mTOR复合物1(mTORC1)激酶是生长的主要调节因子,其失调在包括癌症和糖尿病在内的人类疾病中很常见(1). 为了响应各种环境输入,包括氨基酸水平,mTORC1调节许多合成代谢和分解代谢过程,如蛋白质合成和自噬(1,2). mTORC1对氨基酸的感应始于溶酶体腔内(三)并且需要与包含Rag GTPases的溶酶体膜相关的信号机(4,5),Ragulator复合体(6,7)和液泡ATP酶(v-ATP酶)(三). Rag GTPases作为RagA或RagB的专性异二聚体存在,与RagC或RagD高度同源,两者也非常相似(4,5,8). 通过一种需要v-ATP酶的机制,管腔氨基酸激活Raulator对RagaA/B的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)活性,当GTP负载时,将mTORC1募集到溶酶体表面(7). 在那里,mTORC1与其激活物Rheb相互作用,Rheb受许多上游信号调节,包括生长因子(1). 氨基酸提取后,RagA/B与GDP结合(4)通过未知机制和mTORC1离开溶酶体表面,导致其抑制。
我们怀疑,Rags的重要调节器可能已经逃脱了事先的鉴定,因为它们与Rags之间的相互作用太弱,无法在标准净化条件下持续存在。因此,为了保存不稳定的蛋白质复合物(9),我们用化学交联剂处理表达FLAG-tagged RagB的人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,并通过与FLAG-RagB共同免疫沉淀的质谱蛋白质进行鉴定。该分析揭示了已知的Rag相互作用蛋白以及Mios(一种以前没有研究过的100kDa WD40重复蛋白)在免疫沉淀物中的存在(图S1A). 与这一发现一致,内源性RagA和RagC与HEK-293T细胞中表达的重组Mios共同免疫沉淀,并在类似纯化条件下分离(). 通过RNA干扰(RNAi)抑制人类细胞中的Mios,强烈抑制氨基酸诱导的mTORC1激活,如底物S6K1的磷酸化状态所检测到的(,S2B型). 此外,在果蝇S2细胞,靶向Mio的dsRNA(10),Mios的苍蝇直系基因,消融了dTORC1信号,也减小了细胞大小(). 因此,在人类和苍蝇细胞中,Mios是向TORC1发送氨基酸信号所必需的。
GATOR是一种Rag相互作用复合物,其Mios成分是氨基酸激活mTORC1所必需的。(A类)Mios与内源性RagA和RagC相互作用。将所示cDNA转染到HEK-293T细胞的表达载体中。用细胞渗透性化学交联剂处理细胞,制备裂解物并进行标记免疫沉淀(IP),然后对指示的蛋白质进行免疫印迹。(B类)Mios是氨基酸激活mTORC1途径所必需的。将表达靶向GFP或Mios的shRNAs的HEK-293T细胞饥饿50分钟或饥饿,然后用氨基酸重新刺激10分钟。分析细胞裂解物中S6K1的磷酸化状态。(C类)用靶向Mio或GFP的dsRNAs处理S2细胞后,氨基酸饥饿90分钟或饥饿并用氨基酸重新刺激30分钟。通过免疫印迹法检测所示蛋白。(D类)dsRNA介导的Mio耗竭后S2细胞的细胞大小直方图(E类)–(F类)GATOR是由两个不同的亚复合物定义的八元复合物,与Rag GTPases相互作用。HEK-293T细胞被转染并按(A类)在排除交联试剂的情况下,对细胞裂解物和FLAG免疫沉淀物进行免疫印迹。(G公司)裂解稳定表达FLAG标记的DEPDC5或WDR24的HEK-293T细胞,通过免疫印迹分析内源性RagA、RagC、Mios和Nprl3的细胞裂解物和FLAG免疫沉淀物。(H(H))GATOR Rag相互作用总结示意图。GATOR2(Mios、Seh1L、WDR24、WDR59和Sec13)与GATOR1(DEPDC5、Nprl2和Nprl3)相互作用,然后可能会绑定Rags。
在体外,我们未能检测到纯化的Mios和Rag异二聚体之间的强烈相互作用,这表明细胞内存在复杂形成所需的其他成分。事实上,在从HEK-293T细胞制备的FLAG-Mios免疫沉淀物中,我们通过质谱检测到7个额外的蛋白质(WDR24、WDR59、Seh1L、Sec13、DEPDC5、Nprl2和Nprl3)。然而,蛋白质的丰度不同,WDR24、WDR59、Seh1L和Sec13与Mios共同免疫沉淀的数量远大于DEPDC5、Nprl2和Nprl3(图S1B). 相反,在FLAG-DEPDC5免疫沉淀物中,Nprl2和Nprl3比Mios、WDR24、WDR59、Seh1L和Sec13更丰富,而FLAG-Nprl的实验也给出了类似的结果(图S1B). 这些发现表明存在两个子复合物,一个由Mios、WDR24、WDR59、Seh1L和Sec13组成,另一个由DEPDC5、Nprl2和Nprl3组成。为了验证这一观点,我们将FLAG-WDR24或FLAG-Nprl2与其他七种蛋白的HA标记版本联合表达。正如预期的那样,DEPDC5和Nprl3与Nprl2共同免疫沉淀的强度远大于与WDR24的协同免疫沉淀,而Mios、WDR59、Seh1L和Sec13则相反(). 由于后面描述的原因,我们将8蛋白复合物称为GATORG公司应用程序A类活动T型欧沃兹R(右)ags和两个子复合体GATOR1(DEPDC5、Nprl2和Nprl3)和GATOR2(Mios、WDR24、WDR59、Seh1L和Sec13)().
当八种蛋白与RagB和RagC共同表达时,GATOR与Rag异二聚体强烈相互作用()就像Rags和Ragulator(6,7),其DEPDC5成分定位于溶酶体表面(图S1E). 省略单个GATOR蛋白的实验揭示了成分之间的复杂关系,但表明GATOR1介导GATOR-Rag相互作用(图S1C). 与此结论一致,免疫印迹法检测到,当FLAG-DEPDC5在HEK-293T细胞中稳定表达时,其共同免疫沉淀的内源性RagA和RagC比FLAG-WDR24多得多()和质谱分析(图S1D). 氨基酸饥饿增加了与DEPDC5共同免疫沉淀的RagA和RagC的数量,表明GATOR1具有调节作用(图S1F).
GATOR组分与Rag GTPase相互作用的发现很有趣,因为它们可能的芽变酵母同源基因(IML1,NPR2,NPR3)正调控自噬体的形成,这是一个TORC1依赖的过程(11),并且,至少在某些酵母菌株中,在氮饥饿时也抑制TORC1信号(12–14). 最近,GATOR2(Sea2、Sea3、Sea4、Seh1L和Sec13)的可能酵母同源基因被证明与IML1、NPR2和NPR3相互作用,形成一种称为SEA的复合物(15). 然而,与GATOR不同,SEA复合体似乎不包含两个不同的亚复合体,因为其成分以化学计量的数量存在。
我们在HEK-293T和果蝇S2细胞分别通过mTORC1和dTORC1检测氨基酸传感中每个GATOR成分的功能。我们将Sec13排除在进一步分析之外,因为它在几个蛋白质复合物中起作用(16)因此,它的抑制作用可能会产生难以解释的效果。与氨基酸激活mTORC1所需的Mios一致()、其他GATOR2成分或其果蝇直系物分别强烈钝化氨基酸诱导的mTORC1和dTORC1活化(;S2、A、B、C和D). 相反,GATOR1蛋白的缺失具有相反的效果,并阻止了mTORC1和dTORC1的失活,这通常是由氨基酸剥夺引起的(;S2、A和D). 与GATOR1和GATOR2在dTORC1信号传导中的相反作用一致,靶向dSeh1L或dDEPDC5的dsRNA分别降低和增加S2细胞大小(). 为了阐明GATOR1和GATOR2之间的关系,我们在S2细胞中使用RNAi与Mio或dSeh1L同时抑制dDEPDC5。有趣的是,在GATOR1抑制的背景下,GATOR2的缺失对dTORC1活性没有影响,表明GATOR2在GATOR2上游发挥作用(). 因此,GATOR2是TORC1途径氨基酸敏感分支抑制剂(GATOR1)的抑制剂。
GATOR复合物是氨基酸调节TORC1途径所必需的。(A类)shRNA介导的HEK-293T细胞中GATOR2组分Seh1L、WDR24或WDR59的缺失抑制氨基酸诱导的S6K1磷酸化。(B类)在表达靶向GATOR1组分DEPDC5、Nprl2和Nprl3的shRNAs的HEK-293Ts中,S6K1磷酸化对氨基酸提取不敏感。在(A类)和(B类)细胞饥饿氨基酸50分钟或饥饿并用氨基酸重新刺激10分钟。细胞裂解物进行免疫印迹以检测S6K1的磷酸化状态。dsRNA介导的S2细胞中(C类)dSeh1L;(D类)dWDR59和dWDR24;和(E类)dDEPDC5、dNprl2和dNprl 3。用指示的dsRNAs处理S2细胞,使其缺乏氨基酸90分钟或饥饿并用氨基酸重新刺激30分钟。免疫印迹法用于检测dS6K的磷酸化状态。(F类)dsRNA介导的dSeh1L和dDEPDC5缺失后S2细胞大小。(G公司)GATOR2在GATOR1上游运行。S2细胞用指定的dsRNA组合处理,并用氨基酸饥饿和再刺激,并如(C类)–(E类). (H(H))描述GATOR1和GATOR2在调节mTORC1中的关系的示意图。
氨基酸诱导mTORC1活化的一个关键步骤是其向溶酶体表面的募集,这一事件需要已知的氨基酸传感途径阳性成分,如Ragulator(7)和v-ATP酶(三). 与GATOR2的积极作用一致,在HEK-293T细胞中表达靶向Mios的shRNAs()或Seh1L()在氨基酸刺激下,mTOR没有转移到LAMP2阳性溶酶体膜(). 相反,在表达靶向DEPDC5的shRNA的细胞中(图S2A),mTOR组成性地定位于溶酶体表面,与氨基酸的可用性无关(). 此外,DEPDC5的过度表达足以阻止氨基酸诱导的mTOR向溶酶体表面的移位(). 不同于Ragulator,它将Rags固定在溶酶体表面(6–7),正确的Rag定位不需要GATOR2(图S3A). 因此,GATOR1和GATOR2对mTORC1的活性和亚细胞定位有相反的影响。
GATOR调节mTORC1在溶酶体表面的定位,并在Rag GTPases上游发挥作用。(A类)RNAi介导的GATOR2组分Mios和Seh1L的缺失可防止氨基酸诱导的mTOR溶酶体易位。表达所示shRNAs的HEK-293T细胞在mTOR(红色)和Lamp2(绿色)联合免疫染色前被饥饿或饥饿,并用氨基酸重新刺激指定时间。(B类)DEPDC5在HEK-293T细胞中的表达减少导致组成性mTOR定位到溶酶体表面。用所示慢病毒shRNAs处理的HEK-293T细胞按照(A类). (C类)稳定表达FLAG-DEPDC5的HEK-293T细胞饥饿或饥饿并用氨基酸重新刺激的图像。细胞按中所述进行处理(A类). 在所有图像中,插图显示放大五倍的选定字段及其覆盖。比例尺等于10μM。(D类)GATOR1在Rags的核苷酸结合状态的上游起作用。转染表达载体中所示cDNA的HEK-293T细胞饥饿氨基酸50分钟或饥饿并用氨基酸重新刺激10分钟。免疫印迹法检测所示蛋白。
与GATOR1是mTORC1通路的抑制剂相一致,其三个成分的伴随过度表达阻断了氨基酸诱导的mTORC2激活()与RagB相似T54N型-RagC公司q120升,一种Rag异二聚体,由于RagBT54N型突变体不能结合GTP(7). 相反,显性活性RagB的表达Q99升-RagC公司第75页异二聚体不仅阻止了氨基酸剥夺,而且也阻止了GATOR1过度表达,从而抑制了mTORC1信号传导。因为RagBQ99升构成对GTP的约束(17)和RagCS75N系列无法绑定GTP(7)这一结果表明,GATOR1在Rags核苷酸结合状态调控的上游发挥作用。
为了测试GATOR1是Rags的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)或GTPase激活蛋白(GAP)的可能性,我们制备了由野生型Rag和Rag组成的Rag异二聚体X(X)突变体(参见方法)(7). 抹布X(X)突变体对黄嘌呤核苷酸而不是鸟嘌呤核酸具有选择性,允许我们在体外制备异二聚体,其中野生型Rag装载放射性标记的GTP或GDP,而Rag则装载X(X)合作伙伴绑定到XDP或XTP(7). 体外,纯化GATOR1(图S4E)当GDP与RagB或RagC绑定在适当的Rag上时,不会刺激GDP与Rag B或Rag C的分离X(X)合伙人(图S4、A和B),排除了其作为全球环境基金的职能。相反,GATOR1以时间和剂量依赖性的方式强烈增加了RagC中RagA或RagB对GTP的水解X(X)-含有异二聚体,与哪种核苷酸RagC无关X(X)加载了(;S4、C和D). GATOR1还略微促进了RagB中RagC的GTP水解X(X)-RagC异二聚体(),但对Rap2a的GTPase活性没有影响(). LRS,RagD的假定间隙(18),未改变RagA、RagB或RagC对基础GTP的水解(). 与许多GAP对靶GTP的GTP负载状态的结合偏好一致,体外GATOR1优先与RagB相互作用Q99升-含异二聚体(). 因此,GATOR1复合物对RagA/B具有GAP活性,为其在mTORC1信号传导中的抑制作用提供了机制。
GATOR1是RagA和RagB的GTPase激活蛋白复合物。(A类)——(D类)GATOR1通过RagA和RagB刺激GTP水解。RagA-RagC型X(X),RagB-RagCX(X),RagC-RagBX(X)或对照组GTPase Rap2a被加载[α-32P] GTP并与GATOR1(20 pmol)或对照Leucyl tRNA合成酶(LRS)(20 pmols)孵育。GTP水解通过薄层色谱法测定(见方法)。每个值代表标准化平均值±SD(n个= 3). (E类)GATOR1以时间依赖的方式增加RagB对GTP的水解。RagB-RagC型X(X)加载了[γ-32P] GTP,与GATOR1或对照培养,通过磷酸盐捕获测定水解(见方法)。每个值代表标准化平均值±SD(n个= 3). (F类)GATOR1优先与显性活性Rag异二聚体相互作用。FLAG-GATOR1与固定化HA-GST标记的RagB孵育的体外结合试验T54N型-RagC公司Q120升(主导负向),RagBQ99升-RagC公司第75页(主导有源)或Rap2a。用免疫印迹法分析HA-GST沉淀物中FLAG-GATOR1的水平。
因为向mTORC1传递上游信号的途径经常被癌症突变所解除(在(19)),我们认为GATOR1组分可能在人类肿瘤中发生突变。事实上,之前的研究发现肺癌和乳腺癌中3p21.3的630 kb区域缺失,其中包括NPRL2号机组(20,21)一项研究报告了两例胶质母细胞瘤22q12.2的三基因区缺失,其中包含DEPDC5部门(22). 此外,在3p21.3缺失的癌细胞中,Nprl2的表达抑制了其作为肿瘤异种移植物生长的能力,从而确定其为肿瘤抑制因子(21,23). 我们对癌症基因组图谱(TCGA)公开可用数据的分析发现,胶质母细胞瘤和卵巢癌的一个子集在DEPDC5部门或NPRL2。在大多数这些肿瘤中,DEPDC5部门或NPRL2号机组也经历了LOH事件,表明肿瘤不太可能保留基因产物的功能拷贝(;第5页). 此外,在这两种肿瘤类型中,也检测到局部纯合子或半合子缺失,以及伴随LOH的错义突变DEPDC5部门和NPRL2号机组().NPRL3号机组位于16p端粒附近,无法通过高密度微阵列分析充分了解端粒中的拷贝数变化。总之,在胶质母细胞瘤和卵巢癌中,GATOR1组分的失活突变出现在低个位数的百分比中,频率可能会随着更好的评估NPRL3号机组.
癌症中GATOR1组分发生突变,GATOR1-阴性癌细胞对mTORC1抑制剂雷帕霉素过敏。(A类)表总结了DEPDC5部门和NPRL2号机组以及它们在胶质母细胞瘤和卵巢癌中的频率。无义和移码突变与错义突变的比率DEPDC5部门(p值=0.00015)和NPRL2号机组(p值=0.00342)与fisher精确检验确定的胶质母细胞瘤基因组中所有无义和移码突变与错义突变的比率存在显著差异。(B类)–(C类)发现的突变和缺失DEPDC5型胶质母细胞瘤和卵巢癌。(D类)在GATOR1-缺失的癌细胞中,mTORC1通路对氨基酸饥饿具有抵抗力。细胞饥饿氨基酸50分钟,饥饿并用氨基酸重新刺激10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物中指示蛋白质的水平。(E类)在对mTOR(红色)和Lamp2(绿色)进行联合免疫染色之前,对癌细胞进行饥饿或饥饿处理,并用氨基酸重新刺激特定时间。在所有图像中,插图显示放大五倍的选定字段及其覆盖。比例尺等于10μM。(F类)Nprl2再导入SW780细胞系(NPRL2号机组−/−)恢复mTORC1的氨基酸依赖性调节。对稳定表达对照蛋白或Nprl2的细胞进行处理和分析,如(D类). (G公司)GATOR1-空癌细胞是指指定癌细胞系的值。对雷帕霉素过敏。雷帕霉素IC50数值表示为平均值±SD(n个= 3). (H(H))GATOR复合物在mTORC1途径氨基酸感应分支中的作用模型。GATOR2是GATOR1的负调控因子,通过充当RagA的GAP抑制mTORC1通路。
为了研究GATOR1缺失对癌细胞的影响,我们使用Cosmic和CCLE资源(见方法)来鉴定在DEPDC5部门,NPRL2号机组,或NPRL3号机组我们通过免疫印迹或基因组DNA PCR证实(图S5、B、C和F). 在7个这样的细胞系中,但在Jurkat或HeLa细胞中没有,mTORC1信号过度活跃,对氨基酸剥夺和V-ATP酶抑制完全不敏感,无论缺少哪种GATOR1成分(;S5、D、E和I). 此外,在GATOR1阴性细胞中,即使没有氨基酸,mTOR也定位于溶酶体表面(). 当DEPDC5和Nprl2被重新导入缺乏它们的癌细胞系时,mTORC1通路恢复了对氨基酸调节的敏感性(;S5、G和H)这表明确实是GATOR1蛋白的缺失导致了这些细胞中mTORC1信号的异常。
GATOR1阴性癌细胞的增殖对mTORC1抑制剂雷帕霉素非常敏感,IC50秒在0.1–0.4 nM范围内(). 这些数值比不被认为对雷帕霉素敏感的细胞系(如HeLa和HT29细胞)和低端癌细胞系(例如PC3和Jurkat细胞)的数值小很多数量级PTEN公司函数(24–26),mTORC1通路的一个已建立的负调控因子。此外,DEPDC5在MRKNU1中的强制表达−/−)细胞系导致其增殖显著减少(图S5J).
总之,我们确定了八聚体GATOR复合物是向mTORC1发出氨基酸充足信号的途径的关键调节器(). GATOR1亚复合体对RagA和RagB具有GAP活性,其缺失使mTORC1信号对氨基酸剥夺不敏感。GATOR1的失活突变存在于癌症中,可能有助于识别可能对临床批准的mTORC1药物抑制剂有反应的肿瘤。