第16页^INK4a公司报告小鼠揭示环境毒物的增龄作用

摘要

介绍

小鼠模型对识别致癌物至关重要。例如，商用型号（即BigBlue、MutaMouse和第53页^+/–应变；参考文献。1–三)代表了癌症毒理学的核心工具。这些试剂提高了致癌物鉴定的效率和灵敏度，同时降低了动物的需求和成本。1987年，马丁提出了老年人的概念(4)：加速分子老化的环境因素，类似于致癌物促进肿瘤形成。虽然用于致癌物检测的小鼠模型已经很先进，但尚不存在用于老年激素检测的体内工具。

哺乳动物衰老是复杂的，不同的分子过程导致与年龄相关的组织功能障碍。虽然没有单一过程支持衰老，但几条证据表明衰老激活是一个重要因素。随着人类和小鼠年龄的增长，细胞衰老的标志物显著增加，包括第16页^INK4a公司抑癌基因(5–8). 此外，激活第16页^INK4a公司衰老与神经干细胞的复制功能减退有关(9)、造血祖细胞(10)，淋巴细胞(11，12)和胰腺β细胞(13). 延缓衰老的调节改变CDKN2a/b公司编码p16的基因座^INK4a公司，第15页^墨水4b和ARF与衰老表型有关，包括动脉粥样硬化疾病、II型糖尿病、青光眼和几种恶性肿瘤(14). 最后，控制体内衰老细胞数量的药理学和遗传学方法可以改善与年龄相关的表型，如肌肉减少、驼背、T淋巴细胞和胰腺β细胞复制不足(15–17). 在这里，我们试图确定第16页^INK4a公司，使用最近描述的第16页^LUC公司报告基因(18)，可以有效评估环境因素的老年效应。

结果和讨论

这个第16页^LUC公司敲入小鼠外显子1α的萤火虫荧光素酶的等位基因特征Cdkn2a型基因座(18)，表达受内源性第16页^INK4a公司启动子和远程顺式-监管要素(19，20). 重要的是，第16页^INK4a公司在幼年小鼠健康细胞中的表达可以忽略不计，但随着年龄增长的压力，其表达在每个细胞的基础上增加了300倍以上(7，18). 大的动态范围第16页^INK4a公司表情使第16页^LUC公司一种有价值的衰老诱导体内成像工具。为了评估候选老年人——高脂肪饮食（HFD）、紫外线、砷和香烟烟雾（CS）——对衰老的影响，我们进行了系列分析第16页^LUC公司队列。

肥胖和HFD对第16页^INK4a公司体内表达的结果并不一致。据报道，HFD会增加衰老和/或第16页^INK4a公司血管细胞中的表达(21，22)，而第16页^INK4a公司人类外周血T淋巴细胞（PBTLs）mRNA表达与体重指数（肥胖标志物）无关(8). 研究HFD对大鼠全身衰老的影响第16页^LUC公司从8-10周龄开始，将小鼠置于42%脂肪的HFD或4%脂肪的正常饮食（ND）中18个月。HFD喂养产生了明显的药效学效应，导致体重显著增加和肝脂肪变性，但总体存活率没有差异（补充图1，a-C；本文在线提供补充材料；doi:2017年10月17日/JCI70960DS1). 与以前的报告一致(7，18)，我们观察到第16页^INK4a公司随年龄增长而表达；然而，通过全身荧光素酶成像（TBLI）评估的增加率在队列之间没有差异（图​（图1，1、A和B）。由于喂食HFD的小鼠体重增加幅度较大，我们分析了52周时体重与荧光素酶强度之间的关系，未观察到相关性（补充图1D）。相应地第16页^INK4a公司喂食HFD和ND的18个月龄小鼠的肝脏和脾脏中的mRNA没有改变（补充图1E）。这些数据表明HFD不会加速第16页^INK4a公司体内表达，至少在萤光素酶检测的灵敏度范围内。

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图1

HFD不增加第16页^INK4a公司表达，而砷适度增加第16页^INK4a公司表达式。

第16页^LUC公司老鼠是(一个和B类)馈电ND或HFD或(C类和D类)暴露于0或50ppm的砷。(一个和C类)荧光素酶强度，归一化为第0天整个队列的平均荧光素素酶水平，并绘制为时间函数。曝光持续时间由x个轴。误差条表示SEM。P（P）通过线性回归分析确定数值。(B类和D类)代表性TBLI实验一个和C类分别是。

砷是一种与人类衰老相关表型相关的环境毒物（即几种癌症、II型糖尿病和动脉粥样硬化；参考文献。23). 虽然砷不是一种直接的断裂原，但它可能间接影响DNA的损伤和修复(24–26). 我们研究了慢性砷暴露对第16页^INK4a公司向窝友施用0或50ppm砷在体内的表达第16页^LUC公司小鼠从8-10周龄开始在饮用水中放置12个月。暴露48周后，经砷处理的小鼠表现出明显的肝脏蓄积（补充图2A）。与砷的已知影响一致(27)，治疗后的小鼠显示出结构紊乱的小胰岛，胰岛总质量急剧下降（补充图2，B和C）。队列之间的总生存率没有差异（补充图2D）。适度但显著增加第16页^INK4a公司使用TBLI在暴露24周后观察表达(P（P）= 0.023; 图​图1，1、C和D）。此外第16页^INK4a公司给药50 ppm与0 ppm的1岁小鼠的脾脏中的mRNA较高，但肝脏中没有（补充图2E）。这些数据表明慢性砷暴露适度加速了第16页^INK4a公司-表达细胞。

CS促进DNA损伤(28，29)以及与年龄相关的疾病，如肺气肿、动脉粥样硬化和几种癌症(30，31). 人类慢性CS暴露与增加第16页^INK4a公司PBTLs中的表达(8，32). 为了确定适度CS暴露对体内细胞衰老的影响第16页^LUC公司小鼠每天暴露于CS或环境空气（AA）1小时，每周暴露5天，从10-12周龄开始持续6个月。暴露6个月后，进一步观察到1岁以下的小鼠没有CS。研究结束时，CS-暴露小鼠鼻窦腔的组织学分析显示，沿鼻乳头上皮层有微粒沉积，而在此烟草剂量下，CS和AA组之间的肺结构没有差异（图​（图2A），2A） ，这也与加速死亡率无关（补充图3A）。显著增加第16页^INK4a公司根据TBLI的测量，CS和AA队列之间的诱导在CS暴露的几周内很容易被发现，并且在CS停止后持续存在（图​（图2B）。2B） ●●●●。与鼻腔和肺部的组织学检查一致（图​（图2A），2A） ，在小鼠的头部和颈部观察到荧光素酶的诱导，但胸部和腹部没有（图​（图2C）。2C） 。相应地，第16页^INK4a公司CS和AA暴露小鼠的肝脏、肺、腋窝淋巴结和脾脏中的mRNA水平相似（补充图3B）。这些数据表明，低剂量CS暴露会加速衰老细胞在暴露程度最高的组织（即鼻上皮）中的积累。

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图2

CS增加第16页^INK4a公司表达式。第16页^LUC公司小鼠暴露于CS或AA。

(一个)54周后，上鼻窦腔（顶部）、气道细支气管（中部；气道上皮栓细胞突出显示）和肺泡囊（底部）。箭头表示沿着上皮层的颗粒沉积区域。原始放大倍数，×40，×280（插图）。(B类)荧光素酶强度，归一化为第0天整个队列的平均荧光素素酶水平，并绘制为时间函数。曝光持续时间由x个轴。误差条表示SEM。P（P）通过线性回归分析确定值。(C类)代表性TBLI实验B类.

长期接触UVB会导致光老化和皮肤癌(33，34). 为了直接评估慢性中波紫外线是否在体内诱导衰老第16页^LUC公司小鼠暴露于350焦耳/米²从10-12周龄开始，每周3次紫外线照射，持续6个月。在没有UVB的情况下，对Littermate对照小鼠进行同期老化。暴露6个月后，观察到小鼠在1岁之前没有进一步的UVB暴露。与未暴露组相比，暴露于紫外线的小鼠在暴露6个月后出现角化过度、化生以及真皮和皮下的炎症浸润（图​（图3A）。三A） ●●●●。紫外线暴露小鼠的上皮细胞中DNA损伤标记物磷酸化H2AX显著增加（图​（图3A三A和补充图4A），表明存在持续的DNA损伤反应。此外，紫外线暴露小鼠在暴露5个月内发生皮肤肿瘤，这加速了死亡率（图​（图3，三、B和C）。荧光素酶的表达在第16页^LUC公司在可见肿瘤发生之前，接受紫外线治疗的动物比未暴露的对照组大，并且在暴露32周后，接受紫外线处理的动物的TBLI几乎是未暴露对照组的8倍（图​（图3D）。三D） ●●●●。与TBLI结果一致（图​（图3E），三E） ，第16页^INK4a公司两组腹部和背部皮肤的mRNA水平证实了特异性位点诱导第16页^INK4a公司表达式（图​（图3F）。三F） ●●●●。此外，紫外线照射后的背部皮肤比相同小鼠未照射的腹部皮肤表现出更高的表达（图​（图3三F） ●●●●。

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图3

UVB增加第16页^INK4a公司表达式。第16页^LUC公司小鼠暴露于0 J/m²(n个=13）或350焦耳/米²(n个=11）UVB光。

(一个)H&E或磷-H2AX染色皮肤的典型组织病理学图像。原始放大倍数，×20（顶部），×40（中部和底部），×200（顶部，插图），×120（中部和下部，插图）。(B类)典型的背部图像。(C类)Kaplan-Meier生存曲线。曝光持续时间由x个轴。P（P）数值通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验确定。(D类)荧光素酶强度，在第0天归一化为整个队列的平均水平，并作为时间的函数绘制图表。曝光持续时间由x个轴。插图突出了最初20周的接触。误差条表示SEM。P（P）通过线性回归分析确定值。(E类)代表性TBLI实验D类. (F类–H（H）)定量实时PCR第16页^INK4a公司(F类),Cxcl1公司(G公司)、和伊尔6(H（H）)牺牲时背部和腹部皮肤的表达。误差条表示SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.005，学生的t吨测试。

为了加强第16页^INK4a公司通过衰老诱导，分析紫外线暴露和未暴露皮肤中的其他标记物，包括衰老相关（SA）细胞因子的mRNACxcl1公司和伊尔6β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色。Cxcl1公司和伊尔6与未暴露于紫外线的小鼠相比，紫外线暴露小鼠的表达增加。此外，仅在直接暴露于紫外线的皮肤（背部）中表达增加，而在相同动物的未暴露皮肤（腹部）中没有表达增加（图​（图3，三、G和H）。我们观察到类似的SA-β-半乳糖染色模式（补充图4B）。这些数据表明，紫外线引起的慢性DNA损伤加速了衰老细胞的积累。

在这里，我们证明了这一点第16页^LUC公司小鼠可以检测到环境暴露的延缓衰老作用。直接DNA损伤剂（CS和UV光）似乎具有潜在的老年性，而砷暴露产生的影响较小，但很显著。我们还确定了这些药物的解剖学致老作用，包括被动吸入CS对鼻上皮的作用比肺实质更强（图​（图2C）2C） 以及UVB对暴露皮肤而非未暴露皮肤的影响（图​（图3，三、E和F）。

这个系统有一些重要的局限性。首先，尽管荧光素酶成像比光学方法敏感得多第16页^LUC公司等位基因可能对检测深层器官或罕见细胞亚型的衰老作用不大。因此，虽然我们没有观察到HFD对TBLI的影响，但HFD可能会激活重要细胞室（例如胰腺β细胞，参考文献。35; 和血管细胞，参考文献。21，22)，但没有达到使用此系统可检测到的水平。类似地，虽然我们发现老年诱导的第16页^INK4a公司表达发生在衰老细胞附近的空间，我们还没有明确证明第16页^INK4a公司-表达细胞在所有情况下都会衰老。最后第16页^LUC公司等位基因不能用于识别第16页^INK4a公司-独立的老年人或衰老过程。

总之，我们使用适度规模的连续分析动物队列证明第16页^LUC公司等位基因报告了体内衰老标记的激活，并揭示了环境毒物的致老作用。该资源可以补充用于毒理学评估的其他啮齿动物平台；具体来说，它代表了一个体内系统，用于评估化合物的增龄活性。我们相信，这一资源将为理解环境暴露与分子老化之间的关系提供一个重要工具。

方法

有关更多信息，请参阅补充方法。

无毛SKH1-E第16页^LUC公司/+所有实验均使用小鼠(18). 如前所述进行基因分型(18). 组织学分析中，组织用10%福尔马林固定过夜，然后转移到70%乙醇中进行石蜡封闭和染色。定量TaqMan RT-PCR检测策略第16页^INK4a公司如前所述执行(7，13).

补充材料

致谢

脚注

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