美国生理学杂志心脏循环生理学。2012年11月1日；303（9）：H1114–H1127。
使用N个-乙酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸预防大鼠实验性自身免疫性心肌炎
,1,* ,1,* ,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,2 ,三 ,1 ,1和
1 中川巴勃罗
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究科；
刘云和
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
汤东寮
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
陈晓娟
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
German E.González先生
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
凯文·博比特
2密歇根州底特律亨利·福特医院生物统计学和流行病学研究部；和
德里克·斯莫拉雷克
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
埃德·彼得森
2密歇根州底特律亨利·福特医院生物统计学和流行病学研究部；和
罗斯·凯德尔
三科罗拉多丹佛大学免疫学与国家犹太卫生综合系
杨晓萍
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
努尔·埃丁·拉勒布
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
奥斯卡·A·卡罗罗
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
1密歇根州底特律亨利福特医院内科高血压和血管研究部；
2密歇根州底特律亨利·福特医院生物统计学和流行病学研究部；和
三科罗拉多丹佛大学免疫学与国家犹太卫生综合系
通讯作者。 *P.Nakagawa和Y.Liu对这项工作做出了同等贡献。
转载请求和其他通信地址：O.A.Carretero，高血压和血管研究部，2799，W.Grand Blvd.，Detroit，MI 48202（电子邮件：1terraco处的gro.shfh). 收到日期：2011年3月25日；2012年8月19日接受。
摘要
心肌炎通常与嗜心性感染有关，并与自身免疫的发展有关。N个-乙酰-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP）是一种天然存在的四肽，可预防高血压和其他心血管疾病的炎症和纤维化；然而，其对自身免疫介导的心脏病的影响尚不清楚。我们研究了Ac-SDKP在实验性自身免疫性心肌炎（EAM）中的作用，EAM是一种T细胞介导的自身免疫性疾病模型。本研究旨在验证Ac-SDKP通过调节免疫反应预防自身免疫性心肌损伤的假说。用猪心肌肌球蛋白免疫Lewis大鼠，并用Ac-SDKP或载体治疗。在EAM中，Ac-SDKP可预防收缩和舒张性心脏功能障碍、肥大和纤维化所示的重塑以及细胞介导的免疫反应，但不影响肌球蛋白特异性自身抗体或抗原特异性T细胞反应。此外，Ac-SDKP可减少巨噬细胞、树突状细胞和T细胞、促炎细胞因子[白细胞介素（IL）-1α、肿瘤坏死因子-α、IL-2、IL-17]和趋化因子（细胞因子诱导中性粒细胞趋化因子-1、干扰素-γ诱导蛋白10）对心脏的浸润，细胞粘附分子（细胞间粘附分子-1，L-选择素）和基质金属蛋白酶（MMP）。Ac-SDKP可预防自身免疫性心脏功能障碍和重塑，但不会减少自身抗体或T细胞对心肌肌球蛋白的反应。Ac-SDKP对自身免疫性心肌损伤的保护作用很可能通过抑制1)先天性和适应性免疫细胞浸润和2)促炎介质的表达，如细胞因子、趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶。
关键词：N个-乙酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸、实验性自身免疫性心肌炎、心肌肥厚、心脏功能障碍、CD4+T辅助淋巴细胞，迟发型超敏反应
心肌炎是一种炎症心肌疾病通常与嗜心性感染有关，并与自身免疫的发展有关。心肌炎诱导的扩张型心肌病是年轻人猝死的重要原因(5)30%的病例会发展为心力衰竭，这是年轻人发病和死亡的主要原因，10年生存率<40%(4,23).N个-乙酰丝氨酸天冬氨酰赖氨酰脯氨酸（Ac-SDKP）是一种由胸腺肽β释放的天然四肽4脯氨酰寡肽酶(7). Ac-SDKP几乎完全由血管紧张素转换酶（ACE）水解，ACE抑制剂可提高其血浆浓度(2,7). 已知ACE抑制剂的抗炎和抗纤维化作用部分由Ac-SDKP介导(28,30). 过度表达ACE的大鼠心脏Ac-SDKP浓度较低，纤维化增加(31). Ac-SDKP治疗可降低高血压和心肌梗死后心力衰竭患者的心脏炎症和纤维化(27,29,34,44). 在心包内半乳糖凝集素-3（巨噬细胞释放的促炎凝集素）诱导的心肌炎大鼠中，Ac-SDKP可预防心脏炎症、纤维化、肥大和功能障碍(24); 另一方面，在高血压和心肌梗死患者中，Ac-SDKP可以减少炎症和纤维化，但不能减少肥厚或改善心脏功能障碍(8,29,34,44). 虽然这些数据表明Ac-SDKP可以保护心脏免受压力过载或局部炎症反应引起的心脏损伤，但我们仍然不知道它是否可以预防自身免疫诱导的心血管疾病。为了回答这个问题，我们研究了大鼠实验性自身免疫性心肌炎（EAM），这是一种人类心肌炎的动物模型(18). 在这种情况下，以及许多其他自身免疫性疾病以及慢性炎症，巨噬细胞、树突状细胞和T辅助细胞的浸润是该过程的重要组成部分(37). 炎性细胞因子、趋化因子、细胞粘附分子和基质金属蛋白酶（MMP）都是EAM发展所必需的(12,16,33). 我们验证了Ac-SDKP通过调节免疫反应预防自身免疫性心肌损伤的假设。
材料和方法
动物。
7周大的雄性Lewis大鼠（Charles River，Wilmington，MA）被安置在一个有空调的房间里，12:12小时的光暗循环，并给予标准的鼠食（0.4%钠）和自来水。他们有7天的时间适应新环境。在所有手术前，使用布托啡诺（2 mg/kg sc）进行镇痛，并使用戊巴比妥钠（50 mg/kg ip）进行麻醉。所有方案均由亨利·福特医院动物护理和使用机构委员会批准。
EAM的引入。
根据Kitabayashi的方案在Lewis大鼠中诱导EAM(17). 实验开始时，所有大鼠都接受了免疫接种(第0天)7天后再次(第7天). 在每次免疫中，对大鼠进行麻醉，并皮内注射1 mg猪心肌肌球蛋白（西格玛，圣路易斯，密苏里州），该肌球蛋白与等量的完全弗氏佐剂（CFA）乳化，辅以分枝杆菌属结核病H37RA。
实验方案。
大鼠被随机分为以下四组：1)对照组，注射CFA并用渗透微型泵（Alzet）注入生理盐水；2)Ac-SDKP，注射CFA和Ac-SDKP800μg·kg−1·天−1);三)EAM，在CFA中注射乳化猪肌球蛋白并注入生理盐水；和4)EAM+Ac-SDKP，在CFA中注射乳化猪肌球蛋白，并注入Ac-SDKP800μg·kg−1·天−1). Ac-SDKP输液开始于第0天根据所研究的参数，在不同的时间点处死大鼠。免疫后2周，我们测量MMP活性。在3周时，测量总白细胞浸润、延迟型超敏反应（DTH）、自身抗体滴度、抗原特异性T细胞反应、T辅助细胞胞内细胞因子、树突状细胞浸润以及细胞因子、趋化因子和粘附分子的心肌表达。在4周时，我们测量了器官重量、血压、心脏功能、胶原沉积、巨噬细胞和T细胞浸润以及MMP活性。
血压和超声心动图。
在免疫前和免疫后4周，用尾袖法测量未麻醉大鼠的收缩压（SBP）。麻醉大鼠后，在免疫前和免疫后4周，使用带有15MHz换能器的Acuson Sequoia C 256进行超声心动图和多普勒超声检查，并进行心电图检查。首先在胸骨旁长轴切面进行M型超声心动图测量左心室（LV）尺寸，然后在前短轴切面评估左心室射血分数（LVEF）。使用透射多普勒流入波测量舒张早期峰值充盈速度（E波）、心房收缩时峰值充盈速率（A波）及其比值（E/A），如前所述评估舒张功能(32). 在确定主动脉根部尺寸（AoD）和收缩速度-时间积分（VTI）后，根据以下公式计算卒中体积：卒中体积=（VTI[（AoD/2）2]和心输出量（CO），使用公式：CO=中风量×心率（HR）。以200 mm/s的扫描速度记录5至7个心动周期的所有多普勒频谱。
心、肺、肝、肾、胸腺和脾脏重量。
免疫四周后，通过注射15%氯化钾溶液使大鼠麻醉，心脏在舒张期间停止跳动，然后切除、称重，并表示为心脏重量（HW）与体重（BW）的比值。还取出肺、肝、肾、胸腺和脾脏并称重。
组织学。
左心室从顶点到基底横切为四层。两个中间切片（双心室横切面）用于组织学和免疫组织化学研究，底部和顶部用于蛋白质分析。将五个显微镜切片固定在10%福尔马林中，嵌入石蜡中，并使用苏木精-伊红染色评估炎症。两名研究人员盲目分析切片，并根据以下四级系统对心肌炎症程度进行分级：1级对应于高达心脏切片的10%的心脏坏死/浸润；2级, 11–20%;3级, 21–40%; 和4级, >40% (43). 心肌间质和血管周围胶原沉积是纤维化的标志，用苦味酸红定量(40). 使用奥林巴斯IX81显微镜（奥林巴斯美国，宾夕法尼亚州中央山谷）和DP70数码相机以400倍放大率拍摄显微照片。使用奥林巴斯微套装生物系统对每个断面至少100张表面图像进行分析。通过计算胶原蛋白与整个切片的比率来评估间质胶原蛋白沉积。测量血管周围胶原，作为周围纤维化面积与总血管面积的比值。所有测量和分析均以盲法进行。
DTH分析。
根据Godsel等人描述的耳朵肿胀，在免疫后3周定量肌球蛋白DTH(11). 耳朵厚度用千分尺测量（序列号7323；Mitutoyo MTI，Aurora，IL）。0.16 M K溶液中的10微克肌球蛋白2人事军官4，0.01 M钠4P（P）2O（运行）7和0.3 M KCl(第页H 6.8）通过50至100μl玻璃Hamilton注射器和30号针头皮内注射到耳朵背面，而10μg BSA在相同溶液中注射到对侧耳朵作为对照。24小时后，从肌球蛋白处理的耳朵中减去对照耳朵的净肿胀（mm）。
抗心肌肌球蛋白自身抗体测定。
如Wang等人所述，在免疫后3周通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中的肌球蛋白特异性抗体(42). 平底96孔ELISA板通过在4°C下孵育过夜，用猪心肌肌球蛋白（10μg/ml）包被。在用0.05%PBS-Tween清洗两次平板并用1%BSA在PBS中封闭后，首先在4°C下孵育1:5000稀释的血清过夜；然后加入与碱性磷酸酶（Sigma）结合的山羊抗鼠IgG，样品在室温下孵育1h，并用PBS-Tween洗涤。最后，添加对硝基苯磷酸盐（Sigma），通过添加1 M氢氧化钠并在405 nm处测量光密度（OD），在10 min时停止反应。每个样品分析两次。
抗原特异性T细胞增殖和细胞内细胞因子。
免疫后3周从腹股沟和腘窝引流淋巴结收集细胞，再悬浮于预热的PBS/0.1%BSA中，最终浓度为1×106细胞/ml，与最终浓度为10μM的羧荧光素二醋酸酯、琥珀酰亚胺酯（CFSE）孵育10分钟。用PBS洗涤细胞两次后，将其重新悬浮在T细胞培养基中（含有10%FBS、50μM 2-巯基乙醇、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640）并放置在预加载5×10的96 well Microiter板（Corning-Costar）中5用50μg/ml心肌肌球蛋白脉冲照射的同基因脾细胞24小时。将样品与50μg/ml猪心肌肌球蛋白在37°C、含5%CO的湿润气氛中孵育6天2孵育后，用抗体[APC-Cy7抗CD45，OX-1（BioLegend）；PE-Cy7抗-CD8，OX-8（eBioscience）；PE-Cy5抗-CD4，OX-35（BD Bioscinces）；APC抗CD25，OX-39（eBios）]对细胞进行染色，并在室温下用1%多聚甲醛固定20分钟。使用LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）分析样品和荧光激活细胞分选（FACS）Diva软件（6.1.3版）。细胞增殖计算为CD45的百分比+，CD4+和CD25+门控细胞CFSE荧光强度降低。对于细胞内细胞因子测定，1×106用80 ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐+1μg/ml离子霉素和20 ng/ml布氏菌素A在37°C下刺激淋巴结细胞4小时，然后清洗、染色表面标记物，在室温下用1%多聚甲醛固定20分钟，再悬浮在渗透缓冲液中。细胞内标记物用一系列抗体染色：FITC抗干扰素（IFN）-γ，DB-1（Biolegend）；PE抗白细胞介素（IL）-4，OX-81（BD Biosciences）；和PerCp-Cy5.5抗IL-17，Tc11（Biolegend）。所有分析均使用BD Biosciences LSR II流式细胞仪。
免疫组织化学染色。
用适当的抗体对六微米冰冻切片进行免疫染色：抗CD45（总白细胞）、ED-1（单核细胞/巨噬细胞）、CD11c（树突状细胞）、CD4（T辅助细胞）或CD8（T细胞毒细胞）。阴性对照以类似的方式进行处理，但未使用一级抗体进行治疗。高倍视野中计数细胞核清晰可见的阳性细胞（红/深棕色染色），并以每平方毫米细胞数表示(9). 所有测量和分析均以盲法进行。
蛋白质组阵列。
心脏横截面在裂解缓冲液（含有1%Triton X-100、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml亮氨酸肽和10μg/ml胃蛋白酶抑制素的PBS）中均匀化。使用蛋白质组阵列试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Biosciences）测量组织匀浆中29种炎症介质的蛋白质水平；其中包括IL-1α和β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-2、干扰素-γ诱导蛋白10（IP-10）、细胞因子诱导中性粒细胞趋化因子-1（CINC-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1α、细胞间黏附分子-1和L-选择素。数据表示为任意单位（AU），表示蛋白质的OD除以阳性对照。
蛋白质印迹。
在还原条件下对来自心脏提取物的20微克蛋白质进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Invitrogen，Carlsbad，CA），并转移到聚偏二氟乙烯膜（GE Healthcare，Piscataway，NJ）。用5%脱脂牛奶封闭每个膜1小时，并在4°C下与抗鼠ICAM-1（1:500；明尼阿波利斯研发系统公司，明尼苏达州）或抗GAPDH（1:50000；马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术公司）孵育过夜。将膜与适当的过氧化物酶结合二级抗体（稀释为1:2000）孵育60分钟（加州圣克鲁斯圣克鲁斯市圣克鲁斯科技公司）。ECL-plus化学发光检测系统试剂（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）用于可视化条带，使用Epson Perfection 3200扫描胶片（Epson America，Long Beach，CA）。
心脏组织匀浆中金属蛋白酶-2和-9的活性。
按照Zibadi等人的描述，在免疫后2周和4周进行明胶酶谱分析(45). 用冰冷的生理盐水洗涤10毫克心脏组织，并在含有10 mM二碳酸、150 mM NaCl、20 mM ZnCl的0.5 ml提取缓冲液（pH 5.0）中匀浆2，1.5 mM NaN三和0.01%Triton X-100。离心匀浆，将上清液用于10%的聚丙烯酰胺凝胶酶谱（德国法兰克福Novex）。在125 V和4°C下电泳90 min后，用复性缓冲液（2.5%Triton X-100）在室温下洗涤凝胶两次30 min。然后将酶谱转移到活性缓冲液（50 mM Tris·HCl，pH 8.0，5 mM CaCl20.2M NaCl和0.02%Brij-35），并在37°C下培养12h。用考马斯亮蓝G-250（0.25%）固定和染色后，用10%（vol/vol）乙酸对酶谱进行脱色，并通过图像分析对酶带进行定量。
数据分析。
所有数据均以平均值±SE表示。数据的统计显著性通过Kruskall-Willis检验、Wilcoxon双样本分析或ANOVA分析、Tukey检验进行分析。值为P（P）<0.05被认为是显著的。
结果
体重和器官重量。
免疫后4周各组间体重无显著差异；然而，EAM大鼠的肺和胸腺重量均增加。Ac-SDKP阻止了肺重量的增加，但对对照组没有影响。所有组的肝脏、脾脏和肾脏重量相似().
表1。
| 控制 | Ac-SDKP公司 | EAM公司 | EAM+Ac SDKP公司 |
|---|
| 体重，克 | 325 ± 4 (12) | 326 ± 4 (12) | 305 ± 8 (13) | 321 ± 8 (14) |
| 肺/BW，mg/100 g | 338 ± 22 (12) | 367 ± 8 (12) | 430 ± 16*（13） | 377 ± 8.6# (14) |
| 肝脏/BW，g/100 g | 3.66 ± 0.11 (8) | 3.66 ± 0.16 (8) | 3.79 ± 0.14 (10) | 3.58 ± 0.08 (9) |
| 胸腺/BW，mg/100 mg | 137 ± 6 (12) | 141 ± 7 (12) | 165 ± 11*(14) | 140 ± 6 (13) |
| 脾脏/BW，mg/100 g | 174 ± 7 (6) | 182±6（6） | 174 ± 5 (8) | 174 ± 8 (7) |
| 肾脏/BW，g/100 g | 0.86 ± 0.06 (9) | 0.81 ± 0.02 (12) | 0.89 ± 0.05 (8) | 0.81 ± 0.02 (7) |
收缩压和心功能（超声心动图）。
由第4周EAM组收缩压显著降低。Ac-SDKP阻止了这种下降，但对对照组没有影响(). EAM组经BW校正的HW显著升高，但Ac-SDKP阻止了这种升高，而对照组没有变化(). 患有EAM的大鼠的CO显著降低，而Ac-SDKP可以阻止CO的产生，而对照组再次表现出无变化(). 此外，EAM组的左室质量和后壁厚度增加，而LVEF、缩短分数、左室充盈早期的多普勒E波与左室舒张功能指标A波的比值均降低；Ac-SDKP可预防这些异常。各组之间的HR无差异().
A类：在对照组和实验性自身免疫性心肌炎（EAM）大鼠实验开始和结束时（免疫后4周）用尾袖测量收缩压N个-乙酰-SDKP(n个= 12–14).B类：免疫后4周，对照组和EAM大鼠用溶媒或Ac-SDKP治疗后测得的体重（肥大指标）校正的心脏重量(n个= 11–13).C：免疫后4周，对照组和EAM大鼠用溶媒或Ac-SDKP治疗后通过超声心动图测量心输出量(n个= 11–14). *第页<0.01和**第页<0.001，EAM+车辆与.控制+车辆#第页<0.05和##第页<0.001，EAM+Ac-SDKP与.EAM+车辆。
表2。
Ac-SDKP对EAM大鼠免疫4周后超声心动图参数测定的影响
| 控制(n个= 12) | Ac-SDKP公司(n个= 11) | EAM公司(n个= 14) | EAM+Ac-SDKP(n个= 13) |
|---|
| PWT（毫米） | 1.58±0.06 | 1.65 ± 0.04 | 1.88 ± 0.08** | 1.60 ± 0.06### |
| LV质量（mm三)/100克体重 | 201±7 | 200 ± 6 | 247 ± 18* | 188 ± 7### |
| 平方英尺，% | 58.0 ± 1.4 | 58.7 ± 1.2 | 50.2 ± 1.6* | 55.4 ± 1.3# |
| LVEF，% | 81.5 ± 0.9 | 83.3 ± 0.6 | 66.7 ± 2.6** | 77.8 ± 2.5### |
| E/A比率 | 1.49 ± 0.04 | 1.45 ± 0.05 | 1.21 ± 0.07** | 1.47 ± 0.04## |
| 心率，次/分钟 | 379 ± 10 (12) | 383 ± 12 (11) | 395 ± 9 (14) | 388±9（13） |
心脏的宏观和微观评估。
由第3周，在EAM+车辆的心脏中观察到变色区域，但在EAM+Ac SDKP或对照组中没有观察到(,左边). EAM组只有一只大鼠出现心包积液。显微镜检查仅显示EAM组的炎症部位(,中心). 与对照组相比，EAM的炎症评分增加（EAM 2.20±0.02 AU，对照组1.14±0.02 AU，第页<0.001），EAM+Ac-SDKP组的这种增加显著减少（EAM+Ac-SDKP:1.49±0.14 AU，第页与EAM相比<0.05）(,中心). EAM组还显示CD45的浸润增加+白细胞与对照组相比（319.3±68.7 vs.42.4±3.2细胞/mm2；第页<0.001），Ac-SDKP部分阻止了这种增加（146.1±54.5 vs.319.3±68.7 cells/mm2；第页与EAM相比<0.05）。Ac-SDKP对对照组无影响（48.5±5.1细胞/mm2) (,正确的).
左侧：免疫后3周，在对照组和经溶媒或Ac-SDKP治疗的EAM大鼠中拍摄的代表性全心脏照片。居中：免疫3周后，对照组和经溶媒或Ac-SDKP治疗的EAM大鼠心脏切片苏木精和伊红染色的代表性图像。赖特：心肌白细胞浸润的代表性图像（红色：CD45+)免疫后3周，对照组和EAM大鼠用溶媒或Ac-SDKP治疗。
心脏间质和血管周围胶原。
由第4周EAM组心肌间质和血管周围胶原沉积均较高；Ac-SDKP阻止了这种增加，但对对照组没有影响(,A类和B类).
左侧：心肌间质(A类)和血管周围(B类)在用载体或Ac-SDKP处理的对照大鼠和EAM大鼠中，免疫4周后通过苦果红染色测量胶原沉积。赖特：间隙定量数据(A类)和血管周围(B类)纤维化，表示为纤维化面积的百分比(n个= 12–14). NS，不显著。
DTH。
免疫后三周，我们通过在左耳注射心肌肌球蛋白来测量DTH，并用无关蛋白（BSA）处理右耳作为对照。EAM组右耳无变化，但左耳可见肿胀的红色结节。Ac-SDKP阻止了DTH的增加().
A类：免疫后3周，在对照组和EAM大鼠中用溶媒或Ac-SDKP治疗后测定猪心肌肌球蛋白的延迟型超敏反应（以净耳肿胀mm表示）(n个= 4–6).B类：用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定免疫后3周采集的血清样本中的心肌肌球蛋白特异性自身抗体(n个= 3).
抗心肌肌球蛋白自身抗体测定。
3周时，EAM大鼠的血清样本显示自身抗体增加。Ac-SDKP未能阻止这种增加，并且对对照组没有影响().
抗原特异性T细胞增殖和细胞内细胞因子。
由第3周在EAM大鼠中，用抗原（心肌肌球蛋白）孵育淋巴结细胞可诱导T辅助细胞增殖，但在对照组中没有，Ac-SDKP不能阻止这种增殖(). 细胞内FACS分析显示，经载体或Ac-SDKP治疗的EAM大鼠Th2亚群（IL-4阳性）趋于增加（尽管差异无统计学意义），而Th1亚群（IFN-γ阳性）未受影响。EAM组五分之三的大鼠Th17增加（IL-17阳性）。虽然EAM和EAM+Ac-SDKP没有显著差异，但EAM+Ac-SDKP组的大鼠Th17水平没有增加().
A类：代表性直方图显示，对照组和EAM大鼠服用溶媒或Ac-SDKP后，辅助T细胞增殖对心肌肌球蛋白的反应。流式细胞术显示，辅助T细胞的增殖表现为羧基荧光素二乙酸酯、琥珀酰亚胺酯（CFSE）荧光强度降低。B类：定量数据，以门控细胞外增殖细胞百分比表示：CD45+，CD4+和CD25+，分别是总白细胞、辅助T细胞和T细胞激活的标记。
左侧：干扰素-γ（IFN-γ）阳性（+）的定量(A类)，白细胞介素（IL）-4+(B类)和IL-17+(C)对照组和经溶媒或Ac-SDKP治疗的EAM大鼠在未刺激（开放三角形）和佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）/离子霉素刺激条件（封闭三角形）下淋巴结细胞群中的T辅助细胞。赖特：图中显示了分析CD45中不同辅助T细胞亚群的代表性样本中的门控策略+和CD4+事件。使用CD45表达和侧面散射特性对总白细胞进行门控。随后，CD45+CD4上的细胞被选通+和CD8+细胞，随后分析IL-4、IFN-γ和IL-17的表达。
巨噬细胞、树突状细胞、T辅助细胞和细胞毒性T细胞对心脏的浸润。
心肌ED-1阳性巨噬细胞，CD4+T辅助细胞和CD8+EAM组细胞毒性T细胞在第4周而CD11c阳性树突状细胞在3周后显著增加。Ac-SDKP阻止了除细胞毒性T细胞外的所有这些增加，但对对照组没有影响(和).
A类:左边，免疫4周后，对照组和EAM大鼠用溶媒或Ac-SDKP治疗后心肌巨噬细胞浸润的代表性图像（红色：ED-1阳性）。赖特，定量数据，表示为单元格/mm2(n个= 11–13).B类:左边，免疫后3周，对照组和EAM大鼠用溶媒或Ac-SDKP治疗后心肌树突状细胞浸润的代表性图像（红色：CD11c阳性）。赖特，定量数据，单位为细胞/mm2(n个= 7–8).
左侧：心肌辅助T细胞的代表性图像（红色：CD4阳性）(A类)和T细胞毒性浸润（红色：CD8阳性）(B类)免疫后4周，对照组和EAM大鼠用溶媒或Ac-SDKP治疗。赖特：定量数据，以单元格/mm表示2(n个= 10–14).
促炎细胞因子和细胞粘附分子的表达。
由第3周EAM组与先天性（IL-1α，TNF-α）和适应性（IL-17）免疫反应以及趋化因子（CINC-1和IP-10）相关的细胞因子的心脏蛋白表达增加，但Ac-SDKP阻止了这些细胞因子的表达。Ac-SDKP还降低了IL-2，EAM组IL-2没有显著增加(). EAM大鼠的细胞黏附分子L-选择素和ICAM-1也增加，并被Ac-SDKP阻止(). ICAM-1蛋白的Western blots显示出类似的结果(). EAM组的其他炎症介质如CINC-3、IL-1β、IL-1ra、IL-6、LIX、MIP-1α、胸腺趋化因子和MMP-1组织抑制剂也增加，Ac-SDKP可以阻止这些炎症介质的增加（参见). Ac-SDKP对对照组的任何炎症介质均无影响。
与先天免疫相关的细胞因子表达[IL-1α，肿瘤坏死因子（TNF）-α](A类)、与适应性免疫相关的细胞因子（IL-2和IL-17）(B类)和趋化因子[细胞因子诱导中性粒细胞趋化因子-1（CINC-1），干扰素-γ诱导蛋白10（IP-10）](C)免疫后3周，用市售大鼠细胞因子阵列试剂盒对对照组和经溶媒或Ac-SDKP治疗的EAM大鼠的心脏进行测量(n个= 5).
A类：免疫3周后，用市售大鼠细胞因子阵列试剂盒在用载体或Ac-SDKP治疗的对照和EAM大鼠的心脏中测量细胞间粘附分子（ICAM）-1和L-选择素的表达(n个= 5).B类：通过Western blot测量对照组和EAM大鼠心脏ICAM-1表达的代表性图像(n个= 5).
表3。
免疫后3周，在对照组和EAM大鼠心脏匀浆中用载体或Ac-SDKP治疗后测量额外的炎症介质
| 蛋白质 | 控制 | Ac-SDKP公司 | EAM公司 | EAM+Ac-SDKP |
|---|
| CINC-2α/β | 0.24±0.04 | 0.29 ± 0.12 | 0.57 ± 0.10 | 0.08 ± 0.05 |
| CINC-3公司 | 0.82 ± 0.24 | 0.45±0.13 | 1.46 ± 0.30 | 0.58 ± 0.21# |
| CNTF公司 | 0.45 ± 0.12 | 0.28 ± 0.08 | 0.55 ± 0.14 | 0.24 ± 0.07 |
| Fractalkine公司 | 1.35 ± 0.30 | 1.11 ± 0.30 | 1.62 ± 0.37 | 1.10 ± 0.35 |
| GM-CSF公司 | 1.32 ± 0.73 | 0.73 ± 0.32 | 0.91 ± 0.34 | 0.47 ± 0.16 |
| 干扰素-γ | 0.85 ± 0.20 | 0.69 ± 0.23 | 0.96 ± 0.21 | 0.87 ± 0.20 |
| IL-1β | 0.35 ± 0.11 | 0.50 ± 0.19 | 1.76±0.35** | 0.29 ± 0.07### |
| 白细胞介素-1受体 | 0.30 ± 0.10 | 0.23 ± 0.10 | 19.96 ± 7.45* | 0.30 ± 0.12# |
| 白介素-3 | 0.57 ± 0.16 | 0.56 ± 0.18 | 1.28±0.28 | 0.29 ± 0.08 |
| 白介素-4 | 0.50 ± 0.14 | 0.57 ± 0.16 | 0.60 ± 0.18 | 0.28 ± 0.10 |
| 白介素-6 | 1.01±0.23 | 0.71 ± 0.17 | 1.56 ± 0.21 | 0.72 ± 0.17# |
| 白介素-10 | 0.66 ± 0.20 | 0.49 ± 0.10 | 0.57 ± 0.11 | 0.67 ± 0.20 |
| 白介素-13 | 0.70 ± 0.22 | 0.55 ± 0.16 | 1.01 ± 0.23 | 0.67 ± 0.17 |
| LIX公司 | 1.16 ± 0.31 | 1.03 ± 0.24 | 19.61 ± 5.78* | 1.02 ± 0.25## |
| 金属惰性气体（MIG） | 0.84 ± 0.21 | 0.69 ± 0.15 | 3.29 ± 1.30 | 0.57 ± 0.15 |
| MIP-1α | 0.40±0.21 | 0.19 ± 0.07 | 1.54 ± 0.23** | 0.24 ± 0.09### |
| MIP-3α | 0.55 ± 0.28 | 0.35 ± 0.08 | 1.14 ± 0.19 | 0.61 ± 0.32 |
| 兰特斯 | 2.23±0.55 | 1.97 ± 0.38 | 5.22 ± 1.71 | 2.29 ± 0.62 |
| 胸腺趋化因子 | 37.33 ± 2.90 | 38.42±5.66 | 53.09 ± 3.20 | 33.19 ± 5.01# |
| TIMP-1公司 | 0.52 ± 0.08 | 0.45 ± 0.09 | 66.30 ± 14.15** | 1.06 ± 0.51### |
| 血管内皮生长因子 | 1.82 ± 0.64 | 1.98 ± 0.61 | 2.83 ± 0.50 | 1.24 ± 0.21 |
金属蛋白酶-2和-9活性。
由第2周EAM组心肌中MMP-2和MMP-9活性均较高，Ac-SDKP阻止了这种升高(). 然而，MMP-9在第4周而MMP-2检测不到（数据未显示）。
A类：显示基质金属蛋白酶（MMP）-9的代表性图像(顶部)和MMP-2(底部)免疫后2周，用酶谱法测定对照组和经溶媒或Ac-SDKP治疗的EAM大鼠心脏的活性。MMP-9定量数据(B类)和MMP-2(C)活动表示为控制的百分比(n个= 3–6).
讨论
在用心肌肌球蛋白免疫的Lewis大鼠中，Ac-SDKP预防低血压、心脏重塑（肥大、炎症和纤维化）和功能障碍。使用高血压和心肌梗死模型，我们发现Ac-SDKP降低了心脏巨噬细胞浸润、转化生长因子-β表达和纤维化；然而，它并没有改善心脏功能或减少肥厚(44). 我们还通过心包内输注galectin-3诱发心肌炎，发现Ac-SDKP不仅可以减轻纤维化和炎症，还可以预防心脏功能障碍和肥大(24). 观察到Ac-SDKP改善了galectin-3诱导的心肌炎和EAM患者的心脏重塑和功能，但在高血压和MI患者中没有改善，这可能与重塑和功能障碍的病因和发病机制有关。EAM被认为是T细胞介导的自身免疫性疾病(19)，心脏损伤的机制不同于galectin-3诱导的心肌炎。半乳糖凝集素-3是巨噬细胞释放的一种凝集素，当注入心包时会引起局部炎症，而EAM是通过免疫心肌肌球蛋白而诱导的，这会导致免疫系统对心脏自身蛋白产生反应；因此，与galectin-3诱导的心肌炎相反，EAM中观察到的自身免疫反应不仅依赖于先天免疫系统的激活，也依赖于适应性免疫系统的活化。我们相信，本文的研究结果首次证明Ac-SDKP在自身免疫介导的心脏病模型中具有心脏保护作用。免疫四周后，EAM大鼠的SBP显著降低，可能是因为CO降低。Ac-SDKP阻止了BP和CO的降低，进一步支持了SBP下降可能是继发于心功能降低的假设。然而，即使收缩压较低，EAM大鼠也有心肌肥大，这表明重塑和功能障碍是由于不依赖于后负荷的自身免疫反应所致。在免疫大鼠中，超声心动图显示Ac-SDKP阻止收缩和舒张功能下降，同时后壁厚度和左室重量减少，表明Ac-SDKP阻止了自身免疫诱导的肥大；此外，BW校正的肺充血和HW都支持这些观察结果。因此，我们得出结论，在自身免疫介导的心肌损伤中，Ac-SDKP不仅可以预防心脏炎症和纤维化，还可以预防心肌肥大以及收缩和舒张功能障碍。我们很容易假设，在接受Ac-SDKP治疗的大鼠中，心脏纤维化的减少是舒张功能障碍改善的原因；然而，在早期的研究中，我们发现，尽管收缩功能下降，但经Ac-SDKP治疗的自发性高血压大鼠心脏纤维化减轻，肥厚或舒张功能没有改善(8). 因此，我们认为，Ac-SDKP治疗EAM动物的收缩和舒张功能障碍的预防可能归因于对多种致病因素的同时保护，包括肥大、纤维化和炎症。
心脏功能的改善和肥大的减轻伴随着炎症的减少。本研究中观察到的炎症等级与其他组的报告具有可比性(43). 我们之前发现Ac-SDKP可以减少肥大细胞和巨噬细胞的浸润(24)现在我们可以报告它还可以防止树突状细胞和T辅助细胞浸润；这一点很重要，因为两者都是免疫系统固有臂和适应性臂的关键组成部分。尽管Ac-SDKP没有降低CD8+在EAM组的T细胞中，人们公认在这些大鼠中CD4+比CD8更重要+(6,20,26,43). 有大量证据表明，TNF-α和IL-1等先天性免疫细胞因子对自身免疫的发生至关重要，因此当用IL-1或TNF-(21). TNF-rp 55基因敲除动物不发展EAM(三)单克隆抗体中和肿瘤坏死因子可以改善疾病(38). 在我们的研究中，心脏细胞因子表达谱显示，在EAM中，Ac-SDKP阻止了与先天性（IL-1α和-β、IL-6和TNF-α）和适应性[IL-2、IP-10（Th1激活标记物）和IL-17（Th17激活标记物]免疫激活相关的细胞因子的增加。Han等人(13)确定Th1反应与心肌炎的初始细胞炎症阶段相关，而Th2在纤维化加剧的慢性阶段占主导地位；Baldeviano等人(5)据报道，心肌炎不需要Th17，但对扩张型心肌病的进展至关重要。我们通过FACS鉴定淋巴结中的T亚群，发现免疫后3周EAM中Th1没有改变；然而，我们不能排除其在3周之前增加的可能性。正如我们所料，EAM患者Th2和T17亚群在3周时趋于升高；虽然Ac-SDKP对Th2没有影响，但它可以阻止Th17的增加。总之，我们推测Ac-SDKP对Th17和IL-17表达的抑制作用可能在疾病的慢性阶段防止心肌炎后重塑和发展为DCM。
Ac-SDKP阻止心肌组织中趋化因子CINC-1和IP-10的表达。CINC-1被认为是炎症期间大鼠中性粒细胞浸润的关键介质(14)而IP-10在许多细胞中诱导，以对干扰素-γ产生反应(25)在Th1型炎症性疾病中也可见，在炎症部位招募活化的T细胞中起重要作用(10).
众所周知，白细胞向炎症部位的募集需要与细胞粘附分子结合。Ac-SDKP治疗降低了L-选择素和ICAM-1的蛋白表达。据Pummer等人报道，在CD4介导的心肌炎中，内皮细胞ICAM-1的表达是自身反应性T细胞识别靶器官的先决条件(33).
MMPs也被认为对炎性细胞募集和心脏重塑至关重要(15,18,39). 因为Hishikari等人(16)我们研究了Ac-SDKP对MMP活性的影响。酶谱法测定MMP-2和MMP-9显示，EAM组2周后这两种酶均增加，Ac-SDKP可阻止这一增加；因此，我们认为Ac-SDKP可能通过减少MMPs以及趋化因子和细胞粘附分子来减少免疫细胞的浸润（以及随后的细胞因子生成）。
当我们通过DTH评估细胞介导免疫时，Ac-SDKP治疗的EAM大鼠的耳肿胀减轻。自Volkov等人(41)证明向体外培养的T细胞中添加Ac-SDKP可以阻止刀豆球蛋白A、植物血凝素和商陆有丝分裂原诱导的增殖，并且，由于Ac-SDKP最初被描述为造血干细胞增殖的生理负调节因子(22)DTH的降低使我们推测Ac-SDKP会减缓自身反应性T细胞的发育，可能伴随着自身抗体滴度的降低。我们用FACS测定了抗原特异性T细胞反应，用ELISA测定了心肌肌球蛋白特异性自身抗体，惊讶地发现Ac-SDKP不仅不能阻止自身抗体的产生，而且不能降低抗原特异性的T细胞反应，Ac-SDKP主要通过减少局部炎症环境而不是阻止自身抗体的产生和/或自身反应性T细胞的发育来预防心脏损伤。因为Ac-SDKP已被证明通过减少TNF-α的释放和贩运对巨噬细胞有直接影响(35)我们认为它通过直接作用于巨噬细胞而不是T细胞或树突状细胞来降低DTH。
从这些观察结果中，我们得出结论，Ac-SDKP可能不会阻止启动自身免疫的自身反应细胞的发育，而是通过阻止这些细胞和其他触发心脏损伤的效应细胞的浸润，在不同水平上发挥作用。Ac-SDKP的这些作用可能由细胞因子、趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶的减少介导，从而改善心脏功能和减少心脏重塑。
展望
我们相信，我们的数据首次证明了Ac-SDKP，一种天然存在的四肽，在自身免疫介导的心脏病中发挥保护作用。抗肽酶的Ac-SDKP或类似物可用于治疗自身免疫起致病作用的疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化症、器官排斥、1型糖尿病、动脉粥样硬化和高血压靶器官损害。此外，因为ACE抑制剂可以预防自身免疫性疾病(11,36)包括EAM(11)ACE抑制剂显著增加血浆和尿液中Ac-SDKP的观察结果支持了ACE对Ac-SDKP的特异性降解(1,2)我们认为Ac-SDKP增加可能解释ACE抑制剂的一些有益作用。
赠款
这项工作得到了国家心脏、肺和血液研究所拨款HL-028982和HL-088036给O.A.Carretero和HL-071806给N.-E.Rhaleb的支持。
披露
提交人未声明任何利益冲突，无论是财务还是其他方面。
作者贡献
作者贡献：P.N.、Y.-H.L.、T.-D.L.，G.E.G.和O.A.C.研究的概念和设计；P.N.、Y.-H.L、T.-D.L、X.C.和D.S.进行了实验；P.N.、Y.-H.L.、T.-D.L.、E.L.P.和O.A.C.分析数据；P.N.、Y.-H.L.、K.R.B.、X.-P.Y.、N.-E.R.和O.A.C.解释实验结果；P.N.和Y.-H.L.编制的数字；P.N.起草的手稿；P.N.、Y.-H.L.、K.R.B.、D.S.、R.K.、X.-P.Y.、N.-E.R.和O.A.C.编辑和修订的手稿；P.N.、Y.-H.L.、T.-D.L.，X.C.、G.E.G.、K.R.B.、D.S.、E.L.P.、R.K.、X.-P.Y.、N.-E.R.和O.A.C.批准的手稿最终版本。
致谢
我们要感谢Gulser Gurocak的专业技术，以及Elizabeth Furest和Tasnim Hoda的出色编辑协助。
参考文献
1Azizi M、Ezan E、Nicolet L、Grognet JM、Ménard J。血浆高水平N-乙酰基-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸：慢性血管紧张素转换酶抑制的新标志物.高血压
30: 1015–1019, 1997 [公共医学][谷歌学者] 2阿齐兹·M、卢梭·A、埃赞·E、古伊内·TT、米歇莱特·S、小天鹅·JM、伦芬特·M、科沃尔·P、梅纳德·J。急性血管紧张素转换酶抑制增加血浆中天然干细胞调节剂N-乙酰基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸的水平.JCI公司
97: 839–844, 1996[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。巴赫迈尔·K、普默尔·C、科齐拉兹基一世、菲弗·K、马克·TW、诺伊·N、彭宁格·JM。低分子肿瘤坏死因子受体p55控制自身免疫性心脏病的诱导.循环
95: 655–661, 1997 [公共医学][谷歌学者] 4Bahk TJ、Daniels MD、Leon JS、Wang K、Engman DM。血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻滞剂预防实验性自身免疫性心肌炎的比较.国际心脏病学杂志
125: 85–93, 2008[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Baldevano GC、Barin JG、Talor MV、Srinivasan S、Bedja D、Zheng D、Gabrielson K、Iwakura Y、Rose NR、Cihakova D。白细胞介素-17A对心肌炎是不必要的，但对扩张型心肌病的进展至关重要.循环研究
106: 1646–1655, 2010 [公共医学][谷歌学者] 6Blyszczuk P、Kania G、Dieterle T、Marty RR、Valaperti A、Berthonneche C、Pedrazini T、Berger CT、Dirnhofer S、Matter CM、Penninger JM、Lüscher TF、Eriksson U。髓样分化因子-88/白细胞介素-1信号传导控制炎性扩张型心肌病的心肌纤维化和心力衰竭进展.循环研究
105: 912–920, 2009 [公共医学][谷歌学者] 7Cavasin MA、Rhaleb NE、Yang XP、Carretero OA。脯氨酸寡肽酶参与抗纤维化肽Ac-SDKP的释放.高血压
43: 1140–1145, 2004[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8俄亥俄州辛戈拉尼、杨XP、刘YH、维拉纽瓦M、拉勒布NE、卡雷特罗OA。减少心脏纤维化可降低高血压大鼠的收缩功能，但不影响舒张功能.高血压
43: 1067–1073, 2004[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Damoiseaux JG、Döpp EA、Calame W、Chao D、MacPherson GG、Dijkstra CD。单克隆抗体ED1识别大鼠巨噬细胞溶酶体膜抗原.免疫学
83: 140–147, 1994[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Dufour JH、Dziejman M、Liu MT、Leung JH、Lane TE、Luster AD。IFN-gamma-inducible protein 10（IP-10；CXCL10）缺陷小鼠揭示了IP-10在效应T细胞生成和贩运中的作用.免疫学杂志
168: 3195–3204, 2002 [公共医学][谷歌学者] 11Godsel LM、Leon JS、Wang K、Fornek JL、Molteni A、Engman DM。卡托普利预防实验性自身免疫性心肌炎.免疫学杂志
171: 346–352, 2003 [公共医学][谷歌学者] 12Goser S、Ottl R、Brodner A、Dengler TJ、Torzewski J、Egashira K、Rose NR、Katus HA、Kaya Z。单核细胞趋化蛋白-1和巨噬细胞炎症蛋白-1α在诱导实验性自身免疫性心肌炎和有效抗单核细胞嗜化蛋白-1基因治疗中的关键作用.循环
112: 3400–3407, 2005 [公共医学][谷歌学者] 13韩磊，李TL，张义杰，杨天顺，丁毅，郭士林。实验性自身免疫性心肌炎Th1、Th2和Th17亚群的免疫状态.四川大学医学报
42: 751–756, 2011 [公共医学][谷歌学者] 14Handa O、Naito Y、Takagi T、Shimozawa M、Kokura S、Yoshida N、Matsui H、Cepinskas G、Kvietys PR、Yoschikawa T。大鼠胃上皮细胞产生肿瘤坏死因子-α诱导的细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子-1（CINC-1）：活性氧物种和核因子-κB的作用.药理学实验与治疗杂志
309: 670–676, 2004 [公共医学][谷歌学者] 15Heymans S、Pauschinger M、DePalma A、Kallwellis-Opara A、Rutschow S、Swinnen M、Vanhoutte D、Gao F、Torpai R、Baker AH、Padalko E、Neyts J、Schultheiss HP、Van de Werf F、Carmeliet P、Pinto YM。抑制尿激酶型纤溶酶原激活物或基质金属蛋白酶可预防病毒性心肌炎期间的心脏损伤和功能障碍.循环
114: 565–573, 2006 [公共医学][谷歌学者] 16Hishikari K、Watanabe R、Ogawa M、Suzuki J、Masumura M、Shimizu T、Takayama K、Hirata Y、Nagai R、Isobe M。克拉霉素早期治疗通过抑制基质金属蛋白酶活性减轻大鼠自身免疫性心肌炎.心脏
96: 523–527, 2010 [公共医学][谷歌学者] 17Kitabayashi H、Isobe M、Watanabe N、Suzuki J、Yazaki Y、Sekiguchi M。FTY720通过减少循环淋巴细胞防止实验性自身免疫性心肌炎的发生.心血管药理学杂志
35: 410–416, 2000 [公共医学][谷歌学者] 18Kodama M、Hanawa H、Saeki M、Hosono H、Inomata T、Suzuki K、Shibata A。自身免疫性巨细胞心肌炎后大鼠扩张型心肌病.循环研究
75: 278–284, 1994 [公共医学][谷歌学者] 19Kodama M、Matsumoto Y、Fujiwara M。实验性自身免疫性心肌炎过继转移证明体内淋巴细胞介导的心肌损伤.循环
85: 1918–1926, 1992 [公共医学][谷歌学者] 20Kodama M、Zhang S、Hanawa H、Shibata A。实验性自身免疫性巨细胞性心肌炎大鼠心脏浸润性单核细胞的免疫组织化学特征.临床实验免疫学
90：1992年330–335[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Lane JR、Neumann DA、Lafond-Walker A、Herskowitz A、Rose NR。IL-1和肿瘤坏死因子在柯萨奇病毒诱导的自身免疫性心肌炎中的作用.免疫学杂志
151: 1682–1690, 1993 [公共医学][谷歌学者] 22Lenfant M、Wdzieczak-Bakala J、Guittte E、Prome JC、Sotty D、Frindel E。造血多能干细胞增殖抑制剂的纯化及其结构测定.《美国科学院院刊》
86: 779–782, 1989[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Liu W，Li WM，Gao C，Sun NL。阿托伐他汀对Lewis大鼠实验性自身免疫性心肌炎Th1/Th2极化的影响.J自身免疫
25: 258–263, 2005 [公共医学][谷歌学者] 24Liu YH、D'Ambrosio M、Liao TD、Peng H、Rhaleb NE、Sharma U、AndréS、Gabius HJ、Carretero OA。N-乙酰基-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸预防由半乳糖凝集素-3（一种哺乳动物黏附/生长调节凝集素）诱导的心脏重塑和功能障碍.美国生理学杂志心脏循环生理学
296：H404–H4122009年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Luster AD、Greenberg SM、Leder P。IP-10趋化因子与血小板因子4共享的特定细胞表面硫酸乙酰肝素位点结合，并抑制内皮细胞增殖.实验医学杂志
182: 219–231, 1995[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26马里诺美联社、密歇根州阿泽韦多、拉内斯·维埃拉J。黏附分子差异表达与自身免疫性和克氏锥虫合法性心肌炎早期T细胞亚群患病率的关系.奥斯瓦尔多·克鲁兹博物馆
98: 945–952, 2003 [公共医学][谷歌学者] 27Peng H、Carretro OA、Brigstock DR、Oja-Tebbe N、Rhaleb NE。Ac-SDKP逆转肾血管性高血压大鼠心肌纤维化.高血压
42: 1164–1170, 2003[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Peng H、Carretero OA、Liao TD、Peterson EL、Rhaleb NE。N-乙酰-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸在血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利抗高血压纤维化和抗炎作用中的作用.高血压
49: 695–703, 2007[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Peng H、Carretro OA、Raij L、Yang F、Kapke A、Rhaleb NE。抗纤维化作用N个-乙酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸对醛固酮盐性高血压大鼠心脏和肾脏的影响.高血压
37: 794–800, 2001[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Peng H、Carretro OA、Vuljaj N、Liao TD、Motivala A、Peterson EL、Rhaleb NE。血管紧张素转换酶抑制剂：一种新的作用机制.循环
112: 2436–2445, 2005[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Pokharel S、van Geel PP、Sharma UC、Cleutjens JPM、Bohnemier H、Tian XL、Schunkert H、Crijns HJGM、Paul M、Pinto YM。转基因大鼠心肌胶原含量增加，心肌血管紧张素转换酶过度表达与心肌细胞的分解增强有关N个-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和Smad2/3磷酸化增加.循环
110: 3129–3135, 2004 [公共医学][谷歌学者] 32Prunier F、Gaertner R、Louedec L、Michel JB、Mercadier JJ、Escoubet B。多普勒超声心动图估测大鼠心肌梗死后左室舒张末压.美国生理学杂志心脏循环生理学
283：H346–H3522002年[公共医学][谷歌学者] 33Pummer CL、Grassl G、Sailer M、Bachmaier KW、Penninger JM、Neu N。心肌肌球蛋白诱导的心肌炎：自身反应性T细胞的目标识别需要先激活心肌间质细胞.实验室投资
74: 845–852, 1996 [公共医学][谷歌学者] 34Rhaleb NE、Peng H、Yang XP、Liu YH、Mehta D、Ezan E、Carretro OA。N-乙酰-芳基-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸对2肾1夹高血压大鼠左心室胶原沉积的长期影响.循环
103：3136–31412001[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Sharma U、Rhaleb NE、Pokharel S、Harding P、Rasoul S、Peng H、Carretro OA。N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro在高血压靶器官损伤中的新抗炎机制.美国生理学杂志心脏循环生理学
294：2008年H1226–H1232[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Shimazu H、Kinoshita K、Hino S、Yano T、Kishimoto K、Nagare Y、Nozaki Y、Sugiyama M、Ikoma S、Funauchi M。ACE抑制剂和他汀类药物联合应用对狼疮易发小鼠的影响.临床免疫学
136: 188–196, 2010 [公共医学][谷歌学者] 37Smith SC、Allen PM。肌球蛋白诱导的急性心肌炎是一种T细胞介导的疾病.免疫学杂志
147: 2141–2147, 1991 [公共医学][谷歌学者] 38Smith SC、Allen PM。中和内源性肿瘤坏死因子改善肌球蛋白诱导的心肌炎的严重程度.循环研究
70: 856–863, 1992 [公共医学][谷歌学者] 39Spinale前景。心肌基质重塑和基质金属蛋白酶对心脏形态和功能的影响.生理学评论
87: 1285–1342, 2007 [公共医学][谷歌学者] 40汗液F、普希特勒H、罗森塔尔SI。天狼星红F3BA作为结缔组织染色剂.Arch Pathol公司
78: 69–72, 1964 [公共医学][谷歌学者] 41Volkov L、Quere P、Coudert F、Comte L、Praloran V。四肽AcSDKP是正常细胞增殖的生理抑制剂，可减少连续细胞系的S期进入.Exp单元Res
223: 112–116, 1996 [公共医学][谷歌学者] 42王QQ，王玉玲，袁HT，刘福清，金YP，韩B。抗CD4单克隆抗体诱导自身免疫性心肌炎大鼠对心肌肌球蛋白的免疫耐受.临床免疫学杂志
26: 213–221, 2006 [公共医学][谷歌学者] 43Wang Y、Afanasyeva M、Hill SL、Rose NR。自体和外源性心肌肌球蛋白诱导的小鼠自身免疫性心肌炎的特征.自身免疫性
31: 151–162, 1999 [公共医学][谷歌学者] 44Yang F、Yang XP、Liu YH、Xu J、Cingolani O、Rhaleb NE、Carretero OA。Ac-SDKP逆转心肌梗死后心力衰竭大鼠炎症和纤维化.高血压
43: 229–236, 2004[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Zibadi S、Vazquez R、Moore D、Larson DF、Watson RR。饮食诱导代谢综合征小鼠模型心肌赖氨酸氧化酶对心脏重构的调节.美国生理学杂志心脏循环生理学
297：H976–H9822009年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
