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.2011年11月；22(21):4124-33.
doi:10.1091/mbc。E11-06-0525。 Epub 2011年9月7日。

在无氮饥饿的情况下，Iml1-Npr2-Npr3复合物对自噬的选择性调节

西武 1, 本杰明·P·图
附属公司

在无氮饥饿的情况下，Iml1-Npr2-Npr3复合物对自噬的选择性调节

西武等。 分子生物学细胞. 2011年11月.

摘要

自噬是细胞内物质降解的进化保守途径。自噬是如何调节的，尤其是在代谢和营养状态发生变化时，目前尚不清楚。通过使用酿酒酵母的原营养菌株，我们意外地观察到，在完全没有氮饥饿的情况下，仅仅从富培养基切换到最低培养基，就会强烈诱导自噬。这种新形式的自噬被称为“非氮捕获（NNS）诱导自噬”。一个视觉屏幕揭示了三种自噬调节因子——Iml1p、Npr2p和Npr3p，它们在同一复合物中发挥作用，是NNS诱导自吞噬的选择性所需。在NNS诱导的自噬过程中，Iml1p定位于前自噬体结构（PAS）或非PAS点状结构。这种定位表明Iml1p或Iml1p-Npr2p-Npr3p复合物可能调节自噬体的形成。超微结构分析证实，在NNS诱导的自噬过程中，Δiml1、Δnpr2和Δnpr 3细胞的自噬体形成受到强烈破坏。此外，Iml1p包含一个保守的结构域，这是NNS诱导的自噬和复合物形成所必需的。总的来说，我们的发现揭示了在以前未被认识的条件下调节自噬的其他机制的存在，以应对代谢和营养状态相对更微妙的变化。

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图1：
图1：
从富含营养的培养基转换到最低限度的非饥饿培养基时的自噬诱导。在切换到保氮培养基（SD-N或SL-N）之前，细胞在富培养基（YPL）中生长至对数期。对照组为非保存培养基（SD和SL）。在指定的时间点，通过ALP活性测定或以Idh1-GFP作为有丝分裂报告物的Western blot检测一般自噬或有丝分裂。印尼盾1编码线粒体基质蛋白。（A） 正如预期的那样，在饥饿培养基（SD-N和SL-N）中诱导了自噬，但在对照培养基（SD）中没有诱导自噬。令人惊讶的是，当切换到SL培养基时，自噬也被显著诱导。（B） 在Δ第5天细胞，在Δ中不受影响第11天细胞。（C） 在Δ第5天和Δ第11天细胞。（D） 自噬诱导条件触发的Atg13p去磷酸化。如先前报道的那样，雷帕霉素处理和氮饥饿导致Atg13p的去磷酸化（Kamada等人，2000）。在切换到SL培养基后，Atg13p也被去磷酸化。细胞在YPL中生长到对数期，然后切换到含有雷帕霉素（0.2μg/ml）的YPL培养基、保氮培养基（SD-N）或SL培养基。在指定的时间点，将5个OD细胞与TCA混合至最终浓度5-6%，并在离心前在冰上培养至少5分钟。然后对细胞颗粒进行全细胞TCA提取并通过免疫印迹分析。说唱。，雷帕霉素。（E和F）时间进程实验表明，自噬活性在2-4小时后可检测到，在6-8小时左右达到峰值，在切换到SL培养基后17-24小时后开始下降。在（A–C和E）中，数据表示三到五个样本的平均值，带有标准偏差的误差线。
图2：
图2：
NNS诱导的自噬对细胞从YPL培养基转换为SL培养基后的生长至关重要。（A） WT和自动变速箱YPL培养基中的突变细胞以及切换到SL培养基后的突变细胞。对于YPL中的生长测量，将指定基因型的细胞培养在YPL中至对数期，然后稀释至OD6000.05–0.1. 外径600稀释后每1-3小时测量一次，并根据第一个时间点进行标准化。对于从YPL培养基切换到SL培养基后的生长测量，所示基因型的细胞在YPL至对数期（OD）生长6000.1–0.15），然后切换到SL介质。外径600每24h测量一次，并与第一个时间点进行标准化。（B） WT的增长曲线，Δatg5，和Δatg32细胞在YPL培养基中，然后切换到SL培养基。按照（A）所述进行生长测量。
图3：
图3：
视觉屏幕揭示了NNS诱导的自噬选择性需要的三个自噬调节器。细胞在YPL培养至对数期，然后切换至保氮培养基（SD-N）或非失活培养基（SL）。培养基切换后7至9小时，通过ALP活性测定测定一般自噬或有丝分裂。数据代表三到五个样本的平均值，带有标准偏差的误差条。（A和B）NNS诱导的一般自噬和有丝分裂在Δiml1，Δnpr2，和Δnpr3细胞。删除IML1公司,NPR2，或净现值3然而，对氮滞留诱导的自噬作用影响极小甚至没有影响。Δatg5和Δatg32突变体作为阳性对照。
图4：
图4：
Iml1p、Npr2p和Npr3p函数在一个复数中。细胞在YPL中生长到对数期，然后切换到SL培养基。在指定的时间点，收集80-150个指定双标记菌株的OD细胞，并进行FLAG或HA免疫沉淀。（A） Npr2-FLAG和HA-Npr3相互作用。在免疫印迹上观察到两种形式的Npr2p。Npr3p与两种形式的Npr2p相关联。删除IML1公司导致Npr2p慢迁移带丢失，但不影响Npr2p和Npr3p之间的相互作用。（B） Iml1p主要与磷酸化形式的Npr2p相互作用。收集生长于YPL至对数期的细胞，进行FLAG或HA免疫沉淀，然后进行磷酸酶处理。磷酸酶处理消除了Npr2p的缓慢迁移带，表明Npr2p是磷酸化蛋白。Iml1p主要下调Npr2p的磷酸化形式，在磷酸酶处理后，Npr2p折叠成信号带。（C）净现值3Npr2p磷酸化和Iml1p-Npr2p相互作用都需要。在没有Npr3p的情况下，去磷酸化的Npr2p无法降低Iml1p。（D） Iml1p还与Npr3p合作。Iml1p-Npr3p相互作用在缺乏净现值2在切换到SL培养基后，Iml1p-Npr2p-Npr3p相互作用的程度或Npr2p的磷酸化状态似乎没有显著变化。
图5：
图5：
在NNS诱导的自噬过程中，Iml1 GFP定位于PAS和非PAS点状结构。（A） 在切换到SL培养基时，Iml1-GFP在Vph1-mCherry标记的液泡附近形成点状结构。Vph1p是一种空泡滞留蛋白。显示了不同时间点的典型图像。比例尺，5μm。（B） 切换到SL介质时，Iml1-GFP定位到PAS（箭头）和非PAS点状焦点（箭头）。PAS的标志是Ape1-mRFP1（铃木等人，2007）。显示了不同时间点（YPL->SL 1.5–3 h）的典型图像。比例尺，5μm。（C） 切换到SL培养基后，在一小部分细胞中检测到Iml1-GFP点状结构。然而，从YPL培养基切换到保氮培养基（SD-N）并没有诱导Iml1-GFP点状结构的形成。（C–E）量化不同条件下具有Iml1-GFP点状结构的液泡百分比。每个时间点至少统计200个细胞。数据表示三个独立实验的平均值，带有标准偏差的误差条。（D） Iml1-GFP点状结构在Δnpr2和Δnpr3切换到SL培养基后的细胞。（E） Iml1-GFP点状结构的形成在Δatg8细胞在切换到SL培养基后的早期点。（F） 在切换到SL培养基后的早期时间点，Iml1-GFP的丰度没有变化，但在后期时间点略有增加。在指定的时间点，收集5个OD细胞进行全细胞TCA提取，然后通过免疫印迹分析。Pgk1p用作加载控制。（G） Iml1-GFP的表达在Δnpr2,Δnpr3，和Δatg8细胞。通过免疫印迹分析来自对照细胞或突变细胞的TCA沉淀的全细胞提取物。
图6：
图6：
IML1公司,NPR2、，和净现值3不调节Atg13p磷酸化。细胞在YPL中生长到对数期，然后切换到保氮培养基（SD-N）或SL培养基。在指定的时间点，收集并处理细胞，如图1D所示。
图7：
图7：
在NNS诱导的自噬过程中，Iml1p-Npr2p-Npr3p复合物调节自噬体的形成。培养基从YPL切换到SL后9小时，收集所示基因型的细胞并进行超微结构分析。显示了具有少于八个AB或具有八个或更多AB的细胞的代表性图像。分类为每组的细胞百分比在相应的图像中显示。每个基因型计数的细胞总数：271（WT），256(Δiml1), 337 (Δnpr2), 232 (Δnpr3), 134 (Δatg5). 五、 液泡。用于电镜分析的所有菌株都含有缺失Δpep4和Δprb1，包括WT（补充表S1）。
图8：
图8：
Iml1p包含进化上保守的结构域，对NNS诱导的自噬和Iml1p复合物的形成非常重要。（A） Iml1p域结构的示意图。（B和C）Iml1p及其同系物之间DUF域（B）和DEP域（C）的多序列比对。高度保守的残留物为黑色。嗯，小家鼠; 雷诺数，褐家鼠; Hs、，智人; Gg、，五倍子; Dm、，黑腹果蝇; Sp中，葡萄裂殖酵母; 理科，酿酒酵母（D和E）通过Western blot和ALP活性测定评估，Iml1p的DUF结构域是NNS诱导自噬所必需的。将全长IML1-FLAG、IML1Δdep-FLAG或IML1△duf-FLAG的编码序列克隆到一个着丝粒质粒中，该质粒由CYC1（日历年1）发起人。将表达Iml1-FLAG、Iml1Δdep-FLAG或Iml1△duf-FLAG的空载体或质粒转化为Δiml1细胞，以确定他们是否能够拯救NNS诱导的自噬。显示WT单元以进行比较。在（E）中，数据表示三到五个样本的平均值，带有标准偏差的误差条。（F） Iml1p的DUF（RANS）结构域是其与Npr2p和Npr3p相互作用所必需的。将表达Iml1-FLAG、Iml1Δdep-FLAG或Iml1△duf-FLAG的空载体或质粒转化为Δiml1单元格，然后用于下拉Npr2p或Npr3p。
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