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.2011年3月25日；6（3）：e17644。
doi:10.1371/journal.pone.0017644。

大鼠滴注双乙酰后出现严重气道上皮损伤、异常修复和闭塞性细支气管炎

斯科特·帕尔默 1, 戈登·P·弗莱克, 弗兰·凯利, 海伦·L·张, 朱莉娅·伦金特, 帕特里克·J·柯比, 朱莉·F·福利, 威廉·M·格温, 丹·L·摩根
附属公司

大鼠滴注双乙酰后出现严重气道上皮损伤、异常修复和闭塞性细支气管炎

斯科特·帕尔默等人。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：闭塞性细支气管炎（BO）是一种发生在多种临床环境中的纤维化肺部疾病，包括毒素暴露、自身免疫和肺或骨髓移植。尽管其临床重要性日益增加，但由于缺乏足够的小动物BO模型，对其潜在的疾病机制知之甚少。最近的流行病学研究表明，接触二乙酰（DA）是人造黄油调味料中的一种挥发性成分，是健康工厂工人出现BO的原因之一。我们的总体假设是DA会导致严重的上皮损伤和异常修复，从而导致BO的发生。因此，本研究的目的是1）确定DA是否通过气管内滴注（ITI），将导致大鼠BO的发生，2）描述DA ITI后上皮再生和基质修复的特征。

方法和主要结果：雄性Sprague-Dawley大鼠接受ITI单剂量DA（125 mg/kg）或无菌水（载体对照）治疗。灌注DA导致气道特异性损伤，随后出现快速上皮再生和BO的广泛腔内气道纤维化特征。气道阻力和肺液中性粒细胞增多随着BO的发展而发生，与人类疾病相似。尽管DA治疗后上皮细胞迅速再生，但正常表型标记物、Clara细胞分泌蛋白和乙酰化微管蛋白的表达却减少。相反，基质成分Tenascin C的表达显著增加，尤其是在BO病变中。

结论：我们已经确定DA的ITI导致BO，从而创建了一种新的化学诱导的动物模型，该模型复制了人类疾病的组织学、生物学和生理学特征。此外，我们证明BO中存在上皮修复失调和基质肌肽C过度沉积，为潜在的疾病机制和治疗靶点提供了新的见解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。滴注双乙酰后闭塞性细支气管炎上皮损伤的进展。
a、 滴注后7天，对照啮齿动物的支气管显示出正常的气道上皮和结构（H&E，200x）。b、 滴注后1天，经二乙酰-（DA-）处理的啮齿动物的支气管显示上皮脱落（箭头）和支气管周围炎症（箭头）（H&E，100x）。c、 滴注后3天，DA处理啮齿动物的支气管显示再生上皮轻度增生（箭头所示），（H&E，200x）。d、 滴注后3天，DA处理啮齿动物的支气管在上皮糜烂区域显示纤维化（箭头），细支气管底部再生上皮（箭头）和混合性腔内炎症（H&E，100x）。e、 以息肉样腔内纤维化和支气管周围炎症为特征的细支气管BO（H&e，100x）。f、 支气管壁内同心纤维化，典型的收缩性BO（H&E，100x）。g、 h，晚期BO病变，气道几乎完全阻塞。g、 广泛的腔内闭塞，仅有少量上皮残留（H&E，200x）。h、 广泛的腔内胶原和纤维化（蓝色）（Masson’s Trichrome，200x）。
图2
图2。二乙酰治疗大鼠的肺功能改变。
用双乙酰（DA）或水（对照）治疗7天后评估肺功能。a、 与对照组相比，经DA治疗的大鼠的气道阻力（R）显著增加（**p<0.01）。b、 c，与对照组相比，DA治疗组大鼠的动态顺应性（c）和静态顺应性（Cst）均显著降低（***p<0.001）。
图3
图3。双乙酰暴露导致早期上皮细胞CCSP转录物丢失，随后胶原沉积。
用水或双乙酰（DA）处理的啮齿动物的实时PCR mRNA水平进行全肺转录分析。在每个时间点（第1天、第3天和第7天），都将经DA-处理的啮齿动物与其相应的经水处理的啮齿类动物进行比较。a、 CCSP转录在第1、3和7天显著下调。b、 在DA治疗后1天，SPC转录受到的影响最小，在第3天和第7天恢复到与水分控制相似的表达水平。c、 胶原1α-1转录物在DA治疗后第3天和第7天显著上调，与BO组织学一致。
图4
图4。双乙酰治疗一天后，出现严重的上皮损伤并失去正常上皮结构。
a、 d、CCSP（红色）和乙酰化微管蛋白（AcT）的联合免疫检测（绿色）。b、 e、CCSP（红色）和SMA（绿色）共免疫。c、 f，共免疫CCSP（红色）和β-catenin（绿色）。DAPI是一种核反击武器，以蓝色显示。对照啮齿动物（a、b、c）的气道在CCSP、AcT、SMA和β-catenin（200x）的对照组中显示基线表达。CCSP和AcT（a）在整个小气道中表达，气道周围有一层薄薄的SMA（b）。β-catenin染色显示膜相关表达（c）。暴露（d，e，f）后一天，DA-处理啮齿动物的气道显示CCSP、AcT（d）和β-catenin（f）（400x）的上皮蛋白表达严重缺失。β-catenin染色（f）也显示了损伤后的扁平细胞结构。
图5
图5。滴注双乙酰后受损上皮再生。
a、 b、c、d、CCSP（红色）和BrdU（绿色）的共免疫检测，以及DAPI（蓝色）核抗血清。a、 第3天，对照啮齿动物的呼吸道显示CCSP的预期分布，但未检测到BrdU（100倍）。b、 用双乙酰（DA）治疗的啮齿动物的早期病变显示，在第3天（200x），BrdU检测到显著的上皮再生。c、 DA暴露后第3天出现的中度BO病变显示沿着上皮以及纤维化病变内有明显的BrdU染色（箭头所示）（200x）。如b和c所示，再生区域与上皮CCSP染色不共存。d、 在第7天的晚期BO病变中，CCSP分布与正常情况相比仍然异常且减少，再生也减少（200倍）。
图6
图6。受损的上皮细胞再生，表现出异常的细胞组成，并发展为BO。
a、 d，g表示CCSP（红色）和乙酰化微管蛋白（AcT）（绿色）的联合免疫检测。b、 e、h是CCSP（红色）和SMA（绿色）的联合免疫染色。c、 f，i是CCSP（红色）和β-catenin（绿色）的联合免疫染色。DAPI是一种核反击武器，以蓝色显示。a、 b，c表示来自对照啮齿动物（200x）的气道。d、 e，f表示滴注后3天（200x）DA-处理啮齿动物的早期损伤。g、 h，i表示滴注后7天（400倍），DA-处理过的啮齿动物的晚期损伤气道。DA后三天，β-catenin表达正常，表明上皮细胞发生了重新填充（f），但CCSP和AcT表达明显减少（d，e），表明重新填充的上皮细胞没有表现出正常的气道细胞组成。与第3天相似，晚期第7天BO病变也显示CCSP和AcT表达缺失；然而，β-catenin的表达也不规则，反映了腔内息肉样病变上覆盖的变形上皮。
图7
图7。双乙酰治疗后，肌肽C转录和蛋白上调。
实时PCR显示水或双乙酰（DA）处理过的啮齿动物全肺总RNA的mRNA水平。在每个时间点（第1天、第3天和第7天），将经DA-处理的啮齿动物与相应的对照啮齿动物进行比较。a、 DA暴露后第3天和第7天，Tn-C转录物显著上调。b、 c，图像显示Tn-c（红色）和SMA（绿色）的联合免疫检测。DAPI是一种核反染剂，用蓝色表示。b、 在第3天早期，中型受累气道的病变显示Tn-C在活动性管腔内纤维化区域表达，而SMA主要在气道壁中检测到（200x）。代表晚期第7天病变的较大气道c也显示了整个纤维化BO病变的Tn-c沉积（200x）。
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