内皮生长因子（VEGF）[92]，骨形态发生蛋白（BMP）1[93]，肝细胞生长因子（HGF）[94]，成纤维细胞生长因子（FGF）-2[95]和血小板衍生生长因子（PDGF）[96]这些都可能与肌成纤维细胞表型有关。

弹性蛋白

弹性蛋白是一种参与结缔组织稳态的主要ECM蛋白，为器官提供结构完整性，并负责吸收防止损伤的机械过载[97]. 平滑肌细胞和成纤维细胞是正常组织中主要的弹性蛋白生成细胞[98]例如皮肤、心脏、动脉和肺，它们在一生中都会经历循环的机械负荷和卸载。弹性蛋白的沉积和组织主要发生在胎儿晚期和新生儿早期，在成熟期减少到低周转率[99]。

一般认为，损伤后成纤维细胞产生的弹性蛋白较低或缺失，这在一定程度上解释了瘢痕组织与完整结缔组织相比弹性和断裂强度降低的原因[52]. 由于正常和受损皮肤和动脉中的弹性蛋白周转率较低，目前的策略旨在通过移植提供类弹性蛋白[100–102]或通过刺激细胞弹性蛋白的产生[103,104]. 然而，一些研究表明，在组织损伤后，成纤维细胞对一些细胞因子（如TNF-α、IL-1β和TGF-β1）的反应使其产生的弹性蛋白显著增加[105,106]. 例如，在以小气道纤维化发展为特征的闭塞性细支气管炎患者中，α-SMA阳性肌成纤维细胞显示弹力蛋白表达增强[107]。

纤维蛋白和LTBP

除了主要的纤维成分外，肌成纤维细胞ECM还包含由纤维蛋白和潜在TGF-β结合蛋白（LTBP）家族成员形成的微纤维网络。在人类中，这些糖蛋白家族由三种同源纤维蛋白亚型（纤维蛋白-1、-2和-3）和四种LTBP（LTBP-1、-2、-3和-4）组成，其主要特征是高度重复和富含二硫键的结构域。微纤维在弹性纤维形成过程中为原弹性蛋白结合提供基础，增强组织和器官的结构完整性，并将TGF-β和骨形态发生蛋白（BMP）等生长因子靶向ECM[108–110]. 由于纤维蛋白基因突变导致微纤丝组装或生长因子与纤维蛋白的关联中断，导致临床相关的病理性结缔组织疾病，如马凡综合征、先天性契约性蛛网膜下腔炎和系统性硬皮病[111–115]。

LTBP在重复序列和结构域结构上与纤维蛋白有相似之处。然而，与纤维蛋白（~350kDa）相比，LTBP要小得多，从125到160kDa不等。对培养的人肝肌成纤维细胞ECM中LTBP亚型的分析揭示了所有四种同型，表明这些蛋白可能在肝纤维化中起作用[116]. 此外，培养研究可以深入了解胚胎发生和组织修复过程中成纤维细胞组装ECM的事件序列。最近的小鼠纤维蛋白-1基因敲除研究表明，与依赖纤维蛋白-1微丝的细胞外基质结合LTBP-3和LTBP-4相比，LTBP-1并入成纤维细胞ECM依赖于FN网络[117]. 在缺失FN基因的成纤维细胞中，LTBP-1在早期无法并入ECM，但可以在后期组装[118]。

LTBP-1对组织修复、纤维化和肌成纤维细胞生物学至关重要，因为它是TGF-β1的储存蛋白。TGF-β家族包括调节细胞生长、凋亡、炎症和ECM合成的多能细胞因子。在哺乳动物中，这些功能由广泛表达的三种亚型TGF-β1、TGF-？和TGF-[119]. TGF-β1似乎是与成纤维细胞-肌成纤维细胞激活相关的最普遍的亚型[120]，尽管其他两种亚型也被证明具有这种作用在体外[121]。体内，TGF-β3似乎具有肌纤维母细胞加压作用[121,122]. LTBP-1在多个水平上调节TGF-β1的生物活性：（1）通过组装大的潜伏复合物促进有效的潜伏TGF-α1分泌[123]; （2） 它通过与包括FN和纤维蛋白在内的不同蛋白质相互作用，将潜在TGF-β1作为ECM的一个大的潜在复合物[109,124,125]; （3）它控制和指导细胞介导的TGF-β1活化[125–127]。

除上述外，在肌成纤维细胞ECM中还可以发现大量其他ECM成分，包括纤维蛋白、基质细胞蛋白（例如CCN蛋白、骨桥蛋白、骨膜抑素和SPARC，仅举几个例子）、tenascins和血小板反应蛋白。这些蛋白都在不同程度上与纤维生成和伤口修复有关，其中基质细胞蛋白CCN2（结缔组织生长因子，CTGF）和tenascin-C可能是研究得最好的。同样，支持WISP-1、SPARC、骨桥蛋白和血小板反应蛋白在肌成纤维细胞功能中在伤口愈合和纤维化中作用的实验数据也得到了充分的证明[52,128–143]. 下面，我们将重点介绍这些ECM蛋白在伤口修复和纤维化中作用的一些最新证据。

CCN2（CTGF）

CCN蛋白[因前三个家族成员的名称而得名：富含半胱氨酸61（CYR61）、结缔组织生长因子（CTGF）和肾母细胞瘤过度表达（NOV）[144]]是与纤维化和肌成纤维细胞活化相关的ECM的组成部分。尽管CCN2被指定为生长因子，但它不是一种细胞因子，而是一种完整的ECM蛋白，通过单独结合细胞整合素或招募共受体发挥其功能[145]. 许多综述总结了CCN2在纤维化中的作用[146–148]。

CCN2（CTGF）的表达在各种纤维化条件下局部上调，并在纤维化患者的血清中升高。此外CCN2型基因启动子与人类系统性硬化症相关[149]. 在实验上，阻断或删除CCN2可以有效地减少纤维化，从而确定CCN2是纤维化的潜在关键调节剂。然而，随后的研究似乎表明CCN2的激活功能发生在TGF-β1信号的上游或下游，因为同时阻断TGF-[三,148]. TGF-β1在多种成纤维细胞培养和动物纤维化模型中诱导CCN2的表达，这进一步证实了CCN2只是TGF-[131]. 然而，不同的成纤维细胞培养模型显示CCN2的表达是对TGF-β1以外的因素（如内皮素-1）的反应[150]. 然而，在许多器官中，CCN2似乎与TGF-β1协同增强纤维化，但在缺乏TGF-[151,152]。

腱糖蛋白

Tenascin-C是ECM蛋白Tenascin家族的成员（也包括tenascins-X、-R和-W）。Tenascin-C通常被视为组织修复早期未成熟ECM的标志物，通过产生支持迁移的粘附环境和发挥化学动力学作用，促进临时ECM的基质细胞数量[153]. 事实上，tenascin-C在肌成纤维细胞募集中发挥作用[154]. 虽然tenascin-C在正常愈合的伤口中下调，但它在增生性瘢痕组织中持续存在，似乎可以阻止细胞凋亡并延长ECM合成和增殖期[153,155]. Tenascin-C缺失小鼠可防止肺纤维化[156]和肝脏[157]α-SMA阳性肌成纤维细胞数量减少。其他tenascin家族成员在肌成纤维细胞生物学和纤维化中的可能影响尚不清楚。Tenascin-X基因敲除小鼠皮肤真皮中的胶原蛋白数量减少，这与人类Ehlers-Danlos综合征的表型相似，包括皮肤的延展性增加和强度降低[158,159]. 尽管tenascin-X敲除小鼠的皮肤伤口断裂强度降低，但肌成纤维细胞对肉芽组织生物力学特性受损的贡献尚未得到测试[160]。

蛋白聚糖类

蛋白聚糖（包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、透明质酸、syndecans和富含亮氨酸的小蛋白聚糖）是创伤愈合反应的关键成分，也与组织纤维化有关。实验和机理研究表明，这些分子促进基质的组装和生长因子（如LTBP-1/TGF-β复合物）并入ECM[161]。

透明质酸长期以来与肝纤维化有关，而透明质酸（HA）在临床上被用作肝纤维化的血清生物标志物[162]. 此外，HA旨在以TGF-β1依赖的方式调节肌成纤维细胞的激活和持续性[163,164]. 虽然成纤维细胞与HA结合使TGF-β1受体靠近HA受体CD44，从而影响下游TGF-[165]. HA还稳定细胞–ECM粘附[166]对肌成纤维细胞的机械感受和激活至关重要[167]. HA受体CD44缺失的成纤维细胞表现出迁移受损、应激纤维形成和活性TGF-β1的产生，这些过程都依赖于细胞粘附[168]. 一贯地，α-SMA阳性肺肌成纤维细胞中HA合成酶2的条件性过表达产生了侵袭性表型，促进了博莱霉素治疗小鼠肺纤维化的进展[169]. 同一研究表明，HA合成酶2的条件缺失在第1列α2CD44的启动子或抑制抑制了侵袭性肌成纤维细胞表型并减少了纤维化的发展。在这些发现的支持下，HA信号成为治疗性抗纤维化干预的新靶点。

Syndecas是另一类硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，已被证明会影响器官纤维化[170–172]. 基质金属蛋白酶（MMPs）和氧化应激对syndecan-1（CD138）的脱落有助于纤维化的发展[173,174]syndecan-1支持FN纤维生成[175]. syndecans或syndecan片段对肌成纤维细胞活化的直接影响尚未测试。然而，已知syndecan-2可能通过与TGF-β1直接结合来调节TGF-[176]. 此外，syndecan-4基因敲除小鼠在心肌梗死后表现出肌成纤维细胞活化降低[177]在肺纤维化动物模型中[178]。

富含亮氨酸的小蛋白聚糖（SLRP）由一组具有小蛋白+核心和独特串联富含亮氨酸重复序列的蛋白聚糖组成。在研究得最好的SLRP中，有decorin、biglycan、lumican和fibromodulin[179]. SLRP具有多种功能，对纤维收缩性疾病中的ECM和细胞稳态有直接影响；它们调节细胞存活和胶原组织，并与生长因子，特别是TGF-β1结合[180,181]. SLRP通常在不同的纤维化条件下上调[179]这与他们作为肌成纤维细胞激活的负调节器的一般观察结果相矛盾。相反，SLRP在皮肤瘢痕形成中表达下调，与纤维化挛缩相关[182]. 这种差异可能是由于SLRP在修复和纤维化期间ECM重塑的不同阶段发挥不同的功能所致。例如，核心蛋白通过与活性TGF-β1结合，潜在地调节肌成纤维细胞的激活[183]. 同样，双聚糖具有类似于核心蛋白的抗成纤维特性。双聚糖缺乏培养的心脏成纤维细胞由于TGF-β1信号增强，表现出增强的肌成纤维细胞活化和收缩功能[184]. 尽管在角膜成纤维细胞的肌成纤维细胞活化过程中，卢米康上调，但其在纤维压缩性疾病和调节肌成纤维母细胞表型中的作用尚不清楚[185]。

肌成纤维细胞ECM的翻译后修饰

除了ECM的组成外，机械生物学特性也强烈决定了肌成纤维细胞的激活和功能。作为收缩细胞，肌成纤维细胞通过整合素结合，通过局部粘连感知和调节ECM内的硬度。此外，最近的数据表明，在纤维化的情况下，独立于TGF-β信号传导的单独机械刚度可以诱导肌成纤维细胞活化[186]. 因此，ECM的硬度也是伤口愈合和纤维化的关键调节剂。ECM蛋白的交联是组织硬化的主要决定因素。尽管胶原蛋白在皮肤和软骨等结构组织中的周转率较低，但ECM蛋白（尤其是胶原蛋白）的交联是纤维变性疾病治疗的潜在重要领域。交叉链接的ECM蛋白可能导致构象变化，使表位“隐藏”于蛋白酶活性中，从而阻止ECM的消化和重塑。因此，靶向酶和其他蛋白质（如下所述）可以提供一种手段，通过该手段可以有效地停止甚至逆转纤维化过程。

转谷氨酰胺酶（TGs）是一个由结构和功能相关基因编码的蛋白质大家族[187,188]. TGs的主要功能是催化钙²⁺-γ-羧基酰胺-谷氨酰胺残基和蛋白结合赖氨酸残基中ε-氨基之间蛋白质间异肽桥的依赖性形成[189,190]. TG2是TG家族中表达最广泛、最普遍的成员[191,192]. TG2的ECM底物谱很大，包括FN、玻璃体凝集素、I/II/V/VII/XI型胶原、层粘连蛋白、纤维蛋白和LTBP-1，仅举最显著的例子[190,193]. TG2对胶原蛋白的广泛交联可产生抗降解的胶原蛋白纤维，并支持肌纤维母细胞介导的纤维化[194]. 除了TG交联ECM的机械后果外，TG与纤维蛋白和LTBP-1的相互作用还调节TGF-β1的沉积和活化。此外，TGs直接参与TGF-β1从大的潜在复合物中的蛋白水解激活[129]从而可能诱导肌成纤维细胞分化。

在正常和病理组织修复中促进ECM蛋白交联的其他重要酶属于赖氨酰氧化酶（LOX）和赖氨酰氧化酶样（LOXL）家族。LOX是一种铜依赖性胺氧化酶，通过氧化脱酰胺作用从底物中的肽基赖氨酸形成活性醛基；这些反应性基团自发地形成共价交联[195,196]. LOX对纤维胶原的共价交联在纤维化疾病进展中特别重要[197]. LOX在组织修复和纤维化条件下上调[198]在成纤维细胞培养中由TGF-β1诱导[199–201]. 此外，LOX在促进皮肤、心脏、肝脏、肾脏和肺纤维化中成纤维细胞-肌成纤维细胞的活化方面起着关键作用[195,202–204]. LOX将成纤维细胞分泌的胶原转化为不溶性纤维，有助于硬ECM的积累，从而有助于纤维化的进展/持续[198,205,206]. 除LOX外，最近还发现LOXL2可形成纤维特异性和稳定的胶原交联[207]. LOXL2氧化脱去胶原蛋白和弹性蛋白特异赖氨酸残基的ε-胺基[208]。

胶原交联也发生在没有糖基化酶支持的情况下；虽然这一过程相对较慢，但由于胶原蛋白的周转时间较短，在皮肤中的半衰期为15年，在软骨中的半衰期延长一个数量级，因此在生理上是相关的[209,210]. 糖尿病等各种纤维化和纤维化前疾病的特征是晚期糖基化终产物（AGEs）的病理水平以及糖基化导致的组织硬化[211]. AGEs促进I型和III型胶原蛋白的产生，因此具有促纤维化作用[212,213]，增加成纤维细胞增殖[214]诱导TGF-β1依赖性和非依赖性纤维化改变[215,216]诱导胶原蛋白糖基化[217]。

展望/结论

鉴于ECM作为纤维化介质的明确作用，似乎这些蛋白及其修饰物可能成为抗纤维化治疗靶点。然而，ECM无处不在的性质和明确的临床重要性要求我们努力确定正常和疾病状态下ECM组成的差异。例如，我们小组使用质谱法评估了正常人肺和纤维化人肺中ECM成分的差异，确定了一些ECM分子在病变器官中明显过度表达[218]. 虽然需要进一步研究来确定这些变化是否反映了致病机制或仅仅是副现象，但我们认为ECM分子、结构域或交联可能为进展性纤维化疾病患者提供新的治疗靶点。

在肌成纤维细胞ECM的主要成分列表中，FN似乎是控制肌成纤维纤维细胞发育和存活的合适靶点。然而，FN对发育的关键性质表明需要在分子内进行特异性靶向。在这方面，FN的EDA结构域作为治疗纤维化疾病的潜在治疗靶点更具吸引力，因为它是肌成纤维细胞ECM的一个特殊而关键的组成部分，在多种纤维化疾病中高度上调，但在大多数正常结缔组织中几乎不存在[219–221]。

除了针对EDA FN外，目前正在调查的第二个潜在目标是LOXL2[222,223]. 使用抑制剂β-氨基丙腈（BAPN）靶向LOX的初步研究减少了胶原交联和瘢痕形成，但由于药物毒性，没有进行临床试验[224]. 然而，LOXL2也在纤维化组织中被发现，并且与纤维化组织相关[208,225]. LOXL2抗体目前正在考虑用于纤维化疾病的临床试验[222,223]。

除了干扰ECM蛋白外，靶向整合素作为特定ECM受体成为另一种有希望的治疗方法[226]. 许多整合素通过各种途径参与纤维化和肌成纤维细胞分化，包括α3β1[227], α11β1 [228,229]，整合素αvβ3[230], α4β7 [90]和β1整合素[186,231]. 特别有趣的是，αvβ6整合素，对TGF-β1的上皮激活是必要的[232]αvβ5整合素参与间充质细胞激活TGF-β1，已成为纤维化疾病的潜在靶点。目前，针对特发性肺纤维化患者的第2阶段试验正在测试αvβ6整合素的抗体治疗（Clinicaltrials.gov标识符{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01371305”，“term_id”：“ncT0137130”}}NCT01371305型).

总之，实验数据表明，肌成纤维细胞及其ECM是多种器官病理性纤维化的关键因素。我们在这一领域的知识为即将到来的和当前的纤维化疾病患者临床试验奠定了基础。进一步研究ECM促进纤维化的机制可能会发现其他有希望的潜在治疗干预靶点。

致谢

脚注

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