核膜上独特的“安全区”确保异色染色体区域的稳健复制

需要重新提交新实验的要点：

1） 请使用此设置验证Lem2与Man1区域的联合成像定位。这将为东北部特定地区的核心论点增加重要分量。

我们同意Lem2/Man1的同时定位对于完成图片很重要，并将这些数据添加到了新的图1中。这些新数据必须通过传统的DeltaVision成像而不是SIM来捕获，因为我们可以为Man1获得的最亮的放大td-tomato标签提供的SIM信号不足（可能是因为SIM需要固定）。尽管如此，Man1-tdTomato/Lem2-GFP组合通过实时分析很容易看到，这表明Lem2和Man1域明显分离。我们现在已经量化了可视化蛋白质的所有成对组合的共定位（图1-图补充1）。

2） 作者表明，嵌合Man1-GBP-mCherry导致polα定位于核外围。他们没有显示任何特定的端粒或着丝粒移动到Man1微域并离开其各自的Lem2和Bqt4微域。这似乎可行。这将表明，它们实际上迫使特定异染色质结构域重新定位，而不仅仅是本体polα。

我们同意这一观点，并尝试在有无Polα-GFP的Man1-GBP-Cherry环境下观察端粒和着丝粒，但效果有限。标签组合使这个实验变得困难。现在，通过用mTurquoise标记Taz1并在Man1-GBP上使用mCherry标记，我们已经能够进行这个实验了——图6补充图2C-E中显示了具有代表性的图像和结果图。数据清楚地表明，Man1-GBP/Polα-GFP组合将端粒从Man1-贫困地区移动到Man1-富裕地区。正如预期的那样，这种影响是适度的（因为这种重新定位只会短暂发生，而给定的端粒会复制），但意义重大。

3） 图6F：。正确的比较是Polα-GFP/Man1+与Polα-GFP/Man1GBP。根据文本所述，标记为WT的样本似乎是polα+/Man1-GBP。但更可能影响异染色质的标签是Polα-GFP；Polα最初在pombe中被鉴定为swi7，因为它的突变破坏了交配类型的转换（Singh和Klar，1993年，PMID 8423854），后来被确认为杂色抑制因子（Nakayama和Grewal，2001年，PMID11387218）。我在论文中找不到描述这种swi7-GFP等位基因的PEV测试（Natsume at al 2008 PMID 18493607）。对着丝粒转录物进行简单的RTPCR，表明它们在swi7-GFP菌株中没有上调，这足以排除标签产生影响的可能性。

其他更费力但也更令人信服的可能性是PEV检测（在otr或imr中使用ura4+报告子）或H3K9me2 ChIP。然而，如果这些备选方案需要两个多月才能完成，那么它们对论文来说就不是必需的了。

好的一点——我们已经通过评估Polα-GFP标签对国际货币兑换着丝粒区域（插入尿酸4+标记被静音）。结果非常清楚地表明，标记对在国际货币兑换，如新的图6补充图1所示。

4） 未对图5补充图1A进行正确控制。他们省略了重量GFP-Bqt4。

谢谢你抓住这个。我们用wt GFP-Bqt4重复了实验，并在图5的补充图1中给出了新数据。GFP-Bqt4挽救了MMS敏感性bqt4Δ而不是HU敏感性，这表明GFP-Bqt4是一种部分低形态。这令人惊讶，因为Hiraoka实验室发现，虽然Bqt4上的C末端标记废除了功能，但我们使用的N末端标记的Bqt5没有赋予表型。我们现在修改了材料和方法部分，以反映HU敏感性，并删除了HU的ΔTM数据。

接下来，我列出了评论员提到的一些问题和要求，这些问题和要求可以通过编辑更改轻松解决。换言之，我们预计这些观点不会有更多的实验证据，但希望手稿文本会进行调整，以反映所提出的问题：

1） 所有三位评论员都认为，讨论进行得太久，失去了影响力。他们认为，整个手稿和讨论过于集中于复制/转录冲突的概念，而这一概念并未得到广泛的实验检验。鉴于获得此类冲突的直接实验证据可能不合理地耗费大量劳动力和时间，他们建议相应地减少讨论，并缩短整个讨论时间。

我们同意。我们大大缩短了讨论时间，并试图精简和澄清。

2） 一些地方将受益于更好的定量描述：

-FRET分析中Bqt4依赖的Lem2扩散

Lem2 FRAP数据在图3C中进行了量化，但请注意，FRAP不能在弱于外围（即非SPB-相邻）Lem2信号的信号上执行。因此，我们对量化围绕外围的传播并不自信，更愿意坚持对此进行定性描述（希望我没有误解你的观点）。

-在“Bqt4在复制时特异性地系留端粒和mat位点”小节的第一段中，据说Taz1–Bqt5相互作用优于Taz1-Lem2。Bqt4-Taz1共定位应进行量化，如图4-图补充1B中Mis6和Lem2所示。

我们在新的图3G中量化了这些共定位。

3） 为什么Telo1L与Taz1（也绘制端粒）的不同行为/定位。比较：图4C早期/中期S：NE定位WT与bqt4-的显著下降：图4D早期/中期S:NE定位WP与bqt4-的无差异。

感谢您要求我们澄清这一点。Tel1L标记（位于草皮2+基因座）与端粒的距离超过50kb，并且可能比实际的端粒（Taz1与之结合）更早复制。我们在文本中对此进行了澄清。

4） 图5-图补充1A：尽管文中提到，但没有显示MMS面板。

我们对此表示歉意–我们已经修复了它（请参见上文第4点）。

5） 图7G没有比例尺，因此很难与图6F进行比较。

我们已经添加了比例值。

6） 没有图9（模型），但在讨论中进行了讨论。评论员实际上希望看到这一数字包括在内。

我们对这个遗漏表示歉意。我们已经添加了为原稿准备的模型图（图9）。

7） 在SPB下，着丝粒与Lem2斑点共定位（图4A）。中心周围异染色质（Cen3周围跨越100kb）通常位于巨大的Lem2斑点之外（图4补充图1C）。我认为作者暗示着中心周围异染色质与Lem2的微域相互作用，而这些微域与巨大的Lem2斑点不同。这似乎与以下句子不一致：“在该区域可检测到的Lem2的强烈焦点（图4A）与ChIP实验一致，该实验显示Lem2和着丝粒周围异染色质之间的相互作用（Barrales等人，2016；Tange等人，2016）。”此外，我认为Barrales和Tange的论文显示了Lem2与CenpA染色质的关联，但没有显示更广泛的中心周围异染色质。

在Barrales等人的论文中，Lem2被确定为国际货币兑换区域，但也显示在森德格更远端的重复；Lem2对沉默的影响很小。Tange论文还显示，在这两种情况下，H3K9me2都减少了差分/差分重复和imr:：ura4在没有Lem2的情况下。同时，这两篇论文都显示Lem2特别与中心核结合。我们的工作与这些观察结果一致，显示了Lem2在中央核CenpA负荷中的作用（独立于Bqt4依赖的Lem2从SPB的动员），以及可能由瞬态（S期）介导的对中心周围沉默的适度影响Lem2-着丝粒周围的联系没有被之前论文的ChIP实验发现。我们将句子改为“与ChIP实验一致，该实验显示Lem2和着丝粒之间存在相互作用”

8） “我们的显微镜显示了着丝粒核心和中心周围区域的独特定位模式，着丝粒中心与SPB下方的Lem2共定位，而中心周围与非SPB相邻的Lem2共同定位。”据我所知，作者从未显示过这一点。他们在图4补充图1C中显示，着丝粒周围不在SPB。他们没有显示该染色质邻接非SPB相邻的Lem2。

我们修改了文本，以澄清近着丝粒和非SPB-localized Lem2之间的共定位概念是一种推断，而不是结果。

9） “Bqt4在复制过程中特异性地系留端粒和垫位点”小节第四段中对细胞周期的描述会让不熟悉pombe的读者感到困惑。让广大读者都能接触到这一描述。

我们简化了这一描述。

10） 这只是一个小评论，但实际上非常重要。自始至终，作者都提到了H3K9me。然而，他们的实验是用抗H3K9me2的抗体进行的。他们应该明确这一点，因为虽然H3K9me2仍然是异染色质形成和RNAi活性的良好指示器，但最近描述的H3K9 me2和H3K9-me3之间存在明显的功能差异（Jih等人，2017年，Moazed实验室PMID 28682306）。

我们修改了文本，将“H3K9me”用于我们共同指代me2和me3的实例，而将H3K9 me2指定用于使用相应抗体的实验。在最初的简介中，我们指定H3K9me同时指me2和me3。

11） 在整个过程中，显微镜图像没有尺寸条。

我们在整个过程中添加了比例尺。

12） 自始至终，大多数比较都没有进行统计分析。这可能会影响一些结论的解释，如图4C和D所示。在bqt4D中，S早期/中期与S晚期/G2的端粒外周定位是否显著？Bqt4D与WT在S早期/中期是否显著？

感谢您对此进行标记–我们已将相关的p值添加到图4和统计表（图4表补充1）中。

13） 图5——图补充1A。GFP-bqt4+菌株对HU不敏感吗？这将排除GFP标签对Bqt4的影响。

请参见上文第4点。我们的新实验表明绿色荧光蛋白-bqt4+对MMS不敏感，但对HU轻度敏感。

14） “Bqt4和Lem2微环境调节端粒和着丝粒异染色质”小节，第四段末尾：中心周围H3K9me数据显示在图7中的图补遗1C中，而不是1A。

谢谢–已修复。

15） 图8B，在“在没有Dcr1的情况下，Lem2和Bqt4对生存能力至关重要”小节中，第一段：Lem2+删除大大降低了cen1-1-ts的生存能力。我在本图或补充图中找不到lem1D/cen1-1/pnmt41-AMS和cen1-1/pmmt41-AMS的数据。

感谢您促使我们澄清这一点。我们无法获得双突变体lem2 cnp1-1细胞；只有当Ams2过度表达时，这种突变组合才能生长。我们修改了文本来解释这一点。

16） “[…]在HU或MMS中造成额外麻烦”。虽然我很欣赏口语表达，但这太模糊了。请更具体地说明作者提出MMS或HU与bqt4Δ结合会导致无法维持的情况。DNA修复途径是否被加剧的内源性复制应激（以bqt4Δ计）和外源性因子（HU/MMS）引起的应激所淹没？

我们修改了这段文字，以表明有暂停复制倾向的重复区域（可能是由于放松时虚假的二级结构形成）更容易受到HU和MMS带来的复制压力的影响。这可能是由于未缠绕区域的寿命延长，如审查者所建议的那样，DNA修复机制不堪重负，或者由于重复序列已经停滞的分叉塌陷。

17） 导言，第三段。这里请引用Castel等人，2014，这是一个显示Dcr1从tDNA和rDNA中释放RNAPol II的证据。

完成。我们从一开始就打算将Castel等人包括在内，谢谢您的理解。