Phosphorylation of Swi6/HP1 regulates transcriptional gene silencing at heterochromatin

doi:10.1101/gad.1708009

.2009年1月1日；23(1):18-23.

doi:10.1101/gad.1708009。

Swi6/HP1磷酸化调节异染色质处转录基因沉默

岛田松司¹, Kohei Dohke公司, 马希托·萨达伊, Kaori Shinmyozu公司, 中山俊一, 武士天郎, 村上春树

附属公司

PMID： 19136623
预防性维修识别码：项目经理2632169
内政部： 10.1101/编号1708009

Swi6/HP1磷酸化调节异染色质处转录基因沉默

岛田松司等。基因开发. 2009.

.2009年1月1日；23(1):18-23.

doi:10.1101/gad.1708009。

作者

岛田松司¹, Kohei Dohke公司, 马希托·萨代, Kaori Shinmyozu公司, 中山俊一, 武士天郎, 村上春树

附属

¹日本京都606-8507京都京都大学病毒研究所细胞生物学系信号转导实验室。

PMID： 19136623
预防性维修识别码：项目经理2632169
内政部： 10.1101/编号1708009

摘要

异染色质蛋白1（HP1）为异染色素的多种功能招募各种效应器，但其调控尚不清楚。在裂变酵母中，HP1同源物Swi6招募SHREC、Epe1和凝集素，它们分别参与转录基因沉默（TGS）、转录激活和姐妹染色单体内聚。我们发现酪蛋白激酶II（CK2）磷酸化了Swi6。CK2依赖性Swi6磷酸化的缺失减轻了异染色质TGS，但不影响异染色质结构。这是由于SHREC对异染色质的招募受到抑制，同时Epe1增加。有趣的是，磷酸化的丧失并没有影响凝聚力。这些结果表明，CK2依赖性Swi6磷酸化特异性控制异染色质中的TGS。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
Ckb1突变体在异色TGS中表现出缺陷，但在异染色质结构中没有缺陷。(A类)的示意图*imr｜ura4*和*otrŞade6型*用于沉默试验的1号染色体。异色ncRNA(*dh公司*for）和扩增PCR片段的位置(*dg223型*)也被指示。(B类)着丝粒异染色质沉默*ckb1Δ*菌株和其他异色突变体。插入异染色质中的标记基因被H3K9-me/Swi6依赖的异染色素抑制，导致低腺嘌呤板上形成红色集落（抑制*ade6*)和对FOA的抵抗（抑制*尿酸4*)在野生型细胞中。沉默的中断导致了突变细胞中白色或粉红色的集落形成和FOA敏感性。(C类)着丝粒重复序列的异染色质结构(*dg223型*)并插入标记基因(*imr｜ura4*)在所示菌株中，通过使用带有二甲基H3K9和Swi6抗体的ChIP分析法测量H3K9me和Swi6。目标位点的相对富集(*dg223型*或*imr｜ura4*)常色区信号(*行为1*和*乌拉4DS/E*minigene）标准化为WCE（全细胞提取）信号，并显示*在下面*每条车道。注意，凝胶上装载了大量样品，用于H3K9me的ChIP分析*clr4Δ*单元格和Swi6 inΔswi6单元格位于*dg223型*便于量化。(D类)Ckb1在交配位点异染色质形成的Atf1通路中发挥作用。H3K9me在*尿酸4*插入交配位点的基因(*Kint2｜ura4*)通过ChIP分析对指示菌株进行分析。相对富集度*Kint2｜ura4*对抗常染色*乌拉4DS/E*显示了*在下面*每条车道作为A类.

**图2。**
CK2在体内外磷酸化Swi6。(A类)细胞提取物由野生型、，*ckb1Δ*、和*或5-19*细胞在指定的温度下生长。*或5-19*是CK2催化亚基（Cka1）的一个突变体，表现出对温度敏感的CK2活性（Snell和Nurse 1994）。通过Western blotting分析提取物中的Swi6蛋白。(B类)将野生型细胞提取物中的Swi6免疫沉淀液与CIP或不与CIP孵育。在指定位置添加磷酸酶抑制剂。反应混合物用SDS-PAGE分离，Swi6用Western blotting检测。(C类)细菌产生的Swi6或去磷酸化α-酪蛋白与从所示菌株中免疫沉淀的含有CK2的标记Cka1孵育。未标记Cka1的细胞的免疫沉淀物用作对照。用SDS-PAGE分析反应产物。放射自显影和考马斯亮蓝（CBB）染色检测Swi6和α-酪蛋白。(D类)Cka1从表达有或无Flag-tag的Cka1的细胞中免疫沉淀。Western blotting检测沉淀的Flag-Cka1和Swi6。

**图3。**
Swi6的假定CK2磷酸化位点突变显示磷酸化和异色沉默缺陷。(A类)Swi6的结构示意图以及在每个突变体中假定的CK2磷酸化位点（S-X-X-D/E）引入的突变的位置。将丝氨酸（S）到丙氨酸（A）的氨基酸替换引入基因组*瑞士文6*通过PCR介导的突变和同源重组获得基因（见补充材料）。(B类)所示菌株提取物中Swi6的Western blotting分析。(C类)如图1B所示，分析所示菌株的异色沉默。

**图4。**
Swi6的CK2磷酸化位点突变体显示出与*ckb1Δ*细胞。(A类)标记基因生成的转录水平(*otríade6*和*imr｜ura4*)和着丝粒非编码RNA(*dh公司*在有或无RT的情况下，使用从指示菌株制备的总RNA，通过RT-PCR对指示菌株中的for）进行分析。*行为1*RNA作为对照进行分析。(B类)着丝粒重复序列的异染色质结构(*dg223型*)和插入的标记基因(*imr｜ura4*)通过使用ChIP分析法测量H3K9me和Swi6水平，对指示菌株中的H3K9进行分析。RNAPII水平*imr｜ura4*也进行了分析。目标位点信号的相对富集(*dg223型*或*imr｜ura4*)相对于常色区域(*行为1*和*乌拉4DS/E*)标准化为WCE（全细胞提取）信号并显示*在下面*每条车道。注意，凝胶上装载了大量样品，用于ChIP分析*clr4Δ*单元格位于*dg223型*便于量化。

**图5。**
CK2依赖性Swi6磷酸化调节效应器与异染色质的结合。(A类)通过ChIP分析检测了沉默复合物SHREC的成分Clr3和Mit1在指示菌株中的着丝粒重复序列上的定位。标记的标志*三氯乙烷*将基因或Myc-tagged Mit1导入每个菌株，并使用抗Flag或抗Myc抗体进行ChIP分析。目标轨迹信号相对富集(*dg223型*)相对于常色区(*行为1*)标准化为WCE（全细胞提取）信号，并显示*在下面*每条车道。(B类)Epe1和Rad21在着丝粒重复序列上的定位(*dg223型*)通过ChIP测定进行分析。ChIP分析使用标记Epe1或myc的Rad21。目标轨迹信号相对富集(*dg223型*)相对于常色区域(*行为1*)标准化为WCE（全细胞提取）信号，并显示*在下面*每条车道。(C类)Swi6（和Chp2）的CK2依赖性磷酸化对效应器（SHREC、Epe1和Rad21）与异染色质关联的影响模型。野生型细胞中过度磷酸化状态的影响(顶部面板），低磷酸化状态的影响*ckb1Δ*细胞或磷酸化位点突变体的影响*瑞士文6*和*信道2*(底部面板）。有关详细信息，请参阅文本。

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1. Bernard P.、Maure J.F.、Partridge J.F.，Genier S.、Javerzat J.P.、Allshire R.C.着丝粒内聚异染色质的要求。科学。2001;294:2539–2542.-公共医学

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