引言
中心体是细胞中主要的微管组织中心，参与许多关键过程，如双极纺锤体的形成、形态发生和细胞运动(Bettencourt-Dias和Glover，2007年;古尔德和鲍里西，1977年;Mardin和Schiebel，2012年). 在细胞增殖过程中，精确连续的事件提供中心体复制和分离，每个细胞周期一次，以确保染色体均等分离；这种演替中的问题导致遗传不稳定和肿瘤发生(Basto等人，2008年;Ganem等人，2009年;Gonczy，2015年). 至关重要的是，后生动物中心体循环与核膜破裂（NEBD）相协调，在核膜破裂过程中，整个NE被溶解，以允许染色体进入其分离载体纺锤体(Guttinger等人，2009年). 在裂变酵母中，完整的NEBD被中心体（称为纺锤极体或SPB）下方的核膜（NE）的局部拆卸（开窗）所取代。这部分NEBD在NE中造成一个中断，在有丝分裂开始时复制的SPB下降；SPB插入后形成核内纺锤体(丁等人，1997年).
NEBD对于减数分裂中忠实的染色体分离也是必不可少的(Ppender等人，2015年)一种特殊的细胞周期，在该周期中，两轮核分裂跟随一轮DNA复制，产生单倍体配子并推动有性繁殖(Petronczki等人，2003年;亚诺维茨，2010). 我们以前证明，染色体和中心体之间的反-NE接触控制着裂变酵母减数分裂纺锤体的形成(富田和库珀，2007年). 这一观察源于对端粒花束功能的研究，端粒花簇是一种广泛保守的减数分裂前期特异性染色体排列，其中端粒聚集在SPB下方的NE处(Klutstein和Cooper，2014年;Scherthan，2001年). 端粒花束和SPB（在减数分裂前期NE的外表面）之间发生联系通过LINC复合物，包括KASH域外NE蛋白Kms1和SUN域内NE蛋白Sad1。减数分裂前期特异性Bqt1/2复合物，结合Sad1和组成性端粒结合的Taz1/Rap1复合物(Chikashige等人，2006年)，完成端粒-LINC连接。花束在减数分裂前期持续存在，在此期间SPB沿着细胞质微管来回拉动；这种振荡运动，再加上LINC介导的端粒和SPB之间的联系，形成了拉长的“马尾”核形状()(Ding等人，1998年). 马尾运动停止后，SPB复制并将母子SPB插入NE。这种插入为核γ-微管蛋白复合物（γ-TuC）的补充奠定了基础，该复合物使纺锤体形成成核(Funaya等人，2012年).
没有花束时SPB无法插入NE（A） 减数分裂染色体组织示意图。在心肌梗死前期（Pro），核在SPB的拉动下振荡，然后在心肌梗死开始前沉降。MI处的同源分离和MII处的姊妹分离导致单倍体孢子。右：在有丝分裂间期，着丝粒聚集在SPB下方；在减数分裂前期，端粒在那里聚集形成花束。（B–G）减数分裂膜的框架。下面的数字表示从心肌梗死开始的时间（分钟）。在所有图中的所有光学显微镜图像中，比例尺等于5μm。（B–C）查看SPB通过Pcp1-GFP（内源性标记），染色质（Chr）通过Hht1-mRFP（组蛋白H3标记在两种内源性1型遗传性出血性毛细血管扩张症+基因座）。黄色箭头指向未能分离的SPB。查看（D–E）SPB通过内源性标记的Sid4mRFP，γ-TuC通过Alp4-GFP和微管蛋白（Tub）通过体外表达mRFP-Atb2。（D） γ-TuC在整个过程中定位于SPB重量减数分裂(田中等人，2005年). （E） 在bqt1Δ减数分裂，一些SPB缺乏可见的γ-TuC（黄色箭头）。（F–G）上述标签nmt1（纳米1）-控制Ish1-GFP以可视化NE.Inbqt1Δ单元格中，SPB与NE分开（黄色箭头）。另请参见图S1MII核的（H–I）EM。黄色方框被放大到右侧。在SPB附近可见前孢子膜（PSM），证实细胞处于MII中。比例尺表示200 nm。While期间重量SPB插入NE和有核微管（H）中，（I）中的左上SPB未能插入并移位到细胞质中。另请参见图S2.
在我们对减数分裂纺锤体形成的端粒控制的研究中，我们发现，如果中心体-SPB接触取代了缺乏端粒-SPB连接的细胞，则可以成功形成纺锤体(Fennell等人，2015年). 事实上，只有一个端粒的结合(Tomita等人，2013年)或着丝粒(Fennell等人，2015年)带LINC足以确保主轴装配。这共享了端粒和着丝粒的减数分裂纺锤体传递能力，以及在有丝分裂间期SPB下方存在着丝粒-LINC接触(Funabiki等人，1993年)，提出了着丝粒以类似于端粒在减数分裂中的作用的方式调节有丝分裂纺锤体形成的可能性。然而，这种可能性迄今为止还很难解决，因为如果不影响几个变量，就不可能完全破坏间期着丝粒-LINC关联。例如，像Nuf2或Cnp1这样的动粒因子的突变破坏了间期着丝粒-LINC的结合，但也破坏了动粒功能的其他方面，使得不可能归因于数字2或中国核电站1号机组间期着丝粒-LINC连接缺失突变(Asakawa等人，2005年;Takahashi等人，2000年). 其他突变，如LINC相互作用因子Csi1的突变，仅部分破坏SPB下的着丝粒聚集(Hou等人，2012年). 鉴于上述观察结果，即单个着丝粒或端粒与LINC复合体之间的接触足以赋予适当的减数分裂纺锤体形成，染色质LINC结合的破坏可能需要完全，以揭示这种结合在有丝分裂纺锤体形成中的任何作用。
在这里，我们定义了在缺乏减数分裂端粒-LINC接触的细胞中，纺锤体组装途径中的哪些事件受到损害，并明确表明类似过程也将染色体接触与有丝分裂纺锤体形成联系起来。为了研究有丝分裂，我们发现了一种突变，在间期所有着丝粒从正常的LINC结合中释放出来。在这种情况下，在有丝分裂时可以看到类似于束缺陷减数分裂中出现的SPB和纺锤体缺陷。虽然SPB复制在没有端粒或着丝粒LINC接触的情况下进行，但SPB插入NE需要这些接触。我们的观察揭示了染色体在有丝分裂开始时介导NE分解中的积极作用，从而将细胞核内的空间染色体配置与纺锤形核所需的细胞质事件耦合起来。
结果
减数分裂过程中SPB分离需要端粒-LINC接触
为了确定减数分裂中心体周期中需要染色质LINC结合的步骤，我们分析了活细胞中几个SPB组分的动力学重量和花束缺陷(bqt1Δ)细胞，从中心蛋白原Pcp1开始，核心SPB成分招募γ-TuC形成纺锤形核(Fong等人，2010年). Pcp1在减数分裂前期晚期（减数分裂I（MI）前约20分钟）首先出现在一个明显的病灶中，当它与SPB分离成两个清晰的病灶时；减数分裂II（MII）时重复该周期，导致四个Pcp1焦点(). 相反，在没有花束的情况下，重复的SPB往往无法分离(). 事实上，75.5%的bqt1Δ减数分裂缺陷细胞在MI时SPB分离出现问题；其余24.5%显示MI处SPB分离正常，但MII处分离缺陷（n=57）。
SPB分离需要主轴伸长，这会将复制的SPB推开(Lim等人，2009年). 由于γ-TuC在细胞质微管和纺锤体成核中起关键作用(Job等人，2003年)，我们通过监测Alp4（γ-TuC的一个重要成分）来探讨γ-TuC是否被招募到花束不足的SPB中(Vardy和Toda，2000年). Alp4始终定位于SPB重量减数分裂((田中等人，2005年);). 相反，在59%的患者中，Alp4定位有缺陷（即一个或两个SPB信号在心肌梗死发作时缺乏可检测到的Alp4共定位）bqt1Δ从心肌梗死开始，减数分裂细胞（n=100，p<0.01）和所有（n=50，p<0.01）那些不能招募Alp4的SPB都表现出SPB分离问题和纺锤体成核失败(). 因此，花束是γ-TuC募集、纺锤形核和SPB分离所必需的。
SPB复制与端粒-LINC接触无关
由束断裂引发的SPB分离和γ-TuC募集缺陷的背后可能是什么分子变化？Pcp1过度表达导致SPB和纺锤缺陷(Fong等人，2010年;Jin等人，2005年)，增加了与花束接触不足导致SPB成分过度积累的可能性。为了解决这种可能性，我们通过减数分裂对Pcp1-GFP的局灶强度进行了量化。在重量减数分裂细胞，Pcp1强度遵循动态曲线，可分为三个阶段(图S1A). 首先，当花束出现时，Pcp1在前期后期积累(Ohta等人，2012年). 第二阶段开始于MI开始时的肩部，此时花束溶解，SPB复制完成，MI纺锤体形成并分离同源物。肩部阶段之后，对应于第二次减数分裂SPB复制的强度急剧上升。曲线的峰值对应于MII纺锤体形成和姐妹染色单体分离，然后随着减数分裂的结束Pcp1信号减弱(图S1A). 也许令人惊讶的是，Pcp1的动力学类似于重量和bqt1Δ减数分裂(图S1A). 虽然在没有花束的情况下，可以看到肩部和曲线峰值的Pcp1水平有非常轻微的增加，但我们发现Pcp1的轻微过度表达（即达到与bqt1Δ设置）无法提供SPB或主轴缺陷(图S1B).
为了确定Pcp1累积是否反映了整体SPB，我们量化了附加积分成分Sid4、Cut11和Cut12的水平(Bridge等人，1998年;Chang和Gould，2000年;West等人，1998年). 就Pcp1而言，所有三种累积的时间和程度在重量和纺锤缺陷bqt1Δ减数分裂(图S1C-E). 此外，尽管减数分裂动力学存在差异，Pcp1（在心肌梗死发病时显著积累）和Sid4（在心肌梗塞发病前逐渐积累(Ohta等人，2012年))始终在两者中共存重量和b季度1Δ减数分裂细胞(图S1F和S1G). 因此，γ-Tuc募集失败和纺锤体成核bqt1Δ设置不是由于SPB复制失败所致。
有丝分裂SPB复制是一个保守的过程，导致新旧SPB可区分(Flory等人，2002年;Grallert等人，2004年;Pereira等人，2001年;塔拉达等人，2009年). 为了确定在减数分裂过程中是否可以区分新旧SPB，如果可以的话，在没有花束的情况下新旧SPBs是否更容易失败，我们监测了慢折叠DsRed变体（sfRFP，折叠成活性形式需要约11小时）和Pcp1之间融合的荧光。在因氮饥饿而在G1期停滞12小时的细胞中（即具有非重复的SPB），大多数Pcp1sfRFP分子已经正确折叠，并且SPB在G1期发出荧光（−60′和−70′图S1H和S1I）。在随后的减数分裂诱导中，SPB复制，但只有两个SPB中的一个可见通过sfRFP标记，表明在有丝分裂中，减数分裂SPB复制产生可区分的旧SPB（包含预先折叠的Pcp1-sfRFP）和新SPB（包括与Pcp1融合的非Y折叠的sfRFP部分）。在100%的b季度1Δ细胞显示单极纺锤体（n=11），这些纺锤体是从旧SPB中特地成核的(图S1I). 因此，在没有花束的情况下失败的纺锤形核是新SPB特有的。
SPB插入NE需要端粒-LINC触点
我们之前观察到，在减数分裂纺锤体形成之前，SPB有从NE分离的趋势bqt1Δ设置(Fennell等人，2015年;富田和库珀，2007年); 事实上，在分离过程中出现问题的SPB通常会转移到细胞质中(，黄色箭头）。使用定位于整个NE的标记跨膜蛋白Ish1可以清楚地看到SPB与NE的分离(). 如前所示，SPB在两个阶段的整个前期都与NE保持关联重量和bqt1Δ减数分裂细胞。事实上，无论花束形成或失败，SPB在整个马尾运动阶段以及运动停止后约40分钟内仍与NE相关(); 只有在随后的SPB复制之后，SPB才会从网元中移出().
为了更详细地阐明这种表型，我们重量和b季度1Δ细胞进行高压冷冻和冷冻替代，然后进行连续切片和电子显微镜（EM）。代表性图像重量MII细胞显示细胞核两端有两个电子密度SPB(); 在这个阶段，每个SPB都形成了一个清晰可见的原孔膜（PSM，). MII示例bqt1型Δcell显示两个SPB，NE和两个PSM很容易识别，这再次证实了SPB复制发生在没有花束的情况下；此外，两种SPB都保持足够的功能以使PSM成核。然而，两个SPB中的一个明显从NE上移出（位于). 通过在不同倾角下采集图像并进行断层重建，我们确认插入的SPB形成了一个典型的单极纺锤形核，其形态与双极纺锤状核形成对比；后者包括排列重叠的微管，单极纺锤体包括数量过多的以不同角度张开的微管(图S2;电影S1–2). 相反，未能插入的SPB也未能使纺锤体微管成核(图S2;电影S1–2).
在有丝分裂间期导致SPB着丝粒分离的Sad1突变蛋白
从NE开窗和SPB插入的共同需要到LINC染色质接触的共同存在，有丝分裂和减数分裂进程之间有无数相似之处(通过减数分裂前期的端粒或有丝分裂间期的着丝粒），提出了纺锤体形成的染色体控制是否不仅适用于减数分裂，也适用于增殖细胞周期的问题。为了开发一个系统，使LINC复合体的间期着丝粒完全分离，我们生成了一个条件Sad1突变体。我们首先生成了一系列嵌套删除()在Sad1的核质结构域中，并使用该序列鉴定了赋予着丝粒-LINC关联的氨基酸2-60区域(和S3A–E系列). 基于此信息，我们构建了Sad1等位基因库，其中前60个氨基酸随机突变，C末端被GFP标记、替换萨德1+这些等位基因重量背景，并筛选出对温度敏感的生长(). 当我们寻找影响着丝粒与Sad1间期结合的突变而不影响其稳定性或定位时，我们放弃了在25°C或36°C时影响SPB处Sad1强度的突变。这种方法确定了一个Sad1ts秒配子等位基因萨德1.2，包含两个替换：第3位的苏氨酸到丝氨酸，第52位的丝氨酸到脯氨酸。Sad1.2带来的增长与重量允许温度为25°C；然而，生长在36°C时停止(). 该表型与之前确定的ts秒等位基因sad1.1、，它在SUN-domain的323位编码丙氨酸到缬氨酸的替代，并在所有温度下抑制生长(Fennell等人，2015年;Hagan和Yanagida，1995年).
条件等位基因的发育，萨德1.2（A） 示意图萨德1细胞质结构域缺失的等位基因。显示了跨膜结构域（TM）和SUN-domain。每个缺失等位基因被替换sad1型+并被标记为GFP。（B） 显示PCR突变区域（2–60 aa）；另请参见图S3.（C）萨德1.2具有温度敏感性。对数相培养物（0.8×10）的连续稀释（五倍）7细胞/mL），并在富培养基上生长。（D） 在突变的两个位点上消除或模拟磷酸化的靶向突变萨德1.2用于替换重量sad1+如（A）所示。单靠磷酸化不能解释萨德1.2温度敏感性。
单一Thr-3-Ser或Ser-52-Pro替代物无法进行现象学检查萨德1.2(). Ser52以细胞周期依赖的方式磷酸化(Carpy等人，2014年)，增加了这种修饰在细胞周期进展中发挥作用的可能性。然而，由于Ser-52-Ala不能再现Ser-52-Pro与Thr-3-Ser联合作用的效果，仅磷酸化不太可能解释Ser52突变在萨德1.2类似地，T3A与S52P结合无法重新创建萨德1.2表型，以及丙氨酸或谷氨酸在任一位置的各种替代组合仅产生部分生长缺陷，但同时发生的Thr-3-Glu和Ser-52-Ala替代除外(). 因此，虽然受损的Sad1磷酸化可能有助于萨德1.2表型、结构构象改变可能起着重要作用。
根据我们的筛选标准，Sad1.2-GFP在整个相间仍与SPB稳定相关，而Sad1.1-GFP则在36°C下不稳定(). 此外，Sid4和Pcp1在sad1.2与重量设置，在25°C和36°C下(,S4A系列); 因此，LINC和SPB的稳定性在萨德1.2细胞。此外，内部NE蛋白Lem2和Man1在wt与sad1.2的对比36°C时的细胞，表明NE基本上保持不变(图S4B).
在间期，着丝粒与LINC复合体完全分离导致纺锤体断裂（A–C）SPB在萨德1.2限制温度下的电池。（A） 年取消了Csi1本地化2010年11月1日细胞，但在中未改变萨德1.2细胞。在36°C下8小时后，对内源性标记的Csi1-mCherry进行成像。（B–C）有丝分裂间期SPB处的信号强度；每个基因型n=20。误差线=标准偏差。（D） 期间的着丝粒-LINC关联模式萨德1.2相间。中的标记; 着丝粒成像通过内源性标记的Mis6-GFP。（E） 36°C时，总着丝粒-LINC解离逐渐增加。在五个以上的独立实验中，对每种情况下的100个细胞进行评分。SPB复制前开始四帧评分，每10分钟进行一次。平均值用颜色与（D）中定义的类别对应的条显示。p值通过Fisher精确测试确定（****=第页< 0.0001). （F） 在100%具有一个或多个着丝粒-LINC结合的细胞中，可以看到适当的纺锤体形成。相反，总着丝粒-LINC解离完全消除纺锤体形成。41、58和91个细胞的分析wt类,部分和全解离类别，分别来自≥10个独立实验。使用其他动粒标记获得了相同的结果，在≥10个独立实验中再次对数百个细胞进行评分；看见图S4.
的LINC和SPB稳定性sad1.2细胞使我们能够解决着丝粒-LINC聚集缺陷导致这些细胞活性降低的可能性。因此，我们评估了增殖细胞中的着丝粒定位。当所有动粒（Mis6）信号在重量相间，sad1.2即使在允许的温度下，细胞也经常显示出与SPB无关的额外Mis6-GFP病灶。在限制温度下萨德1.2三个着丝粒均与SPB分离的细胞出现(). 为了进一步定义这些表型，我们根据着丝粒相对于间期SPB的位置对细胞进行分类，在SPB复制前40分钟内进行评分：1）wt类其中所有着丝粒都聚集在SPB上；2)部分解离其中至少有一个着丝粒定位于SPB，但其他着丝粒病灶定位于其他地方；和3）全解离其中所有着丝粒焦点都与SPB分离(). 在允许温度（25°C或32°C）下，约80%萨德1.2单元格显示部分解离但没有显示全解离相反，在36°C下4小时后萨德1.2单元格显示全解离36°C下较长的培养时间增加了细胞显示全解离().
有丝分裂间期的着丝粒-LINC结合是纺锤体形成所必需的
如果间期着丝粒-LINC结合在减数分裂纺锤体形成中发挥类似于端粒-LINC结合的有丝分裂作用，总着丝粒分离应类似于完全花束破裂，导致减数分裂纺锤体形成缺陷；相反，即使只有一个着丝粒与SPB结合，也足以促进纺锤体的形成(Fennell等人，2015年). 与每个主轴相关的主轴行为分析萨德1.2分类显示所有细胞显示至少一个间期着丝粒LINC接触(wt类和部分离解类别）形成合适的主轴(;图S4D和S4E)，与我们的观察结果一致，即单个端粒或着丝粒SPB相互作用导致减数分裂纺锤体形成。与此形成鲜明对比的是，100%的萨德1.2包含的单元格总着丝粒分离在纺锤形成的相间故障(和图S4F).
在没有着丝粒-LINC相互作用的情况下，有丝分裂纺锤体在间期形成失败的细节几乎与之前的前期没有端粒/着丝粒-LINC接触的情况下减数分裂纺锤体形成失败的那些细节相同。与花束缺陷减数分裂细胞一样，萨德1.2单元格正在经历总着丝粒分离能够完成正确的SPB复制(). 然而，这些单元在NE插入步骤失败。在重量设置，复制的SPB在主轴形成开始之前插入NE(丁等人，1997年;塔拉达等人，2009年;麦卡利和罗比诺，1971年;田中和神户，1986年)、的SPB萨德1.2细胞显示总着丝粒分离不仅插入失败，而且似乎与NE分离，移入细胞质(,S5B、S5D); 这种行为与在缺乏端粒和着丝粒LINC关联的减数分裂细胞中观察到的行为相同(). 此外，正如花束缺陷性减数分裂所见，SPB在整个细胞分裂间期内都与外NE相关联萨德1.2设置；只有在SPB复制后，当网元应该形成一个允许SPB插入的窗口时，SPB才与网元分离(;图S5B和S5D). 这些观察结果表明NE重构和/或SPB插入开始信号因子的改变，作为控制纺锤体形成的初始着丝粒-LINC接触介导参数。
有丝分裂中SPB插入失败萨德1.2细胞导致纺锤体形成的废除（A–B）36°C下增殖细胞膜的框架；看到SPB通过Sid4-m樱桃，着丝粒通过Ndc80-GFP（Cen）和锭子通过外源性表达mCherry-Atb2(数据采集3启动子控制）。在36°C下生长4小时，导致着丝粒-LINC在萨德1.2设置（B）；随后出现SPB分离缺陷。（C–D）通过Ish1-GFP可视化NE，细胞生长如（A–B）所示。如中所示bqt1Δ减数分裂()，复制的SPB在萨德1.2有丝分裂。数字表明有丝分裂在几分钟内进行；t=0正好在SPB复制之前。（E） 来自六个独立实验的（D）中显示的表型定量。从未观察到SPB从NE卸下重量细胞。n个是得分的单元格总数。另请参见图S5.
我们使用不同标记的动粒蛋白作为着丝粒标记的结果的一致性(图S5F)以及以下事实萨德1.2尽管如此，细胞活力仍能在32°C下保持部分着丝粒分离在约75%的细胞中，证实尽管LINC在萨德1.2设置。同样，着丝粒沉默在部分着丝粒分离来自SPB；请注意全解离场景无法评估，因为它会导致不可告人。因此，将着丝粒定位到SPB对于维持着丝粒周围异染色质是不必要的(图S5G). 相反，组蛋白H3-Lys9（H3-K9）甲基化是异染色质的标志，对于着丝粒接触LINC复合体并形成适当纺锤体的能力来说是必不可少的，因为唯一的H3-K9-甲基转移酶（Clr4）的缺失对这两个变量都没有影响(图S5H(Fennell等人，2015年)). 这一观察回顾了以前的工作，表明虽然着丝粒周围异染色质是必需的建立在着丝粒CenpA和动粒在幼稚序列上的功能中，CenpA与动粒可以是保持无着丝粒周围异染色质的无限期(Folco等人，2008年); 与着丝粒特性本身一样，SPB插入和纺锤体形成的能力独立于H3-K9甲基化。
着丝粒-LINC相互作用和纺锤救援b季度1Δ减数分裂在萨德1.2背景
尽管着丝粒始终与LINC相关重量有丝分裂间期，一旦花束形成，它们就会分裂，核振荡在减数分裂前期开始(Klutstein等人，2015年); 在花束缺陷细胞中，着丝粒也从LINC释放(; (库珀等人，1998年;富田和库珀，2007年)). 这个萨德1.2突变对花束的形成没有影响(); 因此，减数分裂端粒和Sad1之间的间接Bqt1/Bq2介导的连锁需要不同于有丝分裂着丝粒相互作用的Sad1残基。因此，心轴的形成通常发生在萨德1.2减数分裂(). 由于在花束不足的减数分裂中，单个着丝粒经常与SPB偶发性重新结合，因此挽救纺锤体的形成(Fennell等人，2015年)，我们研究了这种着丝粒再结合事件是否被萨德1.2突变。事实上，我们在两种细胞的减数分裂前期都没有观察到着丝粒-SPB的接触sad1.2或bqt1Δsad1.2设置(–). 因此，正常的减数分裂纺锤体形成在b季度1Δ萨德1.2双突变体(). 因此，Sad1–T3和–S52不仅对有丝分裂着丝粒聚集至关重要，而且这些残基还负责偶发的减数分裂前期着丝粒与LINC的相互作用以及相关的解救bqt1Δ主轴故障。
着丝粒-SPB相互作用和纺锤救援b季度1Δ减数分裂细胞在萨德1.2设置（A–E）减数分裂膜的框架；标签和编号，如中所示（F）减数分裂SPB-着丝粒接触被萨德1.2（G）花束缺陷细胞中残余心肌梗死纺锤体的形成被萨德1.2.强制着丝粒-SPB相互作用通过Bqt1-GBP（参见)确保正确的主轴形成。n个=在≥5个独立实验中得分的细胞总数。数据经过Fisher精确测试（****=第页< 0.0001).
强制着丝粒-Sad1.2联合完全挽救纺锤形成
主轴故障与总着丝粒分离强烈建议着丝粒结合的废除是导致萨德1.2-诱发主轴故障。评估这种可能性，尽管可能性不大萨德1.2纺锤体故障源于其他问题（例如Sad1中的缺陷，与着丝粒无关），我们质疑萨德1.2通过将着丝粒重新定位到LINC复合体中，可以改善主轴故障萨德1.2设置。因此，我们利用GFP结合蛋白GBP来募集GFP标记的蛋白质(Rothbauer等人，2006年)至Sad1.2(). 在缺乏Bqt2的减数分裂细胞中，Bqt1仅定位于SPB-相关的Sad1病灶(Chikashige等人，2006年). 因此，Bqt1在缺乏Bqt2的有丝分裂细胞中的表达应导致Bqt1与Sad1结合，使Bqt1-GBP成为GBP-GFP介导的向Sad1募集着丝粒的有效工具；考虑到Sad1.2保留了结合Bqt1/2和形成花束的能力，这种策略似乎特别可行(). 确实，有丝分裂表达的Bqt1-GBP与Sad1在间期共定位().
强制着丝粒-Sad1.2结合确保有丝分裂纺锤体的形成（A） 用于强制Sad1.2和着丝粒之间相互作用的GFP-GBP系统示意图。国家标准41-受控Bqt1-GBP在内生b季度1有丝分裂过程中的位点和诱导；Mis6-GFP用于招募着丝粒通过GBP-GFP互动。（B） （A）所示招聘系统的验证。Bqt1-GB-mCherry定位到SPB（以Sad1.2-Turquoise2可视化）。（C） 总之萨德1.2细胞显示总着丝粒分离（n=13），缺少Bqt1-GBP，主轴在36°C时无法形成。（D） Bqt1-GBP招募Mis6-GFP，并在所有情况下在36°C下恢复纺锤形成（n=56）。（E） 对于（A）中的Bqt1-GBP，Csi1-GBP向SPB招募了Mis6-GFP，恢复了年的纺锤形成萨德1.2在所有情况下，细胞温度均为36°C（n=50）。（F–G）通过强迫着丝粒-近端lacO/I-GFP阵列和SPB之间的相互作用，纺锤体的形成也得以恢复。（H） 中心体-SPB招募定量萨德1.2细胞在36°C下放置8小时。每个病例中有100个细胞被定量。第页通过Fisher精确检验确定的值（**=第页< 0.01). （一） 接触类型对主轴形成的影响sad1.236°C时；n=每个电池30个。（J） 系列稀释分析（如)表明着丝粒异位募集到Sad1.2可以在限制温度下挽救生长。由cenI-lacO/I-GFP导致生存能力的累积挽救不太完整；然而，那些表现出有效招募的细胞一致显示出挽救的纺锤体形成（I）。
在萨德1.2如上所述，含有Mis6-GFP但缺乏有丝分裂Bqt1-GBP的细胞，着丝粒-LINC结合失败导致有丝分裂纺锤体形成失败(). 然而，在这些细胞中诱导表达Bqt1-GBP可以有效地向SPB募集结合着丝粒的Mis6-GFP；尽管转移到非许可温度，但至少有一个着丝粒与相间SPB稳定地相互作用(). 值得注意的是，这种稳定的着丝粒结合挽救了双极纺锤体的形成()和生存能力()在中萨德1.2设置。同样，减数分裂（即内源性表达）Bqt1-GBP在花束缺陷中提供Mis6-GFP介导的着丝粒募集(rap1Δ)萨德1.2减数分裂细胞，赋予适当的减数分裂纺锤体形成().
为了进一步探讨将着丝粒异位靶向Sad1.2的观察结果，Sad1相互作用因子Csi1可以挽救其促进纺锤体形成的能力，其与Sad1的关联不受萨德1.2突变()，与英镑内在融合。如Bqt1-GBP所示，Csi1-GBP促进了着丝粒的高效招募(通过Mis6-GFP）至Sad1.2，挽救纺锤体形成和细胞活力(). 此外，利用不同的着丝粒标记，GFP-Lac阻遏物结合拉科插入着丝粒I附近的数组，也会导致中央情报局至Sad1.2相关Bqt1-GBP()并恢复纺锤体形成和细胞活力(). 因此，Sad1.2给出的主轴故障和寿命损失可直接归因于相间质心-LINC触点的损失。
相间着丝粒-LINC结合在有丝分裂开始时驱动NE分解
由于SPB插入NE需要间期着丝粒LINC接触，这些接触可以控制两个过程中的一个或两个。首先，它们可以控制包括开窗在内的NE重塑过程。其次，他们可以控制插入NE窗所需的SPB修改。因此，一个关键问题是NE开窗是否发生在没有着丝粒-LINC接触的情况下。NE开窗很难用显微镜捕捉，因为它非常快速且短暂(丁等人，1997年;塔拉达等人，2009年). 为了克服这一局限性，我们使用核GFP标记物（NLS-GFP-β-Gal）的流出作为NE开窗的替代物。这种流出是如此短暂，以至于在重量增殖细胞。然而，剪切11.1，编码后生动物Ndc1的分裂酵母直系物中的一个突变，导致SPB插入失败，并在36°C的开窗阶段停滞，延长NLS-GFP-β-Gal从核质中消失并出现在细胞质中的时间至约25分钟(塔拉达等人，2009年;吉田和赛泽，2004年)(). 事实上，虽然NLS-GFP-β-Gal不能通过重量有丝分裂周期，在复制的SPB开始分离后，可以清楚地看到外排剪切11.1设置。相反，萨德1.2在36°C下生长8小时的细胞没有显示NLS-GFP-β-Gal流出的迹象，尽管未能插入重复的SPB(). 值得注意的是，引入了萨德1.2突变强烈地避免了核外排表型剪切11.1单元格(). 此外切割11.1 sad1.2显示核流出的细胞与萨德1.236°C下培养8小时后，细胞出现部分着丝粒分离。值得注意的是，Csi1-GBP/Mis6-GFP系留系统提供的强制着丝粒关联将核流出恢复到切割11.1 sad1.2单元格(图S6). 因此，相间质心-LINC触点对于驱动SPB插入所需的NE拆卸至关重要。
Sad1.2避免了剪切11.1突变（A–D）监测NE渗透率通过每对面板顶行的核NLS-GFP-β-Gal流出。含有Sid4-mCherry（SPB）的细胞在25℃下生长，转移至36℃，8小时后每4分钟成像一次；t=0正好在SPB复制之前。而NLS-GFP-β-Gal从核泄漏剪切11.1单元格，它不在萨德1.2单元格或sad1.2削减11.1细胞，表明在萨德1.2设置。（E） A-D中显示的表型定量。n个=在5个以上独立实验中分析的细胞数。数据经过Fisher精确测试（****=第页< 0.0001). 另请参见图S6.
讨论
NEBD的染色体控制——一种通过精密工具发现的细胞周期调节模块
在这里，我们揭示了一个调控模块，其中间期着丝粒协调细胞质中心体进入细胞核的能力，从而控制纺锤体的形成和细胞周期的进展。从减数分裂到有丝分裂，这个染色体-细胞质协调模块是保守的，关键区别在于减数分裂细胞选择端粒作为染色体接触点，而有丝分裂细胞选择着丝粒。减数分裂细胞在失去前期端粒-LINC接触后完成SPB复制，但复制的SPB既不会插入细胞核，也不会招募γ-TUC使纺锤体成核。同样，缺乏间期着丝粒-LINC接触的有丝分裂细胞会发生SPB复制，但在SPB对插入的阶段，SPB会从NE分离。我们的观察结果是萨德1.2阻止由剪切11.1突变表明NE开窗是需要着丝粒与LINC接触的关键步骤。事实上，我们的数据提出了这样一种可能性，即染色体接触不仅会触发NE开窗所代表的部分NEBD，而且还会触发在每个哺乳动物细胞分裂中看到的完整NEBD。
在完整且适当定位的LINC复合体的背景下，开发一种专门用于中断着丝粒-LINC接触的精确工具，对于描述此类接触的作用至关重要。之间的因果关系总着丝粒分离和萨德1.2致命性不仅通过以下观察得到证明：萨德1.2单元格显示部分着丝粒分离显示重量纺锤体的形成和细胞周期的进展，也通过人工将着丝粒重新束缚到Sad1.2所赋予的挽救的纺锤体的形成和活力。减数分裂端粒花束的形成不受萨德1.2，强调了该等位基因对破坏着丝粒LINC关联的特异性。此外，通过萨德1.2导致减数分裂细胞中缺乏端粒束的完全渗透性纺锤缺陷。完整性sad1.2 bqt1Δ减数分裂表型以及有丝分裂萨德1.2单个突变体外显率，为筛选开辟了新的视野，以充分揭示着丝粒和端粒与NE窗化和纺锤体组装的耦合机制。
NEBD发病和纺锤体激活的控制
虽然控制NEBD发病的途径尚不清楚，但众所周知，像细胞周期依赖性激酶1（CDK1）这样的激酶对该过程很重要。例如，CDK1活性触发了层粘连蛋白和NPC解聚(Guttinger等人，2009年;Heald和McKeon，1990年;Onischenko等人，2005年;Peter等人，1990年). 此外，polo-like激酶PLK1在包括秀丽Caernohabditis elegans(Chase等人，2000年;Rahman等人，2015年)和人类(Lenart等人，2007年). 已知裂变酵母SPB整合了触发有丝分裂的激酶级联的输入；例如，SPB成分Cut12显示了与CDK（Cdc2）的遗传交互网络(Grallert等人，2013年). 虽然这些事件被认为主要是细胞质的，但也有证据表明Cdc2定位于SPB下NE的核表面(Alfa等人，1990年). 在有丝分裂间期，30–40%的Cdc2信号似乎是核信号(Decottignies等人，2001年); 与SPB共定位可以反映细胞质SPB相互作用和/或着丝粒相互作用。此外，在减数分裂前期，Cdc2不仅定位于SPB（Hou H和JPC，未发表的数据），而且定位于分离的着丝粒(Decottignies等人，2001年)，提示在SPB附近定位CDK的染色质机制；这种激酶活性浓度可以促进NE开窗通过NE成分的磷酸化。这些想法正在调查中。
由于双极纺锤体的形成不仅涉及NE开窗，而且还涉及SPB的修饰，使其能够插入纺锤体微管并使其成核，所以在着丝粒-LINC接触破坏后，所有这些过程的失败都可能反映出一种或一系列作用。例如，着丝粒LINC接触可能导致NE开窗和SPB激活中多个玩家的改变。或者，着丝粒-LINC触点可能仅在触发开窗所需的NE重塑事件中起作用，没有该事件，SPB既不能插入也不能接合核γ-TUC以形成纺锤形核。我们观察到，新的SPB比旧的SPB对减数分裂束破坏更敏感(图S1I)乍一看，可能会支持这样的观点，即针对新SPB的直接修改取决于端粒/着丝粒-LINC接触。然而，也可以想象，NE重塑过程在空间上是如此受限，以至于开窗可能发生在旧的SPB下方，而NE在新的SPB下方保持完整，从而阻止其插入。
这个萨德1.2在迄今为止报道的阻止SPB插入和/或双极纺锤体形成的突变中，表型是唯一的。例如，跨膜蛋白Cut11定位于NPC和有丝分裂SPB，有人建议在NE和蛋白性SPB之间生成物理界面(Tamm等人，2011年;West等人，1998年). 在剪切11.1细胞，新的SPB不能使微管成核，导致单极纺锤体形成；此外，当网元崩溃时，此SPB无法正确插入，导致出现网元中断通过EM，核内容物渗入细胞质，SPB在有丝分裂开始时沉入核质。而萨德1.2表型类似于剪切11.1在防止SPB形成纺锤形微管的过程中，从未出现核流出萨德1.2细胞（和花束不足的减数分裂细胞）不会沉入细胞核，而是从NE向外移到细胞质。这种奇怪的行为，只有在SPB复制后才能看到，表明一些开窗前SPB转变或NE重塑事件发生在萨德1.2设置，而其他设置失败，导致连接SPB和外部NE的疏水界面丢失。
我们观察到的核内事件和SPB之间的耦合在观察中有先例，即哺乳动物中心体复制和中心极脱离是由蛋白质控制的，在细胞核内的染色体复制和分离中起着关键作用。特别是，起源识别复合物蛋白与中心体复制的控制有关，而分离酶（负责溶解姐妹染色单体之间的凝聚力的蛋白）与中心粒脱离有关(Hemerly等人，2009年;Prasanth等人，2004年;Schockel等人，2011年;Stuermer等人，2007年;Tsou等人，2009年). 着丝粒、端粒或其他染色体标志物是否控制哺乳动物NEBD的发病尚待确定。事实上，我们的结果强调了在间期研究LINC与特定哺乳动物染色体区域的关联的必要性，因为整合NEBD、纺锤体形成和染色体状态的模块的存在可能是保守的。
实验程序
截顶结构萨德1等位基因与温度敏感性的分离萨德1.2突变体
Sad1的细胞质部分被分为11个亚区（A-K），并构建了每个区域缺失的杂合二倍体菌株。为了产生截断的Sad1等位基因，sad1型+-GFP公司克隆到pFA6a-kanMX6质粒中，并用作QuickChange II XL试剂盒定点突变的模板（安捷伦科技）。使用www.agilent.com/genomics/qcpd使用长扩增模板聚合酶（Roche）扩增Sad1-GFP等位基因。为了查询每个Sad1区域对相间着丝粒-LINC聚类的重要性，我们可视化了着丝粒通过Mis6（内源性标记GFP），SPB通过Sid4（内源性标记mCherry）和外源性表达的微管蛋白（mCherry-Atb2）。使用引物对编码氨基酸2–60的区域进行突变PCR，引物位于萨德1ORF、不平衡dNTP条件（2.5 mM dGTP、0.25 mM dATP、dCTP和dTTP）和Vent DNA聚合酶（NEB）。重量用含有突变的DNA片段转化单倍体细胞萨德1产品，然后在25°C下在YE4S+Kan介质上电镀，然后在36°C下进行复制品电镀。在筛选出的10000个菌落中，对那些在SPB中表现出温度敏感性生长和稳定的Sad1-GFP信号的菌落进行了测序。为了确认这一点萨德1.2利用QuickChange II XL试剂盒定点突变（安捷伦科技公司），产生了Sad1.2突变以及苏氨酸3位和/或丙氨酸52位的替代物。
荧光强度定量
Sad1、Sid4、Cut11、Cut12和Pcp1信号定量是使用Volocity和ImageJ软件对在26个焦平面上以0.35获得的图像进行的μ每个时间点的步长为m。使用SoftWorx（Applied Precision）对图像进行去卷积并合并为2D图像。对于每个时间点，量化包含给定信号的区域的强度，并减去同一单元格内等效无信号区域的强度；并将得到的信号强度归一化为细胞外一个背景像素的平均强度。
